辛伐他汀动员干细胞归巢对大鼠脊髓损伤的修复作用及其机制

目的:观察辛伐他汀动员骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)归巢至脊髓损伤部位对损伤脊髓的修复作用,并探讨其相关机制。方法:成年雌性SD大鼠30只,经尾静脉注射移植大鼠转绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的BMSCs,24h后随机分为3组:假手术组,仅切除椎板,不损伤脊髓;对照组,脊髓损伤后经蛛网膜下腔注射载体;实验组,脊髓损伤后经蛛网膜下腔注射辛伐他汀。每组10只。对照组和实验组采用改良Allen法(40g.cm)制作T9~T10节段脊髓损伤模型,从L4水平蛛网膜下腔注射辛伐他汀(5mg/kg)或载体。术前及术后1d、3d、7d、14d、21d、28d时盲法进行BBB评分和斜板试验;术后28d处死大鼠,取相应节段脊髓组织行形态计量学观察脊髓空腔体积大小;应用神经元核抗原(NeuN)/神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)与GFP免疫荧光双染法观察移植GFP-BMSCs的迁移及细胞分化情况;Western blot检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)表达水平的变化。结果:术后各时间点假手术组动物BBB评分及斜板试验角度无明显变化,实验组及对照组BBB评分及斜板试验角度明显降低,术后7d、14d、21d、28d时实验组BBB评分高于对照组(P<0.05);术后14d、21d、28d时实验组大鼠的斜板试验角度高于对照组(P<0.05)。术后28d时假手术组脊髓内未见空腔,实验组和对照脊髓损伤部位均可见空洞形成,实验组空腔体积(0.29±0.08mm3)小于对照组(0.57±0.10mm3)(P<0.05);荧光显微镜下观察实验组在脊髓损伤周边可见大量表达绿色荧光的细胞,而对照组和假手术组很少。免疫荧光染色实验组NeuN(+)/GFAP(+)、GFP(+)/GFAP(+)细胞明显多于对照组和假手术组(P<0.05)。Western blot显示治疗组大鼠损伤处脊髓BDNF和VEGF表达高于对照组和假手术组(P<0.05)。结论:辛伐他汀可动员BMSCs归巢至脊髓损伤部位并参与损伤修复,其作用可能与其促进BDNF及VEGF高表达有关。     

骨髓基质干细胞移植联合应用G-CSF对大鼠脊髓损伤修复的影响

[目的]探讨骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)移植联合应用粒细胞集落刺激因子(granulocyt colony stimulating factor,G-CSF)对大鼠脊髓损伤的治疗修复作用。[方法]48只Wistar大鼠采用改良的Allen’s装置在T11水平制成大鼠脊髓损伤模型,随机分成4组(n=12):A组为BMSCs移植联用G-CSF组,B、C组为单纯BMSCs移植组和G-CSF治疗组,D组为损伤对照组。术后1、2、3、4周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分评价大鼠后肢神经功能恢复情况,术后4周取材HE染色观察,免疫荧光染色检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)的表达变化。[结果]术后1~4周,A组评分均明显高于其他3组,D组最低,差异均有统计学意义(P0.01);B组术后3、4周高于C组(P0.01)。HE与免疫荧光染色显示,BMSCs联合应用G-CSF对脊髓损伤的修复作用最好,D组恢复最差,B、C组介于A、D组之间。A组在脊髓损伤区及周缘NSE、NF 200阳性细胞均较B组多,C组未见明显的NSE、NF 200阳性细胞,但在损伤周缘有大量的GFAP阳性细胞,并向脊髓损伤空腔内延伸;D组损伤区看见大量结构杂乱的GFAP阳性细胞,瘢痕组织形成明显,损伤区未见明显的脊髓再生现象及NSE、NF-200阳性细胞。[结论]BMSCs移植能在脊髓损伤周围存活并分化;移植联用G-CSF更能促进神经修复及功能的恢复;二者联用具有协同作用。     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF基因和血管生成的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后运动功能恢复、VEGF基因表达和血管生成的影响,探讨BMSCs治疗SCI的机制。方法取5只4周龄Wistar雄性大鼠骨髓,分离培养BMSCs,取第3～4代细胞进行实验。取Wistar雌性成年大鼠87只,体重220～250 g,随机分为假手术组(A组,21只)、DMEM注射组(B组,33只)和BMSCs移植组(C组,33只)。A组仅咬除T8～10棘突和椎板;B、C组参照Nystrom方法制备T8～10 SCI模型,伤后30 min C组注射BMSCs(共3.0×105个),B组注射等量DMEM。于术后3、7、14、28 d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能;术后3、7、14、28 d应用Ⅷ因子免疫组织化学染色行微血管计数观测血管生成情况;术后1、3、5 d应用RT-PCR法检测损伤脊髓组织内VEGF mRNA的表达。结果术后各时间点B、C组大鼠后肢功能随时间延长均有不同程度恢复,各时间点BBB评分与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,C组BBB评分显著高于B组(P<0.05),其余时间点B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d,B、C组损伤周围区脊髓灰质腹侧角内微血管数目明显少于A组(P<0.05);术后7、14、28 d与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组术后3、7 d脊髓灰质腹侧角内微血管数目与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);但术后14、28 d显著高于B组(P<0.05)。各组术后各时间点损伤周围区脊髓白质内的微血管数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测示,A组大鼠脊髓组织内VEGF mRNA表达水平较低。B、C组与A组相比,于术后1 d开始VEGF mRNA表达增加,3 d时表达达峰值,5 d时表达下降但仍高于A组,各时间点与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);C组各时间点均高于B组(P<0.05)。结论 BMSCs可能通过上调VEGF基因表达和增加脊髓内新生血管而促进大鼠SCI后运动功能恢复。     

表达VEGF的重组腺相关病毒对大鼠创伤性脊髓损伤的保护作用及其机制研究

目的探讨表达VEGF的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)对大鼠创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用及其机制。方法取144只成年雄性SD大鼠(体重200～250 g)随机分为4组,每组36只。假手术组(A组)仅手术暴露脊髓。模型对照组(B组)、rAAV-绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)组(C组)、rAAV-hVEGF165-GFP组(D组)制备创伤性SCI大鼠模型,术后即刻分别予以20μL生理盐水、rAAV-GFP病毒、rAAV-hVEGF165-GFP病毒脊髓注射治疗。术后3、7 d采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能变化;术后7 d通过脊髓组织尼氏小体染色观察脊髓组织病理学变化,脊髓组织神经元透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色观察脊髓神经元凋亡,Western blot检测水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP-4)表达;术后1、3、5、7 d ELISA法检测VEGF165蛋白表达。结果 BBB评分显示术后3、7 d D组神经功能较B、C组显著改善(P<0.05)。尼氏小体染色显示术后7 d D组脊髓组织结构破坏明显轻于B、C组(P<0.05)。ELISA检测显示D组VEGF165蛋白表达呈低剂量缓释表达,术后3、5、7 d,D组VEGF165蛋白表达均高于其他3组(P<0.05)。透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色结果显示术后7 d D组脊髓神经元凋亡较B、C组显著减少,凋亡率显著低于B、C组(P<0.05)。Western blot结果显示术后7 d D组脊髓组织AQP-4蛋白表达明显较B、C组减少(P<0.05)。结论表达VEGF的rAAV通过抗神经元凋亡及减轻脊髓水肿对大鼠创伤性SCI起保护作用。     

重组人红细胞生成素治疗大鼠急性脊髓损伤的用药时间窗探讨

目的:探讨腹腔注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)治疗大鼠急性脊髓损伤(ASCI)的用药时间窗.方法:采用显微血管夹夹伤雌性SD大鼠T10脊髓建立脊髓急性损伤模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组8只.A、B、C、D组分别于损伤后即刻、1h、3h和6h腹腔注射rHuEPO 50001U/kg,E组损伤后立即腹腔注射等量生理盐水,作为对照组.各组大鼠于术后1d、3d、5d、7d进行BBB运动学评分,并于术后3d、7d用TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色法检测各组大鼠脊髓神经细胞凋亡情况.结果:术后1d、3d各组大鼠BBB评分无统计学差异(P>0.05);5d时A、B、C三组BBB评分均高于D、E两组(P<0.01),A、B、C 三组间与D、E组间无统计学差异(P>0.05);7d时D组BBB评分高于E组(P<0.01),但低于A、B、C三组(P<0.01),而A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05).损伤后3d、7d,A～D组的TUNEL、caspase-3染色阳性细胞均高于E组,且损伤后7d时D组TUNEL染色阳性细胞数高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异;损伤后3d.D组caspase-3染色细胞阳性率高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05),损伤后7d,A～D组间无统计学差异(P>0.05).结论:大鼠ASCI后3h内给予rHuEPO可以显著改善运动功能恢复情况,并抑制伤后脊髓神经细胞凋亡现象的发生;伤后6h给药效果较差.     

银杏叶提取物对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的作用及其机制

目的:观察银杏叶提取物(EGb)对大鼠实验性脊髓损伤后组织结构及运动功能恢复的作用,探讨其对急性脊髓损伤的作用机制。方法:120只SD雄性大鼠,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、甲基强的松龙(MP)治疗组(C组)和EGb治疗组(D组),每组30只。B、C、D组用Allen′s法以50g·cm致伤大鼠T9脊髓制作损伤模型,B组为单纯脊髓损伤,不给药;C组为脊髓损伤后30min内,由腹腔注入MP30mg/kg;D组为术后至处死前每天腹腔给予EGb17.5mg/kg;A组只打开T9椎板,不打击脊髓,不给药。术后24h、3d、5d、7d、14d对大鼠进行脊髓运动功能(BBB)评分。于术后24h、3d、5d、7d、14d处死动物(n=6),取T9节段脊髓,切片苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓大体组织结构变化,用免疫组织化学方法检测B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)在脊髓前角运动神经元中的表达变化情况。结果:各时间点B、C、D组大鼠脊髓运动功能(BBB)评分均显著低于A组(P<0.01),伤后7d、14d时C、D组评分显著高于B组(P<0.05),各时间点C组与D组评分比较无统计学意义(P>0.05)。HE染色C组和D组大鼠脊髓损伤区较B组坏死程度轻、形成囊腔少,A组正常;1周后D组较C组片状出血灶少,神经细胞肿胀不明显。各时间点B、C、D组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bcl-2阳性细胞数均显著高于A组(P<0.01),C、D组显著高于B组(P<0.01),7d、14d时D组显著高于C组(P<0.05);各时间点B、C、D组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bax阳性细胞数均显著高于A组(P<0.01),C、D组显著低于B组(P<0.01),7d、14d时D组显著低于C组(P<0.01)。结论:EGb可能通过抑制Bax表达、提高Bcl-2表达,抑制脊髓损伤后神经元凋亡,在运动功能恢复、损伤脊髓组织保护上发挥其有益作用,1周后EGb仍能抑制脊髓损害后的继发性损伤。     

BMSCs移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复的影响. 方法 从2011年3月至7月,采用全骨髓差速贴壁培养法进行SD大鼠BMSCs的体外分离与培养;利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)建立大鼠T11脊髓损伤模型,建模成功后将大鼠随机分为4组:对照组(A组)、电针组(B组)、BMSCs移植组(C组)、联合组(D组).SCI后1周,C组与D组大鼠自尾静脉注射移植BMSCs悬液0.1 ml,A组与B组自大鼠尾静脉注射无血清的DMEM/F12培养液0.1 ml,B组与D组接受督脉电针治疗,1次/天.于SCI后1、2、4、8周采用BBB评分法进行后肢运动功能评分;于SCI后8周采用SEP检测脊髓传导功能,采用HE染色观察脊髓空洞大小,采用免疫组化染色检测神经丝蛋白(NF200)的表达.实验中获得的数据采用单因素方差分析. 结果 SCI后2、4、8周,与A组比较,B、C、D组BBB评分均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组BBB评分升高更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,与A组比较,B、C、D组SEP潜伏期缩短、波幅增高,差异有统计学意义(p＜0.05);与R、C组比较,D组SEP潜伏期更短,波幅更高,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,4组大鼠脊髓组织损伤区均可见组织结构紊乱,细胞肿胀,空泡变性,且损伤区均可见瘢痕组织及空洞形成,其中A组脊髓空洞最大,B组和C组次之,D组最小.SCI后8周,4组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达,与A组比较,B、C、D组NF200阳性表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组NF200阳性表达更强,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 BMSCs移植联合督脉电针对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的促进作用更为显著,优于单纯BMSCs移植和督脉电针治疗.     

红花黄素腹腔注射联合BMSCs移植对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的 探讨红花黄素腹腔注射联合骨髓阳J充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤保护作用及其机制.方法 体外分离、培养BMSCs;SD大鼠45只,改良Allen法制备脊髓损伤模型,随机分为3组:A组、B组、C组.A组腹腔注射红花黄素治疗(40 mg/kg),B组和C组注射等体积的生理盐水,每日1次,共14 d;A组和B组损伤局部行BMSCs移植(6×106/60μl),C组注射等体积的PBS液.于术后1 d、2 d、3 d、4 d、7 d取材检测损伤处超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞凋亡,术后1 d和7 d、14 d、21 d、28 d采用改良BBB评分法进行行为学检查评分.结果 术后随着时间的推移,各组BBB评分得分均增高,术后28 d时A组得分为(19.33±1.37),B组为(15.83±1.17),C组为(9.0±1.41),A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).SOD活性在相同时间点,均有A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);MDA含量在术后2 d、3 d、4d A组低于B组和C组(P＜0.05),且有A组低于B组(P＜0.05).术后3 d时各组细胞凋亡达高峰:A组(72.83±13.38),B组(96.33±6.35),C组(219.33±28.64);之后各组细胞凋亡数逐渐减少,至术后7d:A组(3.67±3.72),B组(16.33±5.54),C组(86.17±12.27);除术后第1天,在相同时间点,细胞凋亡数有A组少于B组和C组,B组少于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 红花黄素和BM-SCs移植均能抑制损伤脊髓局部自由基生成、脂质过氧化和细胞凋亡,减轻继发损伤,两者联合具有累加协同效应,有助于脊髓损伤大鼠肢体运动功能的恢复.     

低氧预处理骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究

目的:研究低氧预处理骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对大鼠急性脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)治疗效果的影响并探讨其可能的机制。方法:转绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的SD大鼠10只,体重55.6±4.2(50～60)g,通过改良全骨髓贴壁法从大鼠骨髓中分离培养大鼠BMSCs并进行并进行细胞纯度和分化能力鉴定。应用0、10、50、100、200和300μM的二氯化钴(CoCl2)低氧预处理BMSCs后,通过CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响,细胞血清剥夺培养0、6、12和24h后,流式细胞法检测血清剥夺对细胞凋亡的影响,Transwell法检测低氧对BM-MSCs培养6、12、24h后细胞迁移的影响,流式细胞法检测低氧对细胞凋亡的影响,PCR法检测相关分子通路,找出合适的低氧处理条件。体内实验,使用Allen法垂直打击建立SCI模型,实验分为A组(假手术组)、B组(对照组)、C组(BMSCs组)和D组(H-BMSCs组)(n=20)。A组的大鼠进行外科手术,但不锤击脊髓,B、C和D组均进行锤击脊髓行SCI造模和蛛网膜下腔注射注射生理盐水和低氧预处理前后的BMSCs。通过术前,术后1、3、7、10、14、21、28天BBB评分研究大鼠的神经功能恢复,术后72h免疫荧光染色法确定移植细胞的存活情况和小胶质细胞激活情况,术后72h和28d HE染色评估脊髓组织病理损伤情况。结果:CCK-8结果表明CoCl2浓度越高对BMSCs增值能力抑制越大,100μM CoCl2培养24h可以明显降低BMSCs增殖(P0.05),提高BMSCs的凋亡(P0.05),但能够显著增强预处理后BMSCs 6和12h后的细胞迁移的数量(P0.05),显著降低细胞血清剥夺培养24h后细胞凋亡率(P0.05)。动物实验,与B组相比,C组的治疗可显著提高14d、21d和28d的BBB评分(P0.05)。D组的BBB评分在21d和28d时明显高于C组(P0.05)。HE染色结果显示,BMSC移植可以显著减少脊髓损伤部位细胞死亡,出血和炎性细胞浸润,而与C组相比,D组中的脊髓病理学损伤更轻微。细胞移植72h后,在C组和D组中均可见绿色荧光细胞,且绿色荧光的细胞数量D组(254.0±35.5)中明显高于C组(143.2±22.3,P0.05)。SCI 72h后Iba-1免疫荧光染色显示,与B组(759.0±114.3)相比,BMSC(544.8±37.1)和D组(422.4±56.0)小胶质细胞数明显减少(P0.05),且D组抑制小胶质细胞激活的能力更强(P0.05)。结论:低氧预处理BMSCs通过提高移植细胞的存活率,增强抑制小胶质细胞的激活能力,提高了SCI后大鼠神经功能的恢复,机制为低氧预处理能够增强细胞的抗损伤和迁移能力,是一种提高BMSCs移植治疗SCI疗效的有效手段。     

胶原支架结合脑源性神经营养因子移植促进全横断脊髓损伤大鼠轴突再生及运动功能恢复的研究

目的评价胶原支架结合脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)移植修复大鼠全横断脊髓损伤的效果。方法将32只成年雌性SD大鼠随机分成4组(n=8):A组为假手术组,只暴露T_9、T_(10)段脊髓;B、C、D组切除长4 mm的T_9、T_(10)段脊髓后,C、D组分别于损伤处植入相应长度的线性有序胶原支架(linear ordered collagen scaffolds,LOCS)和结合了胶原结合结构域(collagen binding domain,CBD)-BDNF的LOCS。术前及术后3个月内每周对大鼠进行BBB运动功能评分。术后3个月,实施神经电生理检测各组大鼠运动诱发电位(motor evoked potential,MEP);然后于L_2段脊髓组织注射荧光金(fluorogold,FG)实施逆行示踪,1周后取大鼠大脑及胸、腰段脊髓组织,脱水后观察脊髓组织形态;取包含损伤区的胸、腰段脊髓组织作切片。其中,脊髓冠状切片于激光共聚焦显微镜下进行观察,计算FG阳性细胞积分吸光度(IA)值;胸段脊髓组织水平切片采用免疫荧光染色,观察全横断脊髓损伤造模情况、脊髓损伤区轴突再生情况、D组再生轴突的突触形成情况。结果术后各时间点B、C、D组BBB评分均显著低于A组(P0.05);术后2～12周D组BBB评分均明显高于B、C组(P0.05)。电生理检测示,B组未观测到MEP;C、D组MEP潜伏期显著长于A组,C组显著长于D组,差异均有统计学意义(P0.05)。脊髓组织形态观察示,B组脊髓损伤区域向两端延伸,损伤部位组织破坏严重;C、D组脊髓形态恢复较好,D组更接近正常组织形态。逆行示踪结果显示,各组大鼠损伤区以下的腰段脊髓灰质中均充满了FG阳性细胞;在损伤区以上的胸段脊髓中,A组FG阳性区域IA值显著大于B、C、D组(P0.05),C、D组大于B组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。免疫荧光染色示,自同一脊髓背侧至腹侧选出的组织切片显示了明显异于正常组织的全横断脊髓损伤区域。A组NF阳性轴突数明显多于B、C、D组,C、D组多于B组,D组多于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 LOCS结合CBD-BDNF移植可以促进大鼠全横断脊髓损伤后轴突再生以及后肢运动功能恢复。     

柴胡皂苷a对大鼠急性脊髓损伤的神经保护作用与机制研究

目的探讨柴胡皂苷a(saikosaponin a,SSa)对大鼠急性脊髓损伤早期机体免疫炎性水平的影响,并研究其可能存在的影响机制。方法取健康成年雌性SD大鼠72只,体质量220~250 g,随机分为假手术组(A组)、脊髓损伤组(B组)、SSa处理组(C组),每组24只。A组仅咬除棘突和椎板暴露脊髓;B、C组利用改良Allen重物打击法制作急性脊髓损伤模型,造模后即刻C组给予大鼠腹腔注射10 mg/kg SSa,B组注入等量生理盐水。术后24 h每组处死18只大鼠并取出脊髓组织,采用ELISA法检测TNF-α和IL-6浓度,Western blot检测NF-κB P65、NF-κB P-P65和水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)蛋白表达水平,HE染色观察脊髓组织形态;每组其余6只大鼠分别于术后1、3、7、14、21、28 d采用BBB评分和斜板实验评价大鼠双下肢运动恢复情况。结果术后各时间点A组BBB评分和斜板实验最大角度均显著高于B、C组(P0.05),术后14、21、28 d C组上述指标显著高于B组(P0.05)。ELISA检测示,A组TNF-α、IL-6浓度显著低于B、C组,C组显著低于B组,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,A组NF-κB P65、NF-κB P-P65和AQP4蛋白表达水平显著低于B、C组,C组显著低于B组,差异均有统计学意义(P0.05)。HE染色示,A组脊髓中神经细胞正常,无明显病变;B组脊髓中损伤部位可见神经元细胞,损伤处有出血、中性粒细胞浸润、神经细胞水肿;C组脊髓中可见神经元细胞,小胶质细胞轻度增生,病变较B组好转。结论 SSa通过抑制NF-κB信号通路和AQP4蛋白的表达,减轻急性脊髓损伤后机体炎性反应和组织水肿,从而具有一定保护神经的功能。     

红花黄素腹腔注射联合BMSCs移植对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的 探讨红花黄素腹腔注射联合骨髓阳J充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤保护作用及其机制.方法 体外分离、培养BMSCs;SD大鼠45只,改良Allen法制备脊髓损伤模型,随机分为3组:A组、B组、C组.A组腹腔注射红花黄素治疗(40 mg/kg),B组和C组注射等体积的生理盐水,每日1次,共14 d;A组和B组损伤局部行BMSCs移植(6×106/60μl),C组注射等体积的PBS液.于术后1 d、2 d、3 d、4 d、7 d取材检测损伤处超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞凋亡,术后1 d和7 d、14 d、21 d、28 d采用改良BBB评分法进行行为学检查评分.结果 术后随着时间的推移,各组BBB评分得分均增高,术后28 d时A组得分为(19.33±1.37),B组为(15.83±1.17),C组为(9.0±1.41),A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).SOD活性在相同时间点,均有A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);MDA含量在术后2 d、3 d、4d A组低于B组和C组(P＜0.05),且有A组低于B组(P＜0.05).术后3 d时各组细胞凋亡达高峰:A组(72.83±13.38),B组(96.33±6.35),C组(219.33±28.64);之后各组细胞凋亡数逐渐减少,至术后7d:A组(3.67±3.72),B组(16.33±5.54),C组(86.17±12.27);除术后第1天,在相同时间点,细胞凋亡数有A组少于B组和C组,B组少于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 红花黄素和BM-SCs移植均能抑制损伤脊髓局部自由基生成、脂质过氧化和细胞凋亡,减轻继发损伤,两者联合具有累加协同效应,有助于脊髓损伤大鼠肢体运动功能的恢复.     

红花黄素腹腔注射联合BMSCs移植对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的 探讨红花黄素腹腔注射联合骨髓阳J充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤保护作用及其机制.方法 体外分离、培养BMSCs;SD大鼠45只,改良Allen法制备脊髓损伤模型,随机分为3组:A组、B组、C组.A组腹腔注射红花黄素治疗(40 mg/kg),B组和C组注射等体积的生理盐水,每日1次,共14 d;A组和B组损伤局部行BMSCs移植(6×106/60μl),C组注射等体积的PBS液.于术后1 d、2 d、3 d、4 d、7 d取材检测损伤处超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和细胞凋亡,术后1 d和7 d、14 d、21 d、28 d采用改良BBB评分法进行行为学检查评分.结果 术后随着时间的推移,各组BBB评分得分均增高,术后28 d时A组得分为(19.33±1.37),B组为(15.83±1.17),C组为(9.0±1.41),A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).SOD活性在相同时间点,均有A组高于B组和C组,B组高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);MDA含量在术后2 d、3 d、4d A组低于B组和C组(P＜0.05),且有A组低于B组(P＜0.05).术后3 d时各组细胞凋亡达高峰:A组(72.83±13.38),B组(96.33±6.35),C组(219.33±28.64);之后各组细胞凋亡数逐渐减少,至术后7d:A组(3.67±3.72),B组(16.33±5.54),C组(86.17±12.27);除术后第1天,在相同时间点,细胞凋亡数有A组少于B组和C组,B组少于C组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 红花黄素和BM-SCs移植均能抑制损伤脊髓局部自由基生成、脂质过氧化和细胞凋亡,减轻继发损伤,两者联合具有累加协同效应,有助于脊髓损伤大鼠肢体运动功能的恢复.     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的时效性分析

目的：观察脊髓损伤后不同时间点骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗后大鼠行为学变化、脊髓的病理改变及脑源性神经营养因子（brain—derived neurotrophic factor,BDNF）和神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）表达变化,探讨BMSCs的最佳移植时间。方法：80只健康成年SD大鼠随机分为8组,每组10只。A组为假损伤组,暴露胸10段脊髓但不造成冲击伤,B、C、D、E、F、G、H组以改良Allen法建立脊髓损伤模型。造模成功后,C、D、E、F、G、H组分别于损伤后0h、6h、24h、3d、5d和7d,将lxl0。体外培养的BMSCs用微量注射器注入于脊髓损伤局部,B组为单纯造模组,用等量细胞培养液代替。各组分别于损伤后1、2、4周进行脊髓运动功能BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）运动学评分;分别取各组脊髓损伤组织0．5cm,制作HE染色病理切片,观察其形态学改变;Elisa法检测各组大鼠脊髓BDNF和NGF表达情况。结果：假手术组1、2、4周大鼠脊髓功能BBB评分均明显高于其余7组（P〈0．01）;术后l周细胞移植各组评分与单纯造模组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;术后2周和4周细胞移植各组评分高于单纯造模组（P〈0．05）;损伤后2周BBB评分从高到低依次为F、E、G、D、H、C组,但6组组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）;损伤后4周BBB评分,F组与其余5组（C,D,E,G,H组）比较差异有统计学意义（P〈0．05）,但其余5组组间差异无统计学意义（P〉O．05）。EUSA检测结果显示,F组BDNF和NGF含量均高于其他7组（P〈0．05）。大鼠脊髓标本切片HE染色,假手术组脊髓组织结构完整清楚,无中性粒细胞浸润;其余7组局部组织水肿明显,灰白质交界处模糊,周围可见不同程度胶质细胞增生及炎细胞浸润。结论：大鼠脊髓损伤后同种异体BMSCs移植对脊髓功能恢复有一定疗效,损伤后3d可能是BMSCs最佳移植时间。     

转染胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响

目的:探讨转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响。方法:取SD雌性大鼠的双侧股骨,冲洗髓腔分离培养得到的BMSCs,通过荧光素标记技术检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45,以确认是否得到BMSCs。构建GDNF过表达慢病毒用以感染BMSCs,加入感染分数分别为10、50、80、100、150、200的重组慢病毒悬液。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况以表达细胞数量,评价转染效果,Western blot检测转染后GDNF在BMSCs中的表达,以四唑蓝比色法(MTT)法检测转染GDNF基因的BMSCs的细胞活力。将50只SD大鼠通过Allen′s打击法制备脊髓打击伤模型,造模成功后随机分为三组:A组(20只)为单纯BMSCs组,使用微量注射器移植未转染的BMSCs;B组(20只)为BMSCs转染组,使用微量注射器移植转染GDNF基因的BMSCs;C组(10只)为模型对照组,造模后脊髓内注射DMEM培养基。于造模后7d、14d、28d对大鼠进行BBB运动功能评分。各组均于造模后7d、14d、28d各取5只麻醉处死灌注取材后行HE染色并镜下观察。A、B两组采用免疫组织化学染色观察GFAP、NSE、NF-200在脊髓内的表达,以评估神经轴突生长情况。结果:经分离培养得到的细胞呈长纺锤状,以类似成纤维细胞样集落生长。流式细胞术测定结果示所培养的细胞阳性高度表达CD29、CD90,未表达CD34、CD45,表明分离培养所得细胞为BMSCs。当MOI=100时,转染12h后,BMSCs显著表达GFP,提示转染成功。Western blot结果示GDFP表达情况良好。MTT法显示转染7d后BMSCs组细胞活力明显高于未转染BMSCs组。术后7d时,三组BBB评分无显著差异。术后14d,B组的BBB评分5.80±0.19分与A组3.60±0.18分及C组3.10±0.14分相比均有显著性差异(P0.05)。术后28d,B组的BBB评分11.90±0.28分与A组8.30±0.29分及C组5.70±0.18分相比有显著性差异(P0.05)。GFAP、NSE、免疫组化染色光密度统计结果均显示A组和B组有显著性差异,B组明显优于A组,具有统计学意义(P0.05)。NF-200神经纤维长度统计结果提示B组为89.98±28.31μm,A组为23.64±13.45μm,两组之间存在显著差异(P0.05)。结论:GDNF转染BMSCs具有较高的细胞活性,能够提升BMSCs促进神经轴突再生的能力。     

辛伐他汀促进脊髓损伤后神经功能修复的实验研究

目的:探讨脊髓损伤后急性期应用辛伐他汀对大鼠脊髓神经功能修复的影响。方法:成年雌性SD大鼠32只,假手术组(A组)8只,只做椎板切除,不损伤脊髓,不给药,重物坠落法制作脊髓损伤模型24只,损伤大鼠随机分为三组:羧甲基纤维素钠溶液组(B组)、5mg/kg辛伐他汀治疗组(C组)和10mg/kg辛伐他汀治疗组(D组)(n=8)。术后1d开始灌胃给予辛伐他汀每天一次,连续治疗5周。术后1d、3d以及1～8周,进行BBB评分、斜板试验评价大鼠脊髓神经功能,在第8周时电生理检测大鼠运动及感觉功能的恢复情况,随后处死取材,病理学检查(Luxol fast blue染色)观察残余髓鞘情况。结果:术后2周时,BBB评分D组高于B组(P<0.05);建模3周～8周,BBB评分D组及C组均高于B组(P<0.05),且D组最高(P<0.05)。建模3周时,斜板试验D组及C组均大于B组(P<0.05),且4周～8周,D组角度均大于C组(P<0.05)。感觉诱发电位检查发现,D组,C组的潜伏期小于B组(P<0.05),且D组波幅高于B组(P<0.05)。病理学检查,D组,C组比B组有更多的髓鞘残余(P<0.05)。结论:辛伐他汀急性期治疗脊髓损伤可以促进大鼠损伤脊髓神经功能修复。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

【摘要】 目的：研究经蛛网膜下腔给予表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后神经功能恢复的影响及其作用机制。方法：成年雌性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,假手术组（A组）仅切除椎板;对照组（B组）SCI后,蛛网膜下腔注射同体积载体溶液;10mg/kg EGCG治疗组（C组）SCI后经蛛网膜下腔注射EGCG 10mg/kg;20mg/kg EGCG治疗组（D组）SCI后经蛛网膜下腔注射EGCG 20mg/kg。改良Allen法（40g·cm）制作T10节段SCI模型,L4水平蛛网膜下腔注射EGCG或载体溶液。术前、术后1d、术后3d及术后1、2、3、4周进行盲法BBB评分、斜板试验;术后4周时处死大鼠,病理学检查（Luxol fast blue染色）观察脊髓损伤部位残余髓鞘情况;免疫组化及Western blot法检测胶质细胞源性营养因子（GDNF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、Bcl-2和Bax的表达水平。结果：A组术前及术后各时间点BBB评分均为21分,斜板试验角度无明显变化;术后各时间点B、C组和D组BBB评分及斜板试验角度均小于A组（P＜0.05）;术后1d、3d时,B、C组和D组BBB评分以及斜板试验角度无统计学差异（P＞0.05）;术后1、2、3、4周时,C、D组的BBB评分及斜板试验角度均大于B组（P＜0.05）,C组的BBB评分及斜板试验角度与D组比较均无统计学差异（P＞0.05）。术后4周时,B、C、D组大鼠脊髓损伤部位的髓鞘残余面积均小于A组（P＜0.05）,C、D组明显大于B组（P＜0.05）,在损伤脊髓中心D组明显大于C组（P＜0.05）。术后4周时免疫组化检查,B、C、D组的BDNF、GDNF、Bcl-2和Bax的阳性表达强于A组,C、D组的BDNF、GDNF和Bcl-2的阳性表达强于B组,Bax的阳性表达弱于B组。术后4周时Western blot法检测,B、C、D组的BDNF、GDNF、Bcl-2和Bax的表达高于A组（P＜0.05）;C、D组的BDNF和GDNF表达明显高于B组（P＜0.05）,C组与D组无统计学差异（P＞0.05）;C、D组的Bcl-2表达明显高于B组（P＜0.05）,C组与D组比较无统计学差异（P＞0.05）;C组和D组的Bax表达明显低于B组（P＜0.05）,D组明显低于C组（P＜0.05）。结论：EGCG可有效促进大鼠SCI后的神经功能恢复,其机理可能与髓鞘的丢失减少、神经营养因子BDNF和GDNF的表达上调及细胞凋亡被抑制等有关。     

去铁胺促进BMSCs靶向归巢和血管新生的实验研究

目的应用低氧模拟剂去铁胺(desferrioxamine,DFO)模拟组织缺氧环境,观察其是否能促进BMSCs在大鼠随意皮瓣中的归巢和血管新生。方法分离、培养荧光素酶转基因Lewis大鼠的BMSCs和成纤维细胞(fibroblast,FB)。选用4周龄Lewis雄性大鼠40只,在其背部形成10 cm×3 cm大小矩形皮瓣,然后随机分成4组,每组10只:A组于大鼠球后静脉丛注射200μL PBS;B、C组同上法分别注射浓度为1×10~6个/mL的FB和BMSCs 200μL;D组同C组方法注射BMSCs后,腹腔注射DFO[100 mg/(kg·d)],连续7 d。术后7 d,观察各组大鼠皮瓣成活情况并计算皮瓣成活率,采用激光散斑血流成像仪检测皮瓣血流情况;术后30 min及1、4、7、14 d采用生物发光成像检测移植细胞在大鼠体内分布情况;术后7 d行CD31免疫荧光染色计算毛细血管密度,免疫荧光检测基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)、EGF、FGF及Ki67的表达情况;利用荧光素酶抗体标记移植的BMSCs,免疫荧光染色观察其是否参与损伤组织修复。结果术后7 d各组缺血皮瓣坏死边界已明确,C、D组皮瓣成活率明显高于A、B组,D组高于C组(P0.05)。激光散斑血流成像仪检测示,C、D组皮瓣血流值显著高于A、B组,D组高于C组(P0.05)。生物发光成像示BMSCs随时间变化逐渐向缺血缺氧区迁移,最终分布到缺血组织中;术后14 d D组的光子信号明显强于其他组(P0.05)。CD31免疫荧光染色示,C、D组毛细血管密度显著高于A、B组,D组高于C组(P0.05)。C、D组SDF-1、EGF、FGF及Ki67的表达明显强于A、B组,D组强于C组。术后7 d移植的荧光素酶标记BMSCs表达于组织的动脉弹力层、毛细血管处和毛囊处。结论 DFO可以加速BMSCs向随意皮瓣缺氧区域的迁移归巢,加速BMSCs在缺血组织中的分化,同时促进缺血组织血管新生。     

嗅鞘细胞联合VEGF对大鼠损伤脊髓的保护作用

目的探讨嗅球源性嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植联合鞘内重复注射VEGF对损伤脊髓功能恢复的促进作用,以及二者对神经元和神经纤维的协同保护作用。方法取新生2～3 d大鼠嗅球分离纯化培养OECs,于培养9 d用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞。将75只成年雌性Wistar大鼠(体重200～250 g)随机分为5组,A组为假手术组,仅行椎板切除术。B、C、D、E组采用重力打击法制作脊髓损伤模型后,B组术后1 d于脊髓损伤部位分4点共注射DMEM-F12无血清培养基10μL,并每天2次鞘内注射生理盐水10μL,持续1周;C组同上法分别注射DMEM-F12培养基10μL及重组大鼠VEGF165(recombined rat VEGF165,rrVEGF165)25 ng;D组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及生理盐水10μL;E组注射含1×105个OECs的DMEM-F12培养基10μL及rrVEGF165 25 ng。术后1 d及术后1～8周每周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分标准评定大鼠后肢功能恢复情况;术后8周处死实验动物,取材行透射电镜、HE染色观察,并行p75NGF受体(p75 NGF receptor,p75NGFR)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspases-3)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)免疫组织化学染色,评价损伤脊髓修复情况。结果术后E组大鼠后肢功能恢复较快,8周时BBB评分显著高于其余各组(P<0.05)。透射电镜和HE染色显示:B组有髓神经纤维和神经元受损严重;C、D组损伤轻于B组;E组受损最轻,断端间残存组织较多,有髓神经纤维髓鞘较完整,神经元呈多角形,有少量空泡化的线粒体。免疫组织化学染色示,B、C、D、E组Caspase-3阳性细胞数显著多于A组(P<0.05),B、D组明显多于C、E组(P<0.05),C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。C、E组vWF阳性血管数多于A、B、D组(P<0.05),但C、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。D、E组均可见p75NGFR阳性OECs。结论 OECs移植联合鞘内重复注射VEGF可显著促进大鼠脊髓损伤修复,部分恢复损伤神经功能,对受损神经纤维和神经元的变性有保护作用,且二者有协同作用。     

自体注射型富血小板纤维蛋白联合BMSCs治疗大鼠坐骨神经损伤的实验研究

目的探讨自体注射型富血小板纤维蛋白(injectable platelet rich fibrin,i-PRF)联合BMSCs治疗大鼠坐骨神经损伤的疗效。方法取10～15日龄SD乳鼠胫骨骨髓分离培养BMSCs至第4代备用。取24只成年SD大鼠眶后静脉血采用改良低速离心法制备i-PRF后,采用改良挤压损伤法制作坐骨神经Ⅲ度损伤模型后随机分为4组,每组6只。A、B、C、D组分别于损伤部位鞘膜内注射BMSCs悬液+自体i-PRF、自体i-PRF、BMSCs悬液、生理盐水。术后1～8周每周采用BBB评分法评价大鼠患肢神经功能恢复情况;术后2个月处死各组大鼠取材,行HE染色观察坐骨神经组织结构变化,透射电镜观察神经纤维、髓鞘、细胞核等细微结构改变,Western blot检测N-cadherin、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达。结果术后大鼠均未发生免疫排斥反应及死亡。术后1周各组大鼠BBB评分比较差异无统计学意义(P0.05);术后2～8周,A组BBB评分显著高于B、C、D组,B、C组显著高于D组(P0.05),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。HE染色示,A组神经纤维排列整齐,无缺损及脱髓鞘改变;B组神经纤维结构欠清晰,轻度肿胀;C组神经纤维部分结构紊乱,局部脱髓鞘改变;D组神经纤维连续性欠佳,明显脱髓鞘改变,神经外膜部分缺损。透射电镜观察示,A组神经纤维结构清晰,髓鞘完整,细胞核致密;B组较A组稍次之;C组神经纤维结构模糊,有脱髓鞘改变;D组神经纤维结构紊乱,有脱髓鞘改变,神经外膜连续性中断。Western blot检测示,各组Nestin蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P0.05)。B、C、D组N-cadherin蛋白相对表达量显著低于A组,C、D组低于B组,D组低于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。B、C、D组GFAP蛋白相对表达量显著低于A组,D组显著低于B、C组,差异有统计学意义(P0.05);B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论自体i-PRF与BMSCs联合使用可有效治疗大鼠坐骨神经损伤。