Expression of rat brain-derived neurotrophic factor in COS-7 cells following its eukaryotic expression vector construction

目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.     

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建抗人HBsAg单链抗体基因，并分析其在COS—7细胞中的表达。方法：以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增其轻、重链可变区(VL、VH)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(C1y4Ser)3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L—VH—Linker—Vl结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体pEGFP—N3，并转染COS—7细胞进行表达。结果：经测序表明，前导肽、连接肽、VL及Vh的序列正确。酶切鉴定证实，成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS—7细胞后，通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后，进行SDS—PAGE及westem blot分析，可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实，所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论：成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因，并可在COS—7细胞中分泌性表达。     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

人颗粒酶B融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用

目的 观察颗粒酶B（granzyme B)融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用。方法 用RT－PCR法获取人granzyme B全长cDNA，经重组PCR将活性型序列的5′端与一段PE转膜肽序列融合。将所获重组基因克隆入绿色荧光蛋白（GFP）共表达载体pIRES2-EGFP,转染HeLa细胞。用免疫组化染色法检测目的蛋白的表达，荧光显微镜和电镜观察转染细胞的形态和结构。结果 成功地获得了野生型granzyme B cDNA及其融合蛋白基因，并构建了融合蛋白基因与GFP基因共表达的真核载体。转染HeLa细胞后，检测到目的蛋白的表达。荧光显微镜观察转染细胞有两种变化：一种表现为体积增大并常伴随多核现象；另一种出现细胞质和细胞核的固缩。电镜观察显示，多核巨细胞生长状态良好，固缩的小细胞则呈现凋亡的典型特征。结论 granzyme B融合蛋白在HeLa细胞中异位表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现多核的大细胞和核固缩的小细胞。     

SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的：克隆表达SARS-CoV S1蛋白，构建SARS基因疫苗。方法：从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1蛋白的编码序列，将该序列克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western blot检测S1蛋白的表达。结果:PCR方法扩增出2000bp左右的基因片段，插入pVAXl构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为SARS-CoV Tor2株S1蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoV S1蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的Id2真核表达载体构建

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体，为骨骼肌的组织工程研究提供有效的分子工具。方法：利用RT-PCR的方法扩增出Id2全长cDNA，利用T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接，构建克隆载体，经限制性内切酶EcoR1酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGF-C2真核表达载体，构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2，经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性；并通过细胞转染技术将Id2基因导入L6成肌细胞中。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段，获取了转染外源性Id2基因的L6细胞。结论：我们成功构建了同时携带有G418筛选位点和增强绿色荧光蛋白的Id2真核表达载体？     

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。     

人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达

目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础.方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc 片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18 质粒载体上.然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A 真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体.经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达.结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50 μg/1×106细胞.结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA 基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据.     

人4IgB7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获得人4IgB7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用,采用PCR技术分别从pMD18-T/4IgB7-H3和pMD18-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出人4IgB7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因,通过RT-PCR技术插入逆转录病毒载体pGEZ-Term,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体经脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清反复感染L929细胞,利用Zeocin筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞。基因转染细胞经无血清培养后,收集的上清用Dot blot检测,超滤浓缩并经Protein G柱纯化,再用SDS-PAGE、Western blot鉴定。以4IgB7-H3-Fc蛋白检测活化T细胞表面未知受体的表达,通过MTT方法分析4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用。结果显示,成功地构建了pEGZ-Term/4IgB7-H3-Fc重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc蛋白的L929基因转染细胞株;纯化后的4IgB7-H3-Fc蛋白能够与活化T细胞表面结合,并对T细胞有显著的促增殖作用。为探讨人4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用和寻找其未知受体奠定良好的物质基础。     

DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能。方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1R cDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建。将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位。结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建。Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达。结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达。     

人ICOS基因转染细胞对抗体产生的影响

利用RT-PCR方法从扁桃体中激活的T细胞,mRNA中扩增出ICOS cDNA,继而将ICOS基因插入到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共同转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清转染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达ICOS蛋白的L929细胞株;经RT-PCR、流式细胞仪表型检测证实L929基因转染细胞能稳定表达人ICOS蛋白。利用ICOS和CD40L基因转染细胞联合IL-10以及PWM驱动的B细胞体外培养系统,分析了ICOS在B细胞生长及抗体产生中的作用,实验结果表明,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长以及协同IL-10增加IgG的分泌。     

大鼠少突胶质细胞转录因子2基因真核表达载体的构建

背景：碱性螺旋-环-螺旋转录因子少突胶质细胞转录因子2在脊髓的少突胶质细胞的分化过程中起着关键性的作用。 目的：构建大鼠少突胶质细胞转录因子2基因重组真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达。 方法：从新生大鼠脊髓组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后将少突胶质细胞转录因子2 cDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接。将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-Olig2以脂质体法转染至COS-7细胞中,反转录PCR鉴定少突胶质细胞转录因子2 mRNA的表达,免疫印迹法检测少突胶质细胞转录因子2蛋白质表达水平。 结果与结论：克隆了少突胶质细胞转录因子2 的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-Olig2,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;转染72 h时免疫印迹分析显示,COS-7/pEGFP-N1-Olig2实验组COS-7细胞表达Olig2-GFP融合蛋白。提示实验成功构建pEGFP-N1-Olig2真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆人类泛素水解酶22(ubiquitin-specific processing enzyme 22,USP22)基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体.方法 利用RT-PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP-N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布.结果 测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEGFP-USP22构建无误,质粒转染后有80 %左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布.结论 成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础.     

NT-3基因逆转录病毒表达载体的构建

目的:分离大鼠神经营养素-3(NT-3)基因, 构建pLEGFP-NT3逆转录病毒表达载体.方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠NT-3基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-C1中, 通过Lipofectamine 2000导入包装细胞PA317.结果:RT-PCR产物为776 bp, 经测序鉴定虽与GenBank中NT-3基因的序列相差1个碱基, 但不影响NT-3蛋白质的表达;构建的pLEGFP-NT3重组载体经酶切鉴定,证实NT-3基因片段正确插入pLEGFP-C1载体中.转染包装细胞后, 激光共聚焦显微镜下观察导入NT-3基因的PA317细胞发绿色荧光.结论:分离得到了大鼠NT-3基因成功构建了pLEGFP-NT3表达载体.     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受。推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用。目的:构建大鼠Delta1基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上。利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达。结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的HindIII和XbaI双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Delta1送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确。转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Delta1的表达显著增高。实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白。     

小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达

目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平.方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,'Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平.结果:经SOE法拼接获得的融合基因与CenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepal-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化.结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β.     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建及转染神经干细胞的研究

应用基因重组技术将大鼠GDNF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,经酶切及PCR对重组质粒进行鉴定.将重组体包装到PA317细胞中,并感染增殖旺盛的大鼠神经干细胞,通过免疫细胞化学、RT-PCR和western-blot等方法鉴定转染效率.结果显示GDNF cDNA正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,该真核细胞表达载体成功转染增殖旺盛的神经干细胞并有效表达.因此本研究成功构建了GDNF真核细胞表达载体,并成功转染到神经干细胞中.为移植替代和基因治疗神经系统疾病提供了实验基础.     

携带mIL-12基因逆转录病毒载体的构建与表达

目的：构建携带小鼠IL-12（ mouse IL-12, mIL-12）基因逆转录病毒表达载体pLXmIL-12SN并检测其在B16F10细胞中的表达。 方法： 应用限制性内切酶从载体pGCp35-IRES-p40SN中酶切p35-IRES-p40（mIL-12基因片段）及将逆转录病毒载体pLXSN切开，通过连接酶连接，通过序列测定确定p35-IRES-p40基因片段正向插入载体pLXSN中的重组子，将阳性重组子转染B16F10细胞并通过RT-PCR方法检测mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结果： 成功地构建表达载体pLXmIL-12SN并可在mRNA水平检测到mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结论： 载体pLXmIL-12SN的构建成功及可在B16F10细胞中表达，为mIL-12基因治疗眼部疾病的研究奠定了基础和提供了借鉴。     

重组分泌型人CREG/myc-His融合糖蛋白的表达及功能分析

目的：构建人E1A激活基因阻遏子（Human cellular repressor of E1A-stimulated gene，hCREG）基因的真核表达载体并转染人293F细胞株，筛选稳定转染细胞克隆，鉴定重组的分泌型hCREG／myc．His融合蛋白的糖基修饰和生物学功能。方法：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA4myc．His／hCREG真核表达载体；Lipofeetamine2000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆，去血清法诱导重组蛋白表达；应用Westernblot方法鉴定分泌型hCREG／myc-His融合蛋白的表达，糖苷酶法及Westernblot行hCREG／myc-His融合蛋白的糖基化分析；用流式细胞周期分析分泌型hCREG／myc．His融合蛋白对体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞（HITASY）增殖能力的影响。结果：RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREGeDNA片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切构建了pcDNA4myc．His／hCREG真核表达载体，酶切及测序结果证实构建的重组质粒正确；Westernblot证实转染pcDNA4myc．His／hCREG的293F细胞克隆可以稳定表达并分泌hCREG／myc-His融合蛋白；糖苷酶分析证实分泌型hCREG／myc-His融合蛋白是糖基化蛋白；流式细胞周期分析证实与正常培养HITASY细胞比较，添加含有分泌型hCREG／myc-His糖蛋白上清的H1TASY细胞出现明显的G1期细胞周期阻滞现象（58．88％vs62．89％，P〈0．005）。结论：构建了pcDNA4myc-His／hCREG真核表达载体并表达了具有生物学功能的分泌型重组hCREG／myc-His糖蛋白。