p38丝裂原活化蛋白激酶通路介导TGF-β_1/结缔组织生长因子调控人腰椎黄韧带增生肥厚的机制研究

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)通路在TGF-β1/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)调控人腰椎黄韧带增生肥厚中的作用机制。方法取腰椎间盘突出髓核摘除术中获得的黄韧带组织,采用胶原酶预消化组织块培养法分离培养黄韧带细胞。分别用细胞外调节蛋白激酶通路阻断剂PD98059、c-Jun氨基末端激酶通路阻断剂SP600125、p38通路阻断剂SB203580处理黄韧带细胞,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量。然后取黄韧带细胞分为A、B、C、D组,分别以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1转染细胞,转染24 h后行免疫荧光染色观察p38和磷酸化p38(phosphorylation p38,p-p38)表达,qRT-PCR检测各组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量,Western blot检测各组CTGF蛋白表达。结果 p38通路阻断剂SB203580可明显降低黄韧带细胞CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量(P0.05)。转染24 h后,免疫荧光染色显示A、C、D组细胞呈阳性反应,有p38、p-p38表达,且C、D组强于A组;B组细胞呈阴性反应,无p38、p-p38表达。与A组相比,B组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量以及CTGF蛋白相对表达量显著减少,C、D组显著增加,C组较D组进一步增加,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 p38 MAPK通路介导TGF-β_1/CTGF表达,在人腰椎黄韧带细胞增生肥厚过程中具有重要作用。     

体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究

目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs的特性及经诱导后在体外能否向韧带细胞分化。方法取产妇胎盘通过酶消化法获得h AMSCs,流式细胞术鉴定h AMSCs表型特征。取第3代h AMSCs分别加入含不同诱导液的L-DMEM/F12培养基:A组TGF-β1+b FGF,B组透明质酸(hyaluronic acid,HA),C组TGF-β1+b FGF+HA,D组为空白对照组。倒置相差显微镜观察诱导后21 d各组细胞形态学变化;磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测各组细胞生长活性;诱导后7、14、21 d分别采用免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白和基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、肌腱蛋白C(tenascin C,TNC)表达。结果流式细胞术鉴定结果表明h AMSCs表达MSCs表型。倒置相差显微镜观察示诱导21 d A、B、C组细胞均呈长梭形纤维细胞样生长,C组细胞形态更单一、有明显方向性且较A组排列更紧凑。SRB比色法检测示各组细胞于培养6 d左右达增殖高峰,6 d时A、B、C组细胞活性均显著高于D组。免疫组织化学结果示:诱导培养7 d,各组均未检测到TNC表达;7、14、21 d A、B、C组Ⅰ型胶原表达均显著高于D组,14、21 d A、B、C组Ⅲ型胶原表达显著高于D组,差异均有统计学意义(P0.001)。B组Ⅰ型胶原表达以及A、C组Ⅲ型胶原、TNC表达随时间增加均呈逐渐增高趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.001)。实时荧光定量PCR结果示:诱导培养21 d,C组Ⅰ型胶原、TNC m RNA相对表达量显著高于A、B组,B组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量显著高于A、C组,差异均有统计学意义(P0.05)。A、C组Ⅰ型胶原、TNC以及C组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量随时间增加呈逐渐上调趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.001)。结论 h AMSCs具有MSCs的特性,有良好增殖能力,经体外诱导后韧带特异性基因表达上调,韧带特异性蛋白合成增加,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一。     

细粒棘球绦虫原头节促进BMSCs纤维化的实验研究

目的探讨细粒棘球绦虫原头节对BMSCs向成纤维细胞分化的影响。方法取4周龄C57BL/6小鼠股骨骨髓,利用贴壁培养法分离培养BMSCs;从感染细粒棘球蚴的羊肝中提取细粒棘球绦虫原头节。实验分为2组,实验组取第3代BMSCs和细粒棘球绦虫原头节共培养,对照组为单纯第3代BMSCs。共培养前后倒置显微镜观察BMSCs形态;培养1、3、5、7 d,采用实时荧光定量PCR检测两组BMSCs中TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因表达,Western blot检测两组BMSCs中TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Smad7和磷酸化Smad2/3蛋白表达,ELISA检测两组上清中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量。结果细粒棘球绦虫原头节与BMSCs共培养7 d后观察到BMSCs形态发生改变,变成梭形和不规则三角形,更接近单独培养的小鼠成纤维细胞。培养1、3、5、7 d,实时荧光定量PCR检测示,实验组TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量均显著高于对照组;Western blot检测示,实验组TGF-β_1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、磷酸化Smad2/3蛋白相对表达量均显著高于对照组,Smad7蛋白相对表达量显著低于对照组;ELISA检测示,实验组上清中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白含量均显著高于对照组。上述指标两组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论细粒棘球绦虫原头节可能通过TGF-β_1/Smad信号通路,促进BMSCs分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β_1,进而促进BMSCs纤维化。     

保留胫骨残端重建前交叉韧带对韧带重塑相关基因表达的影响

目的观察保留胫骨残端重建前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)对韧带重塑相关基因表达的影响。方法 60只健康成年新西兰大白兔,随机分为4组,分别为正常对照组(A组,n=6)、假手术组(B组,n=18)、不保留残端组(C组,n=18)和保留残端组(D组,n=18)。分别于术后2、6、12周处死动物(n=6),取ACL或移植物标本,采用实时荧光定量PCR,检测各组术后各时间点Ⅰ型胶原前胶原α1基因(collagen type1A1,COL1A1)、Ⅲ型胶原前胶原α1基因(collagen type 3A1,COL3A1)、TGF-β_1、VEGF、生长相关蛋白43(growthassociated protein 43,GAP-43)和神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)m RNA的表达。结果术后各时间点A、B组COL1A1、COL3A1、VEGF、NT-3 m RNA相对表达量差异均无统计学意义(P0.05);与C组比较,D组COL1A1、COL3A1、TGF-β_1、GAP-43 m RNA相对表达量在术后6周均显著增加(P0.05),VEGF m RNA相对表达量术后12周显著增加(P0.05),NT-3 m RNA相对表达量术后2、12周显著增加(P0.05)。结论 ACL移植物中存在促进血管生成、修复以及与神经修复相关的基因表达,并有时间依赖性,保留残端重建ACL可促进某些时间点各相关基因的表达。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中TGF-β_1及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的改变及意义

目的检测增生性瘢痕(H)和瘢痕疙瘩(K)组织中 TGF-β_1及Ⅰ、Ⅲ型前胶原 mRNA的表达,了解其相互关系及意义。方法斑点杂交分析检测 H 和 K 组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原及 TGF-β_1mRNA 稳态水平的改变;原位杂交检测 TGF-β_1 mRNA 在组织中的空间分布。结果①K 和 H 组织中 TGF-β_1 mRNA 稳态水平明显高于 N 组和 S 组;②K 选择性Ⅰ型前胶原 mRNA 表达增强,而 H 组织中Ⅰ、Ⅲ前胶原 mRNA 表达均增强。结论 TGF-β_1在 H 和 K 的发病机理中起了重要作用,K 和H 发生发展中具有不同的分子机理。     

TGF-β1和bFGF-1对单层共培养BMSCs和韧带成纤维细胞韧带特异性的影响

目的 探讨单层共培养BMSCs和韧带成纤维细胞(ligament fi broblasts,LFs)经TGF-β1和bFGF-1诱导后,细胞活性、增殖能力和韧带特异性基因及蛋白表达和合成情况。方法 取3月龄SD大鼠,通过密度梯度离心法结合贴壁法分离培养BMSCs,胶原酶消化法获得LFs。取第3代BMSCs和LFs,实验分为6组,分别为未诱导单纯BMSCs组(A组)、未诱导单纯LFs组(B组)、未诱导单层共培养组(C组)和诱导后单纯BMSCs组(D组)、诱导后单纯LFs组(E组)、诱导后单层共培养组(F组)。倒置相差显微镜及MTT法观测各组细胞生长情况;ELISA法检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度;实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞黏合素C、基质金属蛋白酶2)基因表达。结果 倒置相差显微镜观察,共培养细胞可形成一单细胞层生长,F组最快融合至90%以上。MTT检测示,培养9 d时F组吸光度(A)值最高,D组次之,B组最低,与其余组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测示细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度中,F组浓度显著高于其余各组(P<0.05),D、E组Ⅰ型胶原蛋白浓度差异无统计学意义(P>0.05),E组Ⅲ型胶原蛋白浓度高于D组(P<0.05)。A~F组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度比值分别为1.17、1.19、1.10、1.25、1.17、1.18,D组明显高于其余组。实时荧光定量PCR检测示,Ⅰ、Ⅲ型胶原及纤维连接蛋白基因表达量F组最高,细胞黏合素C D组最高,基质金属蛋白酶2 E组最高,与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论单层共培养BMSCs和LFs经TGF-β1和bFGF-1诱导后,细胞活性、增殖能力、韧带特异性基因及蛋白均增高,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一。     

过表达Smad7基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响

目的观察瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFb)转染Smad7过表达载体后,对细胞内Smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因、蛋白表达和细胞增殖的影响,探讨Smad7蛋白对瘢痕疙瘩生长有无抑制作用。方法收集10例20~25岁男性瘢痕疙瘩患者(排除其他疾病)手术切下的瘢痕疙瘩组织,体外无菌条件下培养KFb后分为3组,A组为未转染组;B组为空载体pc DNA3.1(-)转染细胞组;C组为Smad7基因过表达载体pc DNA3.1(-)-smad7转染细胞组。转染48 h后行实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞内Smad7、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因转录和蛋白表达水平,转染24 h后MTT法检测各组细胞增殖能力。结果 C组Smad7m RNA和蛋白相对表达量显著高于A、B组,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原m RNA和蛋白相对表达量显著低于A、B组,差异均有统计学意义(P0.01);B组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原m RNA相对表达量高于A组(P0.01),Smad7、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白相对表达量低于A组(P0.01)。MTT检测示,培养各时间点C组细胞增殖能力均小于A、B组(P0.05),A、B组间差异均无统计学意义(P0.05)。结论转染Smad7基因过表达载体能抑制KFbⅠ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达和细胞增殖能力。     

转化生长因子β1在牵张应力刺激促进后纵韧带细胞骨化中的作用

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)在牵张应力刺激促进后纵韧带成纤维细胞骨向分化进程中的作用。方法经颈前路手术获取颈椎后纵韧带骨化症(OPLL)患者的后纵韧带组织,采用组织块培养法进行体外细胞培养及鉴定。通过荧光实时定量PCR检测后纵韧带成纤维细胞在加载牵张应力刺激12 h及24 h后Ⅰ型胶原(COLⅠ)、碱性磷酸酶(ALP)和TGF-β1的mRNA表达变化;并检测在加入外源性TGF-β1或TGF-β1抗体作用后,后纵韧带成纤维细胞在静置或牵张应力刺激下的COLⅠ和ALP的mRNA表达变化。结果 HE及免疫荧光染色证实后纵韧带成纤维细胞培养成功。后纵韧带成纤维细胞经牵张应力刺激12 h及24 h后,细胞COLⅠ、ALP和TGF-β1的mRNA表达与静置相同时间的对照组相比均有升高,且24 h时差异具有统计学意义(P0.05)。加入0.1、1.0、10.0 ng/mL的外源性TGF-β1并静置24 h后细胞COLⅠ及ALP的mRNA表达量升高,其中10.0 ng/mL浓度组与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05);而加入2.0μg/mL的TGF-β1抗体并加载牵张应力刺激24 h后细胞的COLⅠ及ALP的mRNA表达量的升高程度与对照组相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论组织块培养法是进行颈椎OPLL患者后纵韧带成纤维细胞体外培养的有效方法。后纵韧带成纤维细胞在牵张应力刺激下TGF-β1表达上调,且TGF-β1可促进其骨向分化。     

TGF-β_1联合VEGF对人羊膜间充质干细胞向韧带成纤维细胞体外分化作用的研究

目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs特性,以及经TGF-β_1和VEGF联合诱导后是否具有向韧带成纤维细胞分化的能力。方法取自愿捐赠的足月产妇胎盘,采用胰蛋白酶胶原酶联合消化法分离培养h AMSCs,流式细胞术检测h AMSCs表型分子,免疫荧光染色检测h AMSCs其角蛋白-19(cytokeratin-19,CK-19)和波形蛋白表达情况。取第3代h AMSCs,分别使用含TGF-β_1和VEGF的L-DMEM/F12成韧带或纤维细胞诱导培养基(实验组)和普通L-DMEM/F12培养基(对照组)培养,细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测两组细胞增殖能力;培养5、10、15 d分别采用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测韧带及血管生成相关特异性蛋白和基因表达。结果倒置相差显微镜观察示h AMSCs呈单层贴壁生长;流式细胞术结果示h AMSCs表达MSCs表型分子;免疫荧光染色示h AMSCs高表达波形蛋白、低表达CK-19;h AMSCs具有向成骨、成软骨及成脂细胞分化的能力。CCK-8法检测示,7 d时两组细胞均达增殖高峰,实验组细胞增殖能力于7 d后显著高于对照组(P0.05)。免疫荧光染色示,培养5、10、15 d时实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白(Fibronectin)、细胞连接素(Tenascin-C)表达染色均较对照组增强。实时荧光定量PCR结果示,随时间延长实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、VEGF m RNA相对表达量均逐渐上调(P0.05)。除培养5 d两组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、VEGF m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各时间点实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-SMA和VEGF m RNA相对表达量均显著高于对照组(P0.05)。结论 h AMSCs具有MSCs特征,且体外增殖能力良好,可作为组织工程种子细胞来源;体外诱导后韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因表达上调,韧带成纤维细胞特异性蛋白分泌增加,TGF-β_1联合VEGF可作为构建组织工程韧带的生长因子选择。     

转化生长因子-β对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及细胞外基质成分表达的影响

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人肾小球系膜细胞(HMCs)结缔组织生长因子(CTGF)及细胞外基质(ECM)成分表达的影响.方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术,观察不同时间TGF-β1对HMCs CTGF mRNA及其蛋白质表达的影响,同时观察对Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和纤维结合蛋白(FN)mRNA表达的影响.结果:在正常培养情况下,HMCs有CTGF mRNA及其蛋白质的表达.HMCs在TGF-β1刺激后,CTGFmRNA表达明显增加,6 h达到高峰,可持续增高到24 h;CTGF蛋白表达12 h达到高峰,可持续增高至24 h.Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原mRNA表达逐渐增加,24 h明显增加并达到高峰.FN mRNA12 h达到高峰,24 h后开始回落.结论:HMCs可表达CTGF.TGF-β可诱导体外培养的HMCsCTGF及ECM成分高表达.     

血管内皮生长因子抑制肾小管上皮间充质转化及其与结缔组织生长因子和PI3K-Akt信号通路的关系

目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用,及其与结缔组织生长因子（CTGF）、PI3K-Akt信号通路的关系。 方法 （1）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1（5 μg/L,下同）组、VEGF组（100 μg/L,下同）、TGF-β1＋VEGF组。HK2细胞体外培养48 h,用免疫组化双染方法检测肾小管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E钙黏蛋白的表达。（2）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1组、VEGF组、TGF-β1＋VEGF组、PI3K-Akt信号通路阻断剂LY294002组（25 μmol/L,下同）、TGF-β1＋LY294002组、VEGF＋LY294002组、TGF-β1＋VEGF＋LY294002组。HK2细胞体外培养48 h,用Western印迹和RT-PCR方法检测α-SMA和CTGF的表达;用ELISA方法检测培养上清中纤连蛋白（FN）和I型胶原（ColⅠ）的表达。 结果 免疫组化结果显示,TGF-β1组α-SMA表达比正常对照组增强,而E钙黏蛋白表达减弱; TGF-β1＋VEGF组α-SMA表达比TGF-β1组显著减弱,而E钙黏蛋白表达增强。 TGF-β1组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比正常对照组显著增强（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF组α-SMA、CTGF蛋白和mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1组显著减弱（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF＋LY294002组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1＋VEGF组显著增强（均P < 0.05）。 结论　VEGF能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HK2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调HK2细胞CTGF表达及减少细胞外FN、ColⅠ合成有关。VEGF的这种作用可能部分通过PI3K-Akt信号转导通路实现,其确切机制有待进一步研究。     

转化生长因子β1诱导肾间质成纤维细胞表型转化及其对结缔组织生长因子基因表达的影响

目的 研究转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）诱导大鼠正常肾间质成纤维细胞（NRK-49F）表型转化过程中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）基因表达的变化.方法 以不同浓度的TGF-β1（0、0.5、1、2、5、10 ng/ml）刺激NRK-49F细胞,分别应用MTT比色法、Western Blot、Northern Blot方法,检测TGF-β1刺激后肾间质成纤维细胞的增殖、Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRAN的表达、细胞表型标志物α-SMA mRNA及蛋白质表达、CTGFmRNA的表达变化.结果 1 ng/ml浓度以上TGF-β1能显著促进NRK-49F细胞增殖,上调Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平,诱导肌成纤维细胞表型标志α-SMA mRNA及蛋白质的表达,显著上调CTGF mRNA的表达水平（P＜0.01或P＜0.05）;以上效应均呈浓度依赖性.同时CTGF mRNA表达水平的增高与细胞表型转化的程度相一致.结论 TGF β1能诱导肾间质成纤维细胞发生表型转化,并促进了细胞增殖及细胞外基质的合成;该效应与TGF β1显著上调CTGF的基因表达一致.     

RNA干扰质粒沉默转化生长因子β_1对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)的RNA干扰质粒(shRNA-TGF-β_1)对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响.方法 预先构建shRNA-TGF-β_1.取SD大鼠肾脏,置于4℃肝素生理盐水中以强化缺血再灌注损伤,用于移植.切除Wistar大鼠左肾后移植入供肾,术中采用以流体力学为基础的肾脏基因转染技术进行质粒转染.实验分为4组.T组为质粒组,受者注射shRNA-TGF-β_1质粒;H组为空质粒组,受者注射空质粒;Y组为单纯移植组,受者仅行肾移植,不注射任何质粒;J组为假手术组,只打开腹腔切除左肾,不进行肾移植.移植术后1、2和3个月时,切取各组受者的移植肾,检测TGF-β_1、Ⅰ型胶原及其mRNA的表达,检测Ⅰ型胶原组织定位,观察移植肾细胞外基质的沉积.结果 J组大鼠肾脏组织中仅有少量的TGF-β_1 mRNA表达.H组及Y组TGF-β_1 mRNA的表达较高.术后1个月时,T组TGF-β_1 mRNA的表达显著低于其他各组,随着时间的延长,其表达有所升高,但仍显著低于H组及Y组.各组TGF-β_1的表达与TGF-β_1 mRNA的表达有相同的变化趋势.T组Ⅰ型胶原mRNA的表达低于H组和Y组.各组Ⅰ型胶原的表达与其mRNA的表达有相同的变化趋势,Ⅰ型胶原主要位于H组和Y组的皮质小管区及髓质间质区,肾小球部位相对较少.T组移植肾纤维化程度低于H组和Y组.结论 转染shRNA-TGF-β_1能抑制移植肾TGF-β_1的表达,减少细胞外基质的生成,在一定程度上预防移植肾纤维化.     

神经纤维瘤组织中致纤维化生长因子和胶原的表达

目的：观察结缔组织生长因子（CTGF）在神经纤维瘤组织中的表达情况及与其上、下游效应基因表达的关系,探讨CTGF在神经纤维瘤组织中的促纤维化机制。方法：收集神经纤维瘤组织、瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织标本,免疫组化检测CTGF的表达,逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测组织CTGF、TGF-β1、Ⅰ型胶原（ColⅠ）及Ⅲ型胶原（ColⅢ）mRNA表达,Western blotting检测组织CTGF蛋白的表达。结果：免疫组织化学染色发现,CTGF在瘤细胞中有强阳性表达,在汗腺和皮脂腺细胞中有阳性表达。神经纤维瘤组织及瘢痕疙瘩组织中CTGF、TGF-β1、ColⅠ和ColⅢ的mRNA过表达,而正常皮肤组织无或仅有极弱表达。Western blotting结果显示神经纤维瘤组织有明显的CTGF蛋白表达条带。结论：在神经纤维瘤发病过程中,CTGF可能是重要的调控因子之一,与TGF-β1协同促进细胞外基质合成。     

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.     

反义寡核苷酸对TGF-β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞(HSF)的影响,探讨CTGF ASODN对人增生性瘢痕的作用.方法 将体外分离、培养的人正常皮肤成纤维细胞(NSF)和HSF分成A(NSF)、B(HSF)、C(HSF+TGF-β1)、D(HSF+TGF-β1+CTGFASODN)四组.经TGF-β1(5.0μg/L)诱导HSF后,将CTGFASODN以脂质体介导的方法转染HSF.用RT-PCR方法检测四组中CTGF mRNA的表达,用MTT比色法和流式细胞仪分别检测转染6、12、24、48、72 h的成纤维细胞的增殖和凋亡情况.结果 CTGF mRNA在NSF中的表达极其微弱;在HSF中,B组的表达量为0.31±0.14,C组的表达量为0.64±0.32,D组的表达量为0.12±0.62.A组与B、C、D组比较,其差异有统计学意义(P<0.05);而D组与B、C组比较,其差异也有统计学意义(P<0.05).结论 CTGF ASODN具有降低HSF中CTGF的表达从而延缓瘢痕纤维化的作用,可能成为治疗瘢痕增生的有效手段.     

低氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌纤维化的影响

目的:探讨低氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌纤维化的影响。方法:体外培养阴茎海绵体平滑肌细胞,免疫组化鉴定细胞;常规氧浓度(21%O2浓度)分别培养12、24、48、72h作为对照,低氧(1%O2浓度)干预12、24、48、72h,RT-PCR分别测定各组TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的相对表达量。结果:体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞生长良好,抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色阳性;RT-PCR结果提示TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的相对表达量在48h内与低氧时间成正相关,时间进一步延长不能增加其相对表达量。结论:在低氧环境下,SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞的TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的相对表达量随时间的延长逐渐增加,48h达到最大值。低氧可导致SD大鼠阴茎海绵体平滑肌纤维化。     

骨髓基质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外增殖、分化为软骨样细胞的影响。方法 24只兔等分为4组,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B、C、D组分别加入TGF-β1、b-FGF、TGF-β1和b-FGF,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞形态变化、C组增殖速度、D组增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色:原代阴性,传代细胞,A、c组淡染或阴性,B组呈蓝色,D组呈深蓝色。Ⅱ型胶原mRNA表达:A、c组未检出,B组阳性,D组有较强阳性表达。结论 兔BMSC在体外适当条件下可分化为软骨样细胞,TGF-β1能诱导BMSC向软骨方向分化,b-FGF不仅能促进BMSC的增殖,且能延长其生存时间。     

PPARγ特异配体抑制肝星状细胞的活化

目的 研究不同浓度的过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)生物学特性的影响,以探究其在肝旱状细胞活化中的作用.方法 设立对照组,3μM罗格列酮组,10μM罗格列酮组,20μM岁格列酮组.用MTT法检测细胞的增殖情况;采用RT-PCR方法检测其中PPARγ、TGF-β1及Ⅰ型前胶原mRNA表达;用Western blot法检测PPARy、Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达;用免疫细胞化学方法测定α-SMA表达的变化;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅰ型胶原表达的变化.结果 (1)RT-PCR:20μM罗格列嗣组或10μM罗格列酮组与3 μM罗格列酮组或对照组相比,PPARY mRNA表达显著增高(P＜0.01),Ⅰ型前胶原mRNA表达显著降低(P＜0.01);20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之间,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,PPARγ和Ⅰ型前胶原mRNA的表达差异无显著件(P＞0.05).而各组之间的TGF-β1 mRNA的差异无显著性意义(P＞0.05).(2)Western blot:PPARγ及TGF-β1蛋白表达所得结果与RT-PCR结果相一致.Ⅰ型胶原表达与RT-PCR Ⅰ型前胶原mRNA表达结果相一致.各组之间的Ⅲ型胶原表达差异无显著性意义(P＞0.05).(3)免疫细胞化学:20α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3 α-SMA罗格列酮组或对照组相比,α-SMA表达明显降低(P＜0.05).20 α-SMA岁格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酮组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).(4)ELISA:20 α-SMA罗格列酮组或10 α-SMA罗格列酮组与3α-SMA罗格列倒组或对照组相比,细胞的培养上清中Ⅰ型胶原表达明显降低(P＜0.01).20 α-SMA罗格列酮组与10 α-SMA罗格列酮组之问,3 α-SMA罗格列酬组与对照组之间,差异无显著性(P＞0.05).结论 PPAR?配体罗格列酬能够在促进PPAR?的合成表达的同时,抑制细胞的增殖及胶原合成,抑制α-SMA的表达,减少细胞分泌Ⅰ型胶原,对肝星状细胞的活化有明显的抑制作用.     

大鼠慢性皮肤溃疡创面愈合中转化生长因子-β1、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的蛋白表达

目的 观察大鼠慢性皮肤溃疡创面愈合过程中转化生长因子-β1( TGF-β1)、胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的蛋白表达。方法 将24只8周龄雌性Wister大鼠分为单纯创面组(A组)和皮瓣+创面组即缺血模型组(B组),每组各12只;苏木素-伊红(HE)染色法观察创面1、3、7、10d上皮化率、收缩率及中性粒细胞;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定创面1、3、7、10 d TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达。结果 A组上皮化率在各个时间段均高于B组,且在第7天差异有统计学意义(P＜0.05)。A组收缩率明显低于B组。A组中性粒细胞第1、3天逐渐增加,第3天增加到最多,随后逐渐减少;B组在1、3、7d出现增加趋势,第7天增加到最多,第10天减少。TGF-31含量A组于术后1、3、7、10d呈曲线上升趋势,B组在术后1、3、7d逐渐减低,10 d较7d略有回升,且在第1天两组差异有统计学意义(P＜0.05)。胶原Ⅰ蛋白的含量两组随着术后时间的延长均呈减少趋势,在第10天两组差异有统计学意义(P＜0.05)。胶原Ⅲ蛋白的含量两组随术后时间的延长也呈减少的趋势,但在第3天A组比B组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 在缺血的干预因素作用下TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的减少可能延迟了慢性创伤的正常愈合。