4000/TLX真核表达载体的构建及其转染真皮多能干细胞的实验研究(英文自译）

背景：研究表明含核受体基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因。 目的：拟构建含核受体真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,并筛选出能稳定表达含核受体的真皮多能干细胞。 设计、时间及地点：细胞基因学实验,于2007-03/12在解放军第三军医大学基础医学部病原生物学教研室完成。 材料：成年SD大鼠1只,由解放军第三军医大学实验动物研究所提供;真皮多能干细胞由解放军第三军医大学全军复合伤研究所分离培养;质粒载体pEGFPN1及细菌DH5α由徐文岳教授惠赠。 方法：首先以大鼠的大脑组织总RNA为模板,RT-PCR扩增出含核受体的编码cDNA序列,T/A克隆至pMDl8-T载体上,然后用BamHI、HindⅢ双酶切释放出经测序鉴定为阳性的重组质粒pMDl8-T-TLX中的含核受体片段,亚克隆到真核载体pEGFPN1中,从而构建真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,最后采用阳性脂质体将pEGFPN1-TLX转染到真皮多能干细胞中。 主要观察指标：转染后24 h荧光显微镜下观察绿色荧光,RT-PCR检测含核受体mRNA的表达,免疫组化染色观察向神经细胞的分化情况。 结果：PCR、酶切和测序结果证明,成功地将含核受体全长cDNA克隆到pEGFPN1质粒中,并成功构建pEGFPN1-TLX重组质粒。与未转染真皮多能干细胞相比,10 d后可见pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞继续生长,并于15 d时形成抗性克隆,荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;而未转染的真皮多能干细胞10 d时已全部死亡。RT-PCR结果显示,pEGFPN1-TLX转染真皮多能干细胞表达TLX mRNA。诱导后3 d与单纯真皮多能干细胞比较,pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞诱导成NF200阳性细胞数明显增加,诱导成GFAP阳性细胞数明显减少。 结论：实验成功构建含核受体真核表达载体,并成功转染了真皮多能干细胞。转染后能明显提高真皮多能干细胞向神经元分化的效率,而向胶质细胞分化受到抑制。     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景：基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand, sTRAIL)抗瘤的生物特性，克隆sTRAIL基因，构建其真核表达载体，为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。 目的：构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，并转染真皮干细胞，以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。 方法：采用RT-PCR二步法，以人胎盘组织总RNA为模板，扩增sTRAIL的cDNA序列，将其克隆入pMD18-T载体，随后亚克隆入载体pEGFP-N1中，构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，以Fugene 6转染技术，将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。 结果与结论：克隆到sTRAIL基因的cDNA序列，成功构建了其真核表达载体，该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板，用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。     

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及大鼠胚胎神经干细胞转染的研究

目的 探讨携带GDNF基因的神经干细胞表达载体的构建方法。方法 采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA，并克隆到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中，经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-GDNF作进一步鉴定。采用阳离子脂质体将重组质粒pEGFP-GDNF转染至鼠胚胎神经干细胞。结果 大鼠GD-NF cDNA已正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C1中，而构建成重组大鼠质粒pEGFP-GDNF，GDNF基因在细胞中可稳定表达。结论 神经干细胞可直接作为基因靶细胞，能被GDNF真核细胞表达载体pEGFP-GDNF有效的感染。     

野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因Ⅱ亚型真核表达载体的构建及其功能

目的构建野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因（NF2）Ⅱ亚型的真核表达载体，观察其在人胚胎肾细胞293（HEK293）中的表达并检测其转染神经鞘瘤细胞（RT4）后的功能。方法以人胎脑cDNA文库中的NF2Ⅱ亚型基因为模板．应用聚合酶链反应技术扩增野生型NF2Ⅱ亚型基因，并定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1质粒中：经鉴定正确的重组质粒pEGFP-NF2Ⅱ亚型，用Lipofectamine2000脂质体导人人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Western Blotting法观察基因表达水平：随后转染大鼠神经鞘瘤细胞．利用水溶性四氮唑法观察野生型NF2Ⅱ亚型基因对大鼠神经鞘瘤细胞增殖的影响。结果经序列分析证实，克隆的NF2Ⅱ亚型基因与Genebank中的序列完全一致。DNA琼脂糖凝胶电泳检测显示，经双酶切后的质粒pEGFPcDNA片段大小约为4700bp：NF2Ⅱ亚型基因cDNA片段大小为l770bp，NF2Ⅱ亚型基因的真核表达载体可瞬时转染人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Westem Blotting方法得到证实；水溶性四氮唑法检测显示，转染pEGFP-NF2Ⅱ亚型并表达NF2Ⅱ亚型编码蛋白的293细胞与对照组293细胞的增殖指数相同。结论所构建的野生型NF2Ⅱ亚型基因真核表达载体可在人胚胎肾细胞293中表达，且不具有抑制肿瘤细胞增殖的特性。     

pEGFP-N1-APOE ε2重组质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。方法应用基因定点突变手段,根据载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因cDNA克隆基因序列和表达载体增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)质粒上的多克隆位点设计引物,对质粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)进行基因定点突变,得到含有APOE2基因的目的片段,将此目的片段插入载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因融合。重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序,鉴定目的基因是否成功插入pEGFP-N1质粒。结果对所得pEGFP-N1-APOEε2质粒插入部分测序结果显示,pEGFP-N1-APOEε2质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误,表明APOEε2基因定点突变正确,重组pEGFP-N1-APOEε2质粒构建成功。结论成功构建了pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。     

pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。     

pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子,通过调节其他转录因子的表达,参与调节骨髓间充质干细胞的分化。 目的：构建pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体,体外转染兔骨髓间充质干细胞,为过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-07在南华大学附属一医院临床研究所完成。 材料：选择雄性2~5月龄新西兰大白兔,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法：应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,贴壁法不断纯化。从正常小鼠的肝组织中提取总RNA,反转录-聚合酶链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA,经Xho Ⅰ,Apa Ⅰ双酶切,定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ。 主要观察指标：经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性,脂质体介导下体外转染骨髓间充质干细胞,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率,提取总RNA和总蛋白,进行反转录-聚合酶链反应和Western blot检测。 结果：获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确,重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确,成功转染骨髓间充质干细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：实验成功构建了pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒,同时在转染的骨髓间充质干细胞中获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达。     

可溶性血管内皮细胞生长因子受体1真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达

背景：研究表明,可溶性血管内皮生长因子受体Flt-1(sflt-1)基因在多种组织中表达,但其在内皮细胞中的表达尚待证实。 目的：获取人sflt-1基因,构建sflt-1基因真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1重组质粒,检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05/12在南昌大学第二附属医院分子中心完成。 材料：pEGFP-N1真核表达载体为南昌大学第二附属医院分子中心保存,人脐静脉内皮细胞株购至南京基凯生物技术公司。 方法：从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用酶切的方法获得目的基因,将目的载体进行酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,PCR鉴定为阳性的克隆,证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。用脂质体法将pEGFP-N1/sflt-1重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。 主要观察指标：①重组质粒的酶切鉴定结果。②重组质粒的测序鉴定结果。③荧光显微镜及蛋白免疫印迹检测sflt-1基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。 结果：①对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,与sflt-1基因片段全长2 063 bp理论值相符,证实pEGFP-N1/sflt-1重组质粒构建成功。②重组质粒送至上海捷瑞生物技术公司进行通测,测序结果证实插入片段序列与理论值完全一致。③荧光显微镜下可见重组质粒转染人脐静脉内皮细胞发绿色荧光,蛋白免疫印迹检测表明sflt-1基因能在人脐静脉内皮细胞中表达。 结论：实验成功构建了携带人血管内皮生长因子受体Flt-1的重组pEGFP-N1/sflt-1真核表达质粒,并证实其在人脐静脉内皮细胞中的表达。     

重组质粒pEGFP-mDlX5的构建及其在SVZa神经干细胞中的表达研究

目的构建真核表达重组质粒pEGFP-mDlx5,并了解它在室管膜前下区(SVZa)神经干细胞(NSCs)中的mRNA及融合蛋白表达情况。方法运用DNA重组技术自原核表达载体上将小鼠来源的mDlx5基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)载体上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用电穿孔的方法转染SVZa NSCs,荧光显微镜下动态观察荧光变化情况;培养24h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)了解其mRNA表达情况,用Western blot 检测其蛋白表达情况。结果重组质粒通过双酶切产生了0．78 kb目的插入片段及4．68 kb载体片段;测序后证实0．78 kb片段碱基序列与mDlx5基因完全同源;重组质粒转染SVZa NSCs 8 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,12 h后逐渐增多,24-48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过 RT-PCR检测到mRNA表达,Western blot检测到58 kD目的蛋白表达。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-mDlx5通过鉴定,结构正确:转染到SVZa NSCs后能在其中表达、发挥功能,为后续研究奠定了基础。     

大鼠κ—HA—pIRES2-EGFP的构建及表达

目的 构建带HA标签的大鼠κ型阿片受体的pIRES2-EGFP表达质粒(κ-HA-pIRES2-EGFP),并实现其在HEK293细胞中的表达.方法 提取大鼠脑组织总RNA,通过巢式RT-PCR扩增κ型阿片受体全长cDNA,将其克隆至pMD20-T载体中并进行测序鉴定,通过PCR引入HA标签,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,将获得的κ-HA-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,应用荧光显微镜观察EGFP表达情况,并采用细胞免疫荧光和蛋白印迹检测κ-HA表达.结果 测序及酶切结果表明成功获得带HA标签的κ基因,并构建入pIRES2-EGFP表达质粒中,在荧光显微镜下可观察到转染细胞内有绿色荧光,应用免疫荧光和蛋白印迹法可观察到目的 基因表达.结论 利用巢式RT-PCR等技术成功构建了κ-HA-pIRES2-EGFP表达质粒,并在HEK293细胞中实现了高效表达.     

pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3．1—parkin，将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA，用RT—PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA，插入pCR2．1—TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pCD—NA3．1，利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，采用RT—PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT—PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体，获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆，为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

人NR2B基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人NR2B基因,构建其真核表达载体,获得暂态表达NR2B的CHO细胞.方法 RT-PCR方法克隆人NR2B基因,并插入真核表达载体pcDNA3.1中,将该重组载体转染至CHO细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光鉴定细胞中NR2B的表达,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 成功获得人NR2B基因,转染的CHO细胞可检测到NR2B的表达,表达NR2B的CHO细胞并不会凋亡.结论 成功克隆和构建了人NR2B基因的真核表达载体,并在CHO细胞中得到了表达.     

空肠弯曲菌Penner O:19 galE基因真核表达质粒的构建

目的构建空肠弯曲菌Penner O:19 galE基因真核表达质粒。方法 PCR扩增空肠弯曲菌Penner O:19 galE基因,构建pGEM-T-galE克隆质粒及构建pEGFP-N1-galE真核表达质粒,并检测真核表达质粒在293T细胞中的表达。结果构建了真核表达质粒pEGFP-N1-galE,检测到其在293T细胞表达。结论 pEGFP-N1可作为Penner O:19 galE基因的真核表达载体。     

小鼠血管紧张素转化酶2基因表达型载体的构建及体外表达*

背景：通过转基因疗法使血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme,ACE2)过度表达来治疗心血管病是当前ACE2研究的趋势,而构建含ACE2基因的载体则能为该研究方法提供工具。 目的：构建含小鼠血管紧张素转化酶2基因的真核表达载体,并验证其蛋白的表达。 方法：采用RT-PCR的方法从C57小鼠肾脏扩增出ACE2基因全长cDNA序列,并通过酶切连接和转化等分子生物学方法将其定向克隆至载体pcDNA3.1/Hygro(+)上,构建小鼠ACE2基因的真核表达载体pm-ACE2,并通过酶切及测序鉴定。通过脂质体转染法将所构建的pm-ACE2转染COS7细胞,并利用Western blot检测COS7细胞中ACE2蛋白的表达。 结果与结论：通过测序并与GeneBank上的小鼠血管紧张素转化酶2序列(NM_027286.3)比对,证实实验成功克隆小鼠ACE2基因全长cDNA至载体pcDNA3.1/Hygro(+)上,测序结果提示存在3处同义突变;所构建的pm-ACE2在真核细胞中具有ACE2蛋白的表达。结果提示实验成功构建了小鼠ACE2基因真核表达载体,此载体具有表达ACE2蛋白的功能。 关键词：血管紧张素转化酶2基因;载体;COS7细胞;真核细胞;基因表达;组织构建     

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达*

背景：骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道。 目的：构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达。 方法：通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中。 结果与结论：pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。 目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。 方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。 结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。