腹腔途径时脂质体和糖化多聚赖氨酸对外源基因肝脏靶向导入性能的比较

目的　比较脂质体和糖化多聚赖氨酸经腹腔途径时对目的基因肝脏靶向定位效果的影响。方法　将真核细胞表达质粒分别与脂质体和糖化多聚赖氨酸偶联 ,经腹腔注射导入大鼠体内 ,通过原位杂交和免疫组化的方法观察目的基因在肝脏和其他脏器的分布表达。结果　经脂质体或糖化多聚赖氨酸包埋的质粒DNA导入体内2 4h后均见明显表达 ,1周后逐渐下降 ,3周时仍有表达 ;均以肝脏为主要分布器官 ,但用糖化多聚赖氨酸包埋的质粒在肝脏中的分布表达高于使用脂质体的包埋 ,在其他脏器中的分布表达低于使用脂质体的包埋。结论　腹腔途径时糖化多聚赖氨酸对DNA的肝脏靶向定位效果优于脂质体。     

不同转染方式对GFP表达质粒在小鼠肝脏的表达影响

目的 研究经流体力学注射、门静脉和腹腔常规注射3种不同途径注射GFP表达质粒后,目的基因在小鼠肝脏的表达情况及其转基因效率.方法 将裸质粒或脂质体包裹的质粒DNA分别应用流体力学注射、门静脉及腹腔常规注射法注入同种异体小鼠体内,48h后分别取血和肝组织,通过荧光显微镜观察3种转染途径对质粒DNA在小鼠肝脏的表达影响.结果 流体力学注射组及门静脉常规注射组均可见大量绿色荧光蛋白表达,两组的荧光表达量差异无统计学意义(P>0.05),腹腔注射组小鼠的肝脏仅见少量的绿色荧光表达,但3组内脂质体/质粒DNA复合物组绿色荧光表达量均明显高于裸质粒组(P<0.05).结论 应用流体力学注射及门静脉常规注射脂质体/质粒DNA复合物途径,目的基因均在小鼠肝脏高效表达,两种途径无明显差异,流体力学注射可广泛用于肝靶向性的活体基因转染.     

腹腔途径对脂质体和糖化多聚赖氨酸对外源基因肝脏靶向导 …

目的 比较脂质体和糖化多聚赖氨酸经腹腔途径时对目的基因肝脏靶向定位效果的影响。方法 将真核细胞表达质粒分别与脂质体和糖化多聚赖氨酸偶联，经腹腔注射导入大鼠体内，通过原位杂交和免疫组化的方法观察目的基因在肝脏和其他脏器的分布表达。     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.     

肝细胞核因子3β调控小鼠体内HBV转录和复制的实验研究

目的 应用复制型HBV小鼠模型观察肝细胞核因子3β(HNF3β)对小鼠体内HBV转录和复制的调控作用.方法 通过尾静脉高压注射法将复制型HBV重组质粒pHBV4.1和大鼠HNF3β表达质粒pCMVHNF3β导入小鼠体内,用Northern吸印杂交检测小鼠肝组织中HBV 3.5kb、2.4/2.1kb、0.7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平.结果 经小鼠尾静脉高压注射法体内转染质粒pHBV4.1后,小鼠肝组织中检测到HBV 3.5kb、2.4/2.1kbmRNA转录信号和HBV DNA复制中间体信号;与共转染pHBV4.1和空载质粒pCMVpA对照组相比,共转染pHBV4.1和pCMVHNF3β使HNF3β过量表达,明显降低了小鼠体内HBV RNA转录和DNA复制水平.结论 肝富集转录因子HNF3β对小鼠体内HBV转录和复制具有抑制作用,有可能成为今后抗HBV生物治疗新的靶点.     

pEgr-angiostatin基因辐射诱导表达特性及其抗肿瘤作用

目的 :检测 p Egr- angiostatin重组质粒在 B1 6细胞中的辐射诱导表达和观察 p Egr-angiostatin基因 -放射治疗的抗肿瘤作用。方法 :用 RT- PCR方法从小鼠肝脏中扩增出 angiostatinc DNA,经测序证实后 ,构建 p Egr- angiostatin重组质粒 ,脂质体介导的转染法转染小鼠 B1 6细胞 ,检测 B1 6细胞内 angiostatin m RNA的辐射诱导表达 ,体内观察 p Egr- angiostatin基因 -放射治疗的抑瘤作用。结果 :测序表明扩增的 angiostatin c DNA序列与报道基本一致 ,Egr- 1启动子和 angiostatinc DNA正确插入表达载体 pc DNA3.1 ,转染 B1 6细胞内 angiostatin m RNA的表达具有辐射诱导特性 ,p Egr- angiostatin基因 -放射治疗荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用。结论 :成功地克隆小鼠angiostatin基因 ,并证实 p Egr- angiostatin的辐射诱导表达规律及其基因 -放射治疗的抗肿瘤作用     

辐照对水流动力学注射介导的小鼠体内基因表达的影响

目的探寻辐照对水流动力学注射（HGT）介导的荧光素酶报告基因在小鼠体内的表达影响,从而评估水流动力学注射方法在小鼠造血干细胞移植模型中应用的有效性。方法将实验鼠分为辐照组和非辐照组,尾静脉大体积快速注射带有荧光素酶报告基因的真核表达质粒PGL3-luc。于注射后6h腹腔注射荧光素酶底物,并通过活体动物体内光学成像系统检测基因表达的初始水平。将辐照组小鼠进行700c Gy非清髓性全身照射,并于水流动力学注射后12、24、48、72、96、120 h通过活体动物体内光学成像系统对两实验组小鼠体内目的基因的表达水平进行监测。结果通过尾静脉进行水流动力学注射的PGL3-luc质粒在注射后6h于小鼠肝脏大量表达,其平均表达水平为（3739±924.8）相对荧光单位（RLU）/（sec·mg）蛋白。在各个时间监测点辐照组与非辐照组相比实验鼠体内基因表达水平差异均有统计学意义（均P〉0.05）,其表达水平均于水流动力学注射72 h后显著降低。结论小鼠移植前的辐照预处理对水流动力学注射介导的基因在小鼠体内的表达并无影响,该种新型基因转移表达方法可以有效地应用于小鼠造血干细胞移植模型中。     

小鼠肝脏导入HBx基因诱导MIG的表达

目的将HBx基因转入小鼠肝组织并探讨体内HBx对MIG表达的影响。方法携带HBx的质粒和空载体质粒分别与去唾液酸蛋白体内转染系统(in vivo-jetPEI-Gal system)孵育,形成去唾液酸蛋白受体-聚乙烯亚胺-DNA复合物。将复合物经尾静脉高压注射入小鼠体内,2d后处死小鼠摘取肝脏,采用RT-PCR、免疫组织化学、Western blot法分别检测HBx和MIG的表达。结果空白组和阴性对照组小鼠肝组织无HBx表达,实验组RT-PCR测mRNA表达结果为(1.416±0.025),免疫组化法测定HBx蛋白表达阳性面积率为(35.741±2.245)%,Western blot法检测蛋白表达为(1.357±0.031)(P<0.01)。MIG mRNA在空白组、阴性对照组、实验组中的表达分别为(0.106±0.036)、(0.112±0.027)、(0.238±0.051);免疫组化显示MIG蛋白阳性表达面积分别是(10.157±0.841)%、(11.234±0.627)%、(24.568±3.246)%;Western blot检测结果显示MIG蛋白表达分别为(0.149±0.053)、(0.156±0.042)、(0.349±0.087)。MIG mRNA和蛋白在实验组表达均明显高于空白组和阴性对照组(均P<0.05)。结论去唾液酸蛋白与携带HBx质粒形成去唾液酸-聚乙烯亚胺-DNA复合物,通过尾静脉高压注射法可高效地将HBx基因转入小鼠肝脏组织。而且,转入的HBx基因能有效诱导MIG mRNA和蛋白表达。     

精原干细胞体内转染途径建立rsP3111转基因小鼠的可行性研究

目的构建目的基因rsp3111与荧光蛋白融合表达的质粒,并且实现目的基因在体外受精胚胎及在体附睾成熟精子中表达。为进一步通过精原干细胞体内转染途径建rsp3111转基因小鼠奠定基础。方法将rsp3111基因以Xholl和BdmHI酶切后插入经同样酶切处理的真核细胞表达质粒pDsRed-Monomer—N1中,重组质粒为pDsRed-Monomer—N1-rSP3111。采用共培养和脂质体介导方法将ICR小鼠精子与pDsRed-Monomer—N1-rSP3111质粒共孵育,再与成熟的卵母细胞体外受精;或用脂质体介导睾丸直接注射法,将pDsRed-Monomer—N1-rSP3111导入小鼠睾丸中,通过PCR及荧光显微镜观察体外受精后的受精卵及体内睾丸转染rsp3111基因后附睾精子中是否有外源rsp3111基因的表达。结果PCR结果表明,rsp3111基因成功地转入了附睾精子及受精卵中。荧光检测结果表明,目的基因rsp3111在体外受精胚胎及睾丸的曲细精管中均有表达。结论通过雄性生殖细胞载体法实现了大鼠配子特异性蛋白rSP3111在小鼠受精卵及睾丸、附睾精子中的表选为进一步通过精原干细胞体内转染途径建立rsp3111转基因小鼠奠定了基础。     

HGF质粒尾静脉注射促使体内高表达

目的:采用质粒尾静脉快速输注以获得肝细胞生长因子(HGF)小鼠体内高表达.方法:扩增HGF质粒,并酶切鉴定.将不同剂量的HGF质粒通过尾静脉快速注入6～8周龄的非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内,ELISA法检测外周血中HGF水平,同时Western法检测小鼠肝组织内HGF蛋白含量.结果:快速注入HGF质粒后,体内HGF水平明显上升,以20 μg/1.6 ml剂量组最高.注射后4 h即可见到HGF水平明显上升,12 h达到顶峰,然后逐渐下降,但6天后仍可测到较高水平的HGF.Western结果显示注射后肝组织中HGF表达量迅速上升,峰值在第8 h左右出现,而后逐步下降.结论:HGF质粒尾静脉快速注射可使小鼠体内HGF高表达.     

经鼠中心静脉途径注射重组腺病毒的基因转染效率及靶向性

目的：探讨经中心静脉途径注射外源基因在大鼠体内不同组织的表达及靶向性。 方法:将重组腺病毒AdLacZ经中心静脉途径导入SD大鼠体内,以X-gal染色法检测腺病毒介导的标识基因（LacZ）在大鼠体内的表达部位和时间。结果:注射AdLacZ（1×109pfu/mL）后1d,大鼠肺、肝、肾、脾组织即有少量表达。3d后大鼠肺、肝、肾、脾组织LacZ基因表达明显,7d时达高峰,14d开始下降,28d基本消失。肺组织,第3,7,14,21d,LacZ基因明显高于其他组织（P<0.05）,脑组织始终未见表达。结论:腺病毒携带的外源基因,经中心静脉途径给药,可能是肺、肝、肾等疾病基因治疗的有效途径,尤其适用于肺部疾病的基因治疗。     

小鼠尾静脉注射与心肌注射腺病毒载体转染效率的比较

目的比较小鼠尾静脉注射或心肌注射腺病毒载体后心脏组织和肝脏组织中靶基因的转染效率。方法构建表达绿色荧光蛋白GFP的腺病毒载体(GFP-Ad)。C57BL/6小鼠20只随机分为尾静脉注射腺病毒载体组与心肌注射腺病毒载体组各10只,用实时定量PCR检测不同时间点小鼠心肌组织和肝脏组织中GFP的mRNA表达水平,并且通过荧光显微镜观察GFP荧光表达情况。结果心肌注射腺病毒载体组心脏组织中GFP的mRNA表达水平明显高于尾静脉注射腺病毒载体组,心肌注射腺病毒载体组心脏组织中荧光强度明显增强。同时,我们发现两组的肝脏组织中GFP的mRNA表达水平和荧光强度均明显高于心脏组织中;且在尾静脉注射腺病毒载体组,肝脏组织中GFP的mRNA表达水平和荧光强度在7 d达高峰,而心肌注射腺病毒载体组则在3 d达高峰。结论提高心脏组织中靶基因的转染效率宜采用心肌注射腺病毒载体的方法;对于肝脏组织转染效率,两种注射方法均可,鉴于尾静脉注射腺病毒载体的方法创伤小,宜采用。     

乙型肝炎急性感染小鼠模型的建立

目的 通过尾静脉注射感染性小鼠血清的方法 建立一种简单复制乙型肝炎急性感染的小鼠模型.方法 收集通过水压法复制第3天的小鼠血清,使用不同剂量尾静脉注射感染同系小鼠.分别在不同的时间阶段检测血清中的HBsAg和HBeAg,肝组织中的HBcAg和血清中HBV的DNA.结果 注射0.1 ml血清的感染组的检测结果 均高于0.2 ml组.结论 通过注射感染血清可以成功地复制急性小鼠感染模型.该模型复制方法 中,感染的结果 与注射感染血清的剂量无关.     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

电脉冲介导基因转移效率的实验研究

目的　研究电脉冲介导的基因转移效率及其最佳的基因转移的电脉冲参数。方法　用微量注射器将pcD2/LacZ质粒10μg,在昆明小鼠的股四头肌注射,1～2min内在注射部位给予不同参数的电脉冲刺激(不同的电脉冲参数每组10只小鼠),然后进行β-半乳糖苷酶活性的测定或酶组织化学染色。同时设空白对照组及单纯注射组。结果　电脉冲可明显增加LacZ基因的表达,电脉冲组的β-半乳糖苷酶活性（131.6U/mg±86.5U/mg蛋白）是单纯注射组（4.9U/mg±1.0U/mg蛋白）的30倍（P<0.05）。组织化学染色结果表明电脉冲组肌肉组织中β-半乳糖苷酶蓝色颗粒的数目和染色的程度均明显高于单纯肌肉注射组。当电脉冲参数电压200V/cm,波宽40ms,脉冲次数6次和频率1Hz时,可获得最高的基因表达效率。结论　在最佳的电脉冲参数条件下,电脉冲介导的基因转移可获得较高的基因表达。     

腺病毒携带的LacZ基因静脉注射后在大鼠体内的表达

目的 :探讨周围静脉注射的腺病毒载体介导的外源基因在体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X -gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β- gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞三种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 1 0 1 1 pfu/kg剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β -半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。 结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径 ,而对心脑血管疾病不适合。