骨髓间充质干细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的研究

目的体外分离培养人新鲜脐血（UCB）造血干细胞（HSC），利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合以扩增脐血造血干／祖细胞。方法采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离UCBHSC，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子，检测脐血造血干／祖细胞总有核细胞（NC）总数和CD34^＋细胞数。结果有核细胞总数扩增（75．2±15．0）倍，CD34^＋细胞数扩增（18．7±12．3）倍。结论体外HSC培养，加入骨髓间充质干细胞和细胞因子对造血干／祖细胞增殖有明显的作用。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

人脐血来源的树突状细胞体外培养、扩增及鉴定

目的 探讨人脐血来源的树突状细胞(dendritie cells,DC)的体外培养、增殖情况。方法 无菌条件下常规采集脐血,用密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,贴壁培养2小时,去除非贴壁细胞,将获得的单个核细胞分为两组,试验组在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白介素-4(IL-4)+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的培养液中培养,在体外诱导分化为DC,对照组不加上述细胞因子。在DC发育过程中,在光镜下连续观察DC生长情况,流式细胞仪(FACS Calibur.BD公司)检测细胞表型。结果 正常体外培养的DC在第四天由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞,随着培养时间的延长,此类细胞数量增多,第八天为形态不规则的毛刺状并聚集成簇,为典型DC形态。FACS显示培养成熟的细胞高表达DC相对特异性标志CD1a,共刺激分子CD80、黏附分子CD54、高表达MHCⅡ类分子,提示DC提高共刺激功能和黏附功能。结论 人脐血经GM-CSF(50ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+TNF-α(50ng/ml)体外培养,能诱导出成熟DC。     

关于改良差速贴壁法原代培养大型成年哺乳动物绵羊肌源性干细胞的研究

目的探讨改良差速贴壁法原代培养成年大型哺乳类动物绵羊肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSC)的可行性。方法改良差速贴壁法分离培养原代绵羊MDSC,并通过免疫荧光检测及western blotting法检测干细胞抗原-1(stem cell antigen,Sca-1),Desmin及CD 34表达情况。Western blotting法检测贴壁细胞(pp)1~pp6的Desmin表达情况来反应纯化情况。结果利用改良差速贴壁法可以成功分离培养出绵羊MDSC,该干细胞Sca-1,Desmin及CD 34表达均阳性,贴壁慢的细胞Desmin表达增高,在pp6中表达最高。结论改良差速贴壁法可以成功分离培养原代绵羊MDSC,且可扩增至20代。     

体外诱导月经血间充质干细胞分化为成肌细胞

目的探讨月经血间充质干细胞在体外可否分化为成肌细胞。方法提取并用10%FBS的DMEM培养液培养人月经血间充质干细胞和SD大鼠的肌卫星细胞;诱导组用肌卫星细胞培养的上清液和5-氮杂胞甙对月经血间充质干细胞进行诱导,对照组用10%FBS的DMEM培养液培养细胞;诱导后,用免疫荧光和RT-PCR方法检测成肌细胞标记蛋白Pax7蛋白和mRNA的表达。结果经免疫荧光检测,诱导组细胞Pax7阳性率为80.36%,与对照组比较,具有统计学意义(F=15.237,P=0.000 1);经RT-PCR检测,诱导组与对照组比较,Pax7基因呈现具有统计学意义的阳性表达(F=14.339,P=0.000 1)。结论月经血间充质干细胞在体外可分化为成肌细胞。     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

[目的]建立分离纯化、培养、扩增骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)鉴定的方法.[方法]采用密度梯度离心及贴壁培养相结合的方法分离、培养、扩增MSCs,并用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD44、CD105. [结果]培养48 h后即可见呈集落生长的细胞,72 h后可见少量贴壁MSCs细胞,7 d后贴壁细胞明显增多,梭形栅栏样分布,融合度达70%以上.第3代原代培养细胞表面标志CD44+、CD105+在95%左右,CD34的表达率甚低.[结论]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,可以获得纯度较高的骨髓MSCs     

负载乳腺癌抗原的脐血树突细胞外泌体抗肿瘤免疫作用

目的:探讨负载乳腺癌抗原的人脐带血树突状细胞(DCs)分泌的外泌体的抗肿瘤免疫效应。方法:提取新鲜脐血单个核细胞,体外诱导分化为DCs,提取乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原,并冲击脐血DCs,加入LPS诱导其成熟,利用流式细胞仪检测表型;超速离心法收获负载抗原的脐血DC外泌体;MTT法检测外泌体诱导的T淋巴细胞增殖反应及其激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:脐血DC表面标志CD34、CD80、CD86、CD11c阳性细胞数与新鲜脐血单个核细胞相比明显增加(P<0.05);Western-Blot结果显示,负载乳腺癌的脐血DC外泌体携带有MHC-Ⅱ类、CD40、CD80、CD86分子;成熟脐血DC组及负载乳腺癌抗原脐血DC外泌体对同种异体来源的T细胞均有明显促增殖作用;负载乳腺癌抗原的脐血DC及其外泌体激活的CTL均能对乳腺癌细胞MCF-7产生显著地杀伤作用(P<0.05)。且在效靶比100∶1时,外泌体的杀伤作用高于负载抗原的脐血DC(P<0.05)。结论:负载乳腺癌抗原脐血DC分泌大量外泌体,可促进同种异体T细胞增殖,并能诱导特异性抗乳腺癌的免疫效应。     

NF-kB活性抑制对人外周血树突细胞功能及Ⅰ型糖尿病治疗的影响

目的:研究体外定向诱导培养Ⅰ型糖尿病患者外周血单核来源树突状细胞表面标记(CD83、CD80、CD86)及细胞因子的分泌,及其抑制树突状细胞中核转录因子kB(NF-kB)活性的变化,探讨其在Ⅰ型糖尿病发病机制中的作用。方法:糖尿病患者20名随机分为IDM组和ODN组各10名,无偿献血员对照组(N组)10名。每组外周血中分离出单个核细胞(PBMC),加入IL-4、GM-CSF对DC进行诱导培养,同时向ODN组中加入NF-kB特异性低脱氧核苷酸(ODN)培养细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记CD83、CD80、CD86的水平,ELISA方法检测培养上清液中IL-12的水平。结果:培养物上清液IL-12水平的测定结果为:N组和ODN组IL-12水平显著低于IDM组(P0.05);N组和ODN组IL-12水平无显著差异(P0.05)。DC表面标志的测定显示,在N组和ODN组中的CD83、CD80、CD86显著地低于IDM组(P0.05);N组和ODN组CD83、CD80、CD86无显著差异(P0.05)。结论:Ⅰ型糖尿病患者DC细胞成熟增强而功能异常,与DC中的NF-kB活性增强有关。ODN可以抑制Ⅰ型糖尿病患者DC中NF-kB活性,减少共刺激分子的表达和IL-12的分泌。     

人脐血间充质干细胞移植联合mNGF治疗脑瘫大鼠的实验研究

目的研究经侧脑室内注入人脐血间充质干细胞(hUCB-MSCs)联合鼠神经生长因子(mNGF)对脑瘫大鼠治疗效果。方法采集足月新生儿脐带血100ml,分离、培养、纯化人脐血间充质干细胞并进行检测和鉴定。将七日龄SD大鼠100只随机分为正常组10只、实验组(缺血缺氧性脑瘫模型)90只,实验组随机分为5组:脑瘫模型组(CP组)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)移植组、mNGF移植组、hUCB-MSCs移植组及hUCB-MSCs联合mNGF移植组。造模成功后1周,将hUCB-MSCs、mNGF分别注入左侧侧脑室,假移植组注射PBS液,移植后第1周、2周、3周,观察5溴-2脱氧尿核苷(BrdU)标记的脐血MSCs的存活、迁移,移植后第4周,对每组大鼠的神经行为学能力进行评估并检测大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达及观察脑组织的形态学变化。结果 1)人脐血MSCs主要分布在左侧侧脑室、额叶、顶叶皮质及白质,随时间进展,向四周脑组织转移,Brdu、NSE、GFAP阳性细胞逐渐减少,差异有统计学意义(P0.05);2)行为学评价:与模型组及假移植组比较,单移植组、联合移植组的足印潜伏期、迷宫逃避潜伏期缩短,足印重复间距及后足滑脱次数减小,联合移植组优于单移植组,差异有统计学意义(P0.05);3)HE染色:MSCs和mNGF单移植组大鼠细胞形态及脑组织结构破坏较脑瘫组有所改善;联合移植组恢复情况更好,细胞形态恢复较单移植组好。结论外源性脐血MSCs联合mNGF经侧脑室移植,可改善脑瘫大鼠的远期行为及脑损害。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

LPSp对HBV宫内感染脐血单个核细胞分泌IL-4、IFN-γ及TLR4表达的影响

目的:观察不同浓度LPSp对HBV宫内感染孕妇的脐血单个核细胞分泌IL-4、IFN-γ及细胞表面TLR4表达的影响。方法:选择外周血HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性且脐血HBV-DNA阳性孕妇25例为试验组,根据加入LPSp的不同分为:无LPSp组、LPSp 1μg/L组、LPSp 10μg/L组、LPSp 100μg/L组;以外周血HBV标志物为阴性的正常分娩孕妇20例为对照组。分离CBMC并培养,采用ELISA法检测培养上清液中的IFN-γ、IL-4的浓度,用流式细胞仪检测CBMC表面TLR4表达。结果:①LPSp各组中IFN-γ、IL-4水平与无LPSp组比较差异均有统计学意义(P<0.01),IFN-γ水平与LPSp浓度呈正相关(r=0.778),IL-4水平与LPSp浓度呈负相关(r=-0.927)。②TLR4表达与IFN-γ水平呈正相关(P<0.05),TLR4与IL-4呈负相关(P<0.05);TLR4表达水平与LPSp浓度呈正相关(r=0.754)。结论:不同浓度的LPSp可能通过影响TLR4信号传导通路诱导CBMC分泌不同细胞因子,选择性调控Th1/Th2型应答。