多壁碳纳米管抑制MC3T3-E1成骨细胞迁移的实验研究

目的探讨多壁碳纳米管(MWCNT)对MC3T3-E1成骨细胞迁移的影响。方法采用超声法分散MWCNT,经扫描电镜、投射电镜和动态光散射仪检测分散效果。采用MWCNT(100 g/mL)处理MC3T3-E1成骨细胞,原子力显微镜检测细胞表面形态,划痕实验检测细胞迁移情况,Gradientech Tracking软件分析细胞迁移特性。结果 MWCNT获得较好分散,细胞处理12 h后,MWCNT大量吸附于细胞表面。划痕实验显示对照组愈合率为80%,MWCNT处理组愈合率为45%(P<0.01),其迁移距离、直线距离和迁移速度均显著低于对照组。结论 MWCNT可大量吸附于成骨细胞表面并显著抑制MC3T3-E1成骨细胞迁移。     

siRNA沉默ERK5基因对MC 3 T3-E1成骨细胞增殖及 BMP2/BMP7的影响

目的观察ERK5信号通路对MC3T3-E1成骨细胞的增殖,及功能分化蛋白BMP2/BMP7的影响。方法应用小RNA分子干扰技术(siRNA)沉默ERK5基因,分别将浓度为20、40、60、80 nmol/L的ERK5 siRNA干预MC3T3-E1成骨细胞,筛选ERK5 siRNA转染的最佳浓度。噻唑蓝实验(MTT)检测转染后12 h、24 h、36 h和48 h细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测ERK5、BMP2和BMP7 mRNA的表达。Westernblot检测不同干预组BMP2及BMP7蛋白的表达变化。结果当ERK5siRNA浓度为60 nmol/L时,MC3T3-E1成骨细胞的ERK5 mRNA的表达下降最为显著,沉默率为76.8±2.2%(P0.01)。ERK5 siRNA转染后12 h、24 h、36 h,成骨细胞的增殖受到明显抑制(P0.05),但48 h转染组未发现明显变化(P0.05)。ERK5 siRNA转染24 h后,实时荧光定量PCR结果显示:空白组与对照siRNA组成骨细胞的BMP2/BMP7 mRNA变化水平无显著性差异(P0.05),但ERK5 siRNA转染组的BMP2/BMP7 mRNA明显降低(P0.05);Westernblot结果显示,空白组与对照siRNA组成骨细胞的BMP2/BMP7蛋白未发现明显变化(P0.05),但转染组成骨细胞的BMP2/BMP7显著降低(P0.05)。结论 ERK5 siRNA对MC3T3-E1成骨细胞的增殖以及骨形态蛋白BMP2和BMP7的表达有明显抑制作用。     

氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞对MC3T3-E1成骨细胞迁移、增殖及成骨基因表达影响的实验研究

目的探索氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞对MC3T3-E1成骨细胞迁移、增殖及成骨基因表达的影响。方法取MC3T3-E1细胞系及RAW264.7细胞系,分别培养传至第7代进行实验。利用不同浓度(0、25、50、100μmol/L)H_2O_2刺激RAW264.7细胞,MTS检测培养1、3、6 h后细胞增殖率,采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒检测培养1 h时细胞内SOD含量,筛选H2O2引起RAW264.7细胞氧化应激的最佳浓度和作用时间,并对应收集RAW264.7细胞(加或不加H_2O_2处理)24 h上清液。取第7代MC3T3-E1细胞,分别以100μL无血清DMEM培养基(A组)、未氧化应激RAW264.7细胞上清液(B组)、氧化应激RAW264.7细胞上清液(C组)培养,采用MTS法检测细胞增殖情况,行划痕实验检测细胞迁移能力;另取细胞分为4组,空白对照组,以完全培养基培养;阳性对照组,以含50μg/m L维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基进行成骨诱导培养;正常对照组,以含50μg/m L维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基及未氧化应激RAW264.7细胞上清液培养;实验组,以含50μg/m L维生素C及10 nmol/L的β甘油磷酸钠的完全培养基及氧化应激RAW264.7细胞上清液培养。培养3、7、14 d,RT-PCR检测细胞内成骨相关基因ALP、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)表达水平。结果 MTS和SOD检测结果显示:25μmol/L H_2O_2刺激1 h为构建RAW264.7细胞氧化应激模型最佳浓度和作用时间。细胞生长检测显示:1、2、3 d B、C组细胞增殖率显著高于A组(P0.05),C组低于B组,其中2、3 d时组间比较差异有统计学意义(P0.05)。划痕实验显示12 h时B、C组MC3T3-E1细胞迁移显著快于A组,C组快于B组,细胞迁移距离比较差异有统计学意义(P0.05);24 h时B、C组划痕已被细胞爬满。除3 d外,实验组各时间点ALP、Runx2、OC、BSP m RNA相对表达量均较阳性对照组明显降低,OPN、COL-Ⅰm RNA相对表达量较空白对照组降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 H_2O_2构建RAW264.7细胞氧化应激模型的最佳浓度为25μmol/L、作用时间为1 h。氧化应激活化RAW264.7巨噬细胞上清液能促进MC3T3-E1成骨细胞迁移、抑制其增殖及成骨相关基因的表达。     

沉默中介体复合物亚基19基因对人膀胱癌细胞UM-UC3迁移能力的影响

目的探讨中介体复合物亚基19(Med19)对人膀胱癌UM-UC3细胞迁移能力的影响及其机制。方法采用针对Med19的siRNA慢病毒载体转染人膀胱癌UM-UC3,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹方法(Western blot)检测Med19-siRNA转染组(siRNA)与空载组(NC)Medl9基因表达情况;采用Western blot检测细胞外基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达;采用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力的变化。结果 Medl9-siRNA慢病毒感染UM-UC3细胞后,转染组Medl9mRNA表达与空载组相比明显降低,差异有统计学意义(t=10.15,P0.01),且转染组Med19、MMP-2和MMP-9蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(t值分别为71.36,26.34,8.627,均P0.01),划痕实验和Transwell实验显示转染组细胞迁移能力明显减弱。结论沉默Med19基因可通过抑制MMP-2和MMP-9的表达降低人膀胱癌细胞UM-UC3的迁移能力。     

利用Label-free技术筛选MC3T3-E1细胞中miR-381-3p介导的靶蛋白和差异蛋白生物学功能分析

目的 比较小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)实验组(MC3-E1-in)与对照组(MC3-E1-NC-in)的蛋白质组学差异水平,以初步探究miR-381-3p所介导的靶蛋白和相关信号通路以及差异蛋白生物学功能分析.方法 通过细胞慢病毒转染构建实验模型,分为实验组与对照组;实时荧光定量PCR验证miR-381-3p在细...     

白桦脂醇拮抗地塞米松诱导成骨细胞内脂质积聚影响细胞凋亡的实验研究

目的观察白桦脂醇和地塞米松共同作用于小鼠MC3T3-E1细胞后,内源性脂质蓄积与细胞凋亡中的关系。方法以MC3T3-E1细胞为研究对象,采用白桦脂醇和地塞米松共同作用于MC3T3-E1细胞,测定细胞内甘油三酯含量;NileRed荧光染色观察脂质蓄积情况;流式细胞技术测定成骨细胞凋亡率;ELISA法检测Caspase-3酶活性;采用Spearman等级相关进行脂质含量与成骨细胞凋亡相关性分析。结果白桦脂醇和地塞米松共同作用于小鼠MC3T3-E1细胞后,0.5μmol/L地塞米松(B组)与1.0μmol/L地塞米松组(C组)较空白组(A组),细胞凋亡率、Caspase-3酶活性均明显增高(P0.05),细胞内甘油三酯含量明显增加。2.0μg/ml白桦脂醇作用细胞后,地塞米松所致的细胞凋亡率上升与Caspase-3酶活性升高受到明显抑制,同时细胞内的甘油三酯蓄积降低。Spearman等级相关分析表明地塞米松诱导后的成骨细胞内脂质含量与细胞凋亡率呈正相关,r=0.412,P0.05。结论白桦脂醇可显著减轻地塞米松诱导的成骨细胞内脂质蓄积,降低细胞凋亡率;提示地塞米松所致细胞凋亡至少部分与细胞内脂质蓄积有关。     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

多靶点沉默SOST基因修饰MC3T3-E1细胞注射对小鼠椎体微结构的影响

目的 利用多靶点SOST基因沉默技术修饰小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1,并将其注射到小鼠体内,观察其对小鼠椎体骨密度及微结构的影响。方法 取18只18月龄雌性C57BL/6小鼠在无菌条件下手术切除双侧卵巢制作骨质疏松模型,并分为3组（n=6）：SOST基因沉默组注射采用多靶点SOST基因沉默技术修饰并同时转染CRISPR-sgRNA载体系统和SOST-RNAi修复模板载体假病毒颗粒的MC3T3-E1细胞;阴性组注射同时转染CRISPR-sgRNA载体系统和SOST-N修复模板载体假病毒颗粒的MC3T3-E1细胞;空白组注射不作任何处理的MC3T3-E1细胞。采用HE染色和Masson三色染色观察小鼠椎体骨小梁面积的变化,免疫组化染色观察骨组织中骨保护素（OPG）和RANKL表达的变化,实时荧光定量PCR检测观察各组细胞SOST及骨代谢相关细胞因子（RUNX2、β-catenin、RANKL、OPG）的表达变化。结果 L₁ HE染色和L₂ Masson三色染色结果显示,SOST基因沉默组骨小梁面积大于阴性组和空白组,差异均有统计学意义（P < 0.05）。L₂免疫组织化学染色结果显示,SOST基因沉默组OPG表达量高于阴性组和空白组,RANKL表达量低于阴性组和空白组,差异均有统计学意义（P < 0.05）。L₃实时荧光定量PCR检测结果显示,SOST基因沉默组SOST和RANKL表达量低于阴性组,RUNX2、β-catenin和OPG表达量高于阴性组,差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论 多靶点沉默SOST基因修饰MC3T3-E1细胞尾静脉注射能够促进小鼠成骨细胞分化和分泌功能,抑制破骨细胞活性,有效改善小鼠椎体微结构。     

WNT6在BMSCs增殖、迁移和成骨分化中的作用

目的探讨WNT6对BMSCs增殖、成骨分化和迁移能力的影响。方法取小鼠BMSCs培养至30%~50%融合时,分别行WNT6沉默及过表达观察。WNT6沉默实验分为3组,分别为转染WNT6特异性sh RNA组(A1组)、转染对照sh RNA组(B1组)、未转染的正常细胞组(C1组)。过表达观察实验分为3组,分别为转染WNT6重组表达质粒组(A2组)、转染空载体组(B2组)、未转染的正常细胞组(C2组)。倒置显微镜下观察细胞形态,A1、B1、A2、B2组筛选稳定转染细胞;于转染后48 h取细胞,采用实时荧光定量PCR检测WNT6m RNA表达,Western blot检测WNT6及Ki73蛋白表达,Transwell法检测细胞迁移,MTT法检测细胞增殖;C1、C2组培养后相同时间点取细胞进行以上观测。各组细胞经成骨诱导培养12 d,检测ALP活性及钙沉积量。结果倒置显微镜下,A1、B1、C1组及A2、B2、C2组细胞形态基本一致。A1组WNT6 m RNA及蛋白、Ki67蛋白表达、细胞增殖及细胞迁移数目、ALP活性以及钙沉积量均显著低于B1、C1组,差异均有统计学意义(P0.05),B1、C1组间比较差异均无统计学意义(P0.05);而A2组以上各指标均显著高于B2、C2组,差异均有统计学意义(P0.05),B2、C2组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 WNT6能促进小鼠BMSCs增殖和迁移,并增强其成骨分化能力。     

Transwell小室内建立小鼠成骨-破骨细胞共培养体系

目的 :Transwell小室内建立体外小鼠成骨-破骨细胞共培养体系,并检测体系对成骨及破骨细胞活性的影响。方法:体外培育小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞后,于Transwell小室内建立成骨-破骨细胞共培养体系。通过CCK-8实验、茜素红染色、TRAP染色检测细胞的成骨、破骨活性。采用PCR、Western Blot方法检测成骨细胞MC3T3-E1中OPG、ALP、RANKL、TGF-b1的基因表达以及RANKL的蛋白表达,检测破骨细胞RANK、NF-κB的基因表达和蛋白表达。结果 :小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系;共培养体系影响小鼠成骨细胞与破骨细胞的分化活性,镜下可见成骨细胞分化增多,破骨细胞分化稍减少。共培养体系中成骨细胞基因OPG(0.65±0.08)、ALP(0.16±0.01)较单独培养OPG(1.00±0.08)、ALP(1.01±0.16)表达下降,而TGF-b1(4.42±0.21)、RANKL(4.12±1.04)较单独培养组TGF-b1(1.00±0.10)、RANKL(1.00±0.09)表达上升;破骨细胞相关RANK(0.63±0.06)、NF-κB(0.64±0.08)基因表达较单独培养组的RANK(1.00±0.08)、NF-κB(1.00±0.09)下降,差异均有统计学意义。同时共培养组的OPG(0.43±0.05)、NF-κB(0.59±0.05)的蛋白表达较单独培养组的OPG(0.84±0.06)、NF-κb(1.13±0.03)减少;共培养组RANKL(0.54±0.03)的蛋白表达则较单独培养组的RANKL(0.31±0.03)增加,差异有统计学意义,均与基因表达变化趋势一致。结论:小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系,共培养体系中成骨细胞活性高于破骨细胞活性。     

抑制COL6A1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:研究小干扰RNA抑制COL6A1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:设计合成靶向COL6A1基因的siRNA,采用阳离子脂质体试剂瞬时转染膀胱癌细胞株T24,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰后COL6A1基因的沉默效果,评价siRNA设计的合理性及RNA干扰抑制COL6A1表达的有效性,分别在RNA干扰后第1、2、3天应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖状态,并绘制生长曲线,应用Transwell法检测各组膀胱癌侵袭能力。结果:靶向COL6A1的siRNA成功抑制了膀胱癌细胞株T24中COL6A1 mRNA及蛋白表达,COL6A1-siRNA组蛋白相对表达量为阴性对照组的14.1%,mRNA相对表达量为空白对照组的20.5%;MTT比色法显示COL6A1-siRNA组细胞增殖能力显著减弱(P0.05),在第1、2、3天后重复检测,分别达到了空白对照组的75.6%、58.2%和49.4%;Transwell细胞迁移实验显示COL6A1-siRNA组细胞迁移能力明显减弱(P0.05),穿膜细胞数为空白对照组的45.3%。结论:利用siRNA技术能有效降低COL6A1基因的表达,同时有效抑制T24细胞的体外增殖和侵袭的能力。     

钙磷涂层镁合金CaP-AZ31B对小鼠前成骨细胞生物学性能的影响

目的研究钙磷涂层镁合金Ca P-AZ31B对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1生物学性能的影响。方法实验分为镁合金(AZ31B)组、钛合金组和Ca P-AZ31B组,观察MC3T3-E1细胞在3组材料表面2、6、24 h的细胞黏附率;倒置显微镜观察MC3T3-E1细胞与3组材料浸提液共培养1、3、5、7 d的细胞形态,同时采用CCK法和BCA法检测其细胞增殖活力和细胞内总蛋白。结果随着培养时间的延长,3组材料的细胞黏附率、细胞增殖活力、细胞内总蛋白量均显著增加(P0.05)。其中Ca P-AZ31B组2、6、24 h细胞黏附率钛合金组AZ31B组(P0.05);MC3T3-E1细胞在3组材料浸提液中贴壁均良好,大多呈长梭形;Ca P-AZ31B组各时相点细胞增殖活力均优于AZ31B组(P0.05);细胞内总蛋白量比较,Ca P-AZ31B组钛合金组AZ31B组(P0.05)。结论与镁合金、钛合金相比,钙磷涂层镁合金材料可明显增强小鼠成骨细胞的黏附能力和增殖能力,促进细胞内总蛋白的表达,具有良好的生物相容性。     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P0.05),D组低于C组(P0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。     

痩素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的初步探讨瘦素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖及骨保护蛋白、核因子κB激活受体配体mRNA表达的影响。方法以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为体外实验模型,用MTT法检测瘦素作用MC3T3-E1细胞后的增殖情况,RT-PCR方法检测OPG、RANKL mRNA表达。结果瘦素（10、20、40、80和160ng.mL-1）作用于MC3T3-E1细胞24h后,可促进其增殖,OD值显著增加（P〈0.01）,增加骨保护蛋白mRNA表达,同时降低核因子κB激活受体配体mRNA表达,且呈浓度依赖性。结论瘦素促进MC3T3-E1细胞增殖,同时通过调节骨保护蛋白mRNA和核因子κB激活受体配体mRNA的表达,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究北大核心CSCD

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P<0.05),D组低于C组(P<0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P<0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P<0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P<0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P<0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P<0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P<0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。     

STIM1调控Ras信号通路促进成骨细胞增殖的研究

目的成骨细胞增殖的抑制导致成骨细胞数量减少是骨质疏松症发生发展的重要原因。之前的研究发现介导受体依赖性钙离子内流的钙通道蛋白Orai1在调控成骨细胞增殖、分化、凋亡等细胞功能有非常重要的作用。STIM1是一类可激活Orai1的重要蛋白。然而,至今还未见STIM1是否参与调控成骨细胞增殖相关报道。本研究旨在明确STIM1是否参与调控成骨细胞增殖。方法应用靶向STIM1的siRNA在MC3T3-E1成骨细胞中沉默STIM1的表达,然后用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测细胞周期变化、Real-Time PCR检测CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK6的转录水平,并用Western Blot检测Ras信号通路活性。结果我们转染靶向STIM1的siRNA后,MC3T3-E1细胞中STIM1的表达和转录均明显降低(P0.05);接着,我们发现在MC3T3-E1细胞中沉默STIM1的表达后,MC3T3-E1细胞增殖抑制并且细胞周期阻滞在G0/G1期,并且调控细胞增殖的细胞周期蛋白CyclinD1的转录水平也显著下降(P0.05);进一步研究发现,在MC3T3-E1细胞沉默STIM1的表达后,明显抑制了钙离子依赖的Ras信号通路的活性(P0.05)。应用ARS-853抑制Ras信号通路的活性后,明显抑制了STIM1促进成骨细胞增殖的作用(P0.05)。结论 STIM1激活Ras信号通路发挥促进成骨细胞增殖的作用。     

抑制核纤层蛋白A/C表达对牵张刺激下成骨细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制核纤层蛋白A/C(lamin A/C)表达对牵张刺激下小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖及凋亡的影响.方法 化学合成3条针对lamin A/C靶点的siRNA序列,脂质体转染MC3T3-E1细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测lamin A/C mRNA和蛋白变化.细胞转染72 h后行牵张刺激6 h,Hoechst 33258检测DNA含量来反映细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及凋亡.结果 筛选出的siRNA-2显著抑制lamin A/C mRNA和蛋白产物表达(P＜0.01).未转染细胞经牵张刺激,DNA合成随时间推移而增加;细胞G0/G1期比例为65.19%;S期为22.57%,细胞凋亡率为11.49%;转染细胞经牵张刺激后,DNA合成较未转染细胞显著性减少(P＜0.01);G0/G1期比例提高至85.82%;S期降低至11.37%,凋亡率达19.32%(P＜0.01).结论 抑制lamin A/C表达会导致牵张刺激诱导的促增殖作用减弱,细胞周期阻滞于G0/G1期,促进细胞的凋亡.     

黄瓜籽总皂苷对MC3T3-E1细胞分化及SPARC、OPG/RANKL表达的影响

目的观察黄瓜籽总皂苷提取物(cucumber seed saponins,CSS)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响,以及与骨质疏松相关的SPARC、OPG/RANKL/RANK信号通路的作用。方法通过MTT实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色,考察不同浓度CSS对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响;采用RT-PCR方法检测SPARC、OPG/RANKL mRNA表达水平; Western blot检测SPARC、OPG/RANKL的蛋白表达量。结果与阳性对照组相比,CSS能明显促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05),CSS高、中剂量组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性及钙化结节数量(P0.05);与空白组相比,CSS不同剂量组均明显上调SPARC、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达水平(P0.05)。结论黄瓜籽总皂苷能够促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化能力,并通过上调SPARC、OPG/RANKL的表达水平提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的 观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对 成骨细胞增殖、分化的影响。方法 小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10mmol/Lβ-甘 油磷酸和50μg /mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、 200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨 相关转录因子(Runx2) 、锌指结构转录因子(Osterix) 、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性 磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的 表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论 高铁培养环境可明显抑制小鼠 前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。