人角膜缘干细胞在体外不同载体上培养的实验研究

目的 寻找人角膜缘干细胞体外培养的载体。方法 人角膜缘干细胞原代培养单细胞层传代到羊膜、卵壳膜、聚乳酸膜、藻酸盐凝胶4种载体和6种培养板中,倒置显微镜观察、记录细胞生长情况。对6孔板传代细胞行生物特性检测,对载体上培养细胞行组织学检测。结果 6孔板中传代细胞对AE－5,4G10．3表达阳性。羊膜、卵壳膜和聚乳酸膜上有细胞生长,7天左右形成单层;藻酸盐凝胶载体上未见细胞生长。结论 传代细胞具有角膜缘干细胞生物特性;羊膜、卵壳膜和聚乳酸膜适合角膜缘干细胞传代培养。     

深低温保存的角膜缘组织CD40的表达以及体外培养增生活性的研究

目的探讨深低温保存的角膜缘组织CD40的表达情况以及培养后增生活性的变化。方法取角膜移植术后角膜缘组织20例（20眼）,其中10例新鲜组织直接进行体外培养,另10例经深低温冷冻保存后再进行体外培养,对比观察两组细胞生长情况,并用免疫组化方法检测CD40在二者的表达。结果新鲜角膜缘组织块接种后3d可见细胞贴壁生长,培养至6d时细胞基本形成单层;深低温保存角膜缘组织块接种后在7d可见细胞贴壁生长,培养至10d时细胞基本形成单层。CD40在两组角膜缘上皮基底细胞层均有着色,为棕褐色,在深低温保存角膜缘组织表达明显减弱。结论深低温保存的角膜缘组织具有良好的增生活性,利用深低温保存的角膜缘组织进行角膜缘干细胞移植可以降低移植排斥率。     

人角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨人自体角膜缘干细胞（LSCs）体外培养及鉴定的方法。方法将供体新鲜人角膜缘组织在制备的含20％胎牛血清DMEM／F12培养基的羊膜载体上应用组织块培养法进行体外培养,对培养获得的LSCs用苏木精-伊红染色在倒置显微镜下进行形态学观察,用免疫荧光技术鉴定培养的LSCs细胞。结果组织块静置2h后贴壁良好,3～4d细胞从组织块边缘荫出,7～10d细胞出现生长高峰,12～14d形成良好的细胞单层。细胞形态呈多边彤、圆形、卵圆形和梭形。第14天时行间接免疫荧光染色,可见大量细胞表达p63,呈细胞质的绿色荧光;少量细胞表达AE5,呈细胞质的绿色荧光和细胞核的红色荧光。结论组织块培养法体外培养的人LSCs具有与正常人LSCs相一致的生物学特性。     

原代培养角膜缘干细胞与ΔNp63蛋白表达的年龄相关性研究

目的建立兔角膜缘干细胞（LSCs）原代培养体系,了解年龄的增长对兔LSCs的ΔNp63蛋白表达的影响。方法选取3月龄、1.5年龄及3年龄新西兰白兔各10只,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液对LSCs的细胞悬液进行体外原代培养。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和间接免疫荧光法分别检测培养细胞中ΔNp63蛋白的表达量。结果接种3d后大部分细胞贴壁,6d左右形成良好的细胞单层,细胞呈圆形、椭圆形或多边形,类似角膜上皮细胞。年龄越大,ΔNp63的表达量越低。不同年龄组之间ΔNp63表达量的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液能作为LSCs培养的基础液;ΔNp63蛋白的表达具有明显的年龄相关性,随年龄的增长ΔNp63表达量的下调可能是LSCs老化的分子机制之一。     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞活化和增殖作用的实验研究

目的 观察角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞活化和增殖的抑制活性，并分析其机制。方法 通过植片技术分离兔角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞。存两种细胞单层上，观察淋巴细胞埘丝裂原刀豆蛋白A(ConA)的增殖反应。另外，将两种细胞培养上清直接转移到由ConA刺激的淋巴细胞增殖系统以观察两种细胞释放。某些因子的抑制效应。结果 单层角膜缘干细胞对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。角膜缘干细胞以及角膜上皮细胞的培养上清对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖系统，仅在72h分离上清显示有抑制效应。结论 角膜缘干细胞通过细胞交互作用和(或)释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。     

人类角膜缘干细胞对外周血淋巴细胞作用的实验研究

目的 观察体外培养的人类角膜缘干细胞对同种异体外周血淋巴细胞的作用。方法 通过植片技术分离人角膜上皮细胞以及角膜缘干细胞。在两种细胞单层上，观察同种异体外周血淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白A（ConA）的增殖反应。另外，将两种细胞培养上清直接转移到由ConA刺激的淋巴细胞增殖系统，以观察两种细胞释放某些因子的抑制效应。结果 单层角膜缘干细胞对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖反应可以施加有效的抑制效应。角膜缘干细胞培养上清对ConA刺激的外周血淋巴细胞增殖系统，在72h分离上清显示有明显抑制效应。结论 角膜缘干细胞通过细胞交互作用和（或）释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。     

培养角膜缘干细胞羊膜移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的 观察培养生长于羊膜的角膜缘干细胞移植的治疗角膜缘碱烧伤伤的效果。方法 将兔角膜缘干细胞在的代培养后接种于羊膜,对新西兰大白兔角膜缘碱烧伤动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行临床及病理学检查。结果 体外培养的兔角膜缘士细胞可在羊膜上继续增殖、分化为密集的角膜上皮细胞层;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整基质细胞浸润减轻、新生血管减少。组织病理学染色证实,角膜缘     

胎牛血清对小鼠角膜上皮细胞生长和分化的影响(英文)

目的:探讨胎牛血清对小鼠角膜上皮细胞生长和分化的影响。方法:分别在无血清低钙培养基(KSFM)和含100mL/L胎牛血清的KSFM中培养小鼠角膜上皮细胞。比较两种培养基中角膜上皮细胞的群体倍增(PD)。通过RT-PCR和Western blotting方法检测p63、角蛋白19以及involucrin的表达。结果:在KSFM中,小鼠角膜上皮细胞可稳定传代超过25代,但在含胎牛血清的培养基中,细胞仅能存活3代。在KSFM中,培养细胞呈典型铺路石样外观,RT-PCR和Western blotting结果显示细胞表达p63、角蛋白19以及in-volucrin。当培养基中加入胎牛血清后,细胞形态明显增大,呈扁平状; involucrin表达显著增强。结论:胎牛血清可抑制小鼠角膜上皮细胞增生、诱导其分化。     

胎牛血清对小鼠角膜上皮细胞生长和分化的影响

目的：探讨胎牛血清对小鼠角膜上皮细胞生长和分化的影响。方法：分别在无血清低钙培养基（KSFM）和含100mL／L胎牛血清的KSFM中培养小鼠角膜上皮细胞。比较两种培养基中角膜上皮细胞的群体倍增（PD）。通过RT-PCR和Westernblotting方法检测p63、角蛋白19以及involucrin的表达。结果：在KSFM中,小鼠角膜上皮细胞可稳定传代超过25代,但在含胎牛血清的培养基中,细胞仅能存活3代。在KSFM中,培养细胞呈典型铺路石样外观,RT-PCR和Westernblotting结果显示细胞表达p63、角蛋白19以及involucrin。当培养基中加入胎牛血清后,细胞形态明显增大,呈扁平状;involucrin表达显著增强。结论：胎牛血清可抑制小鼠角膜上皮细胞增生、诱导其分化。