细菌16S rRNA在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎中的应用

目的 评价荧光定量PCR检测腹水细菌16S rRNA基因在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中的临床应用价值.方法 用细菌16S rRNA基因荧光定量PCR法检测64例非中性粒细胞性腹水疑似自发性细菌性腹膜炎患者及6例慢性肝病伴非感染性腹水患者腹水中的细菌DNA,同时与腹水细菌培养结果进行对比.结果 细菌16S rRNA荧光定量PCR最低可检测到10个拷贝的DNA复制,检测细菌的阳性率明显高于细菌培养的阳性率,分别为15.63%和3.13%,两组差异有统计学意义(x2=5.52,P＜0.05).6例非感染性腹水荧光定量PCR及细菌培养均阴性.结论 腹水细菌16S rRNA荧光定量PCR检测细菌的特异性强、敏感性高,在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中具有重要的临床应用价值.     

贵州省死亡病例1型猪链球菌的分离及分子生物学特征分析

目的 对来自贵州省1例疑似人感染猪链球菌患者的血液标本进行细菌分离鉴定,了解该菌株的分子生物学特征,为病例的快速确诊提供病原学依据。方法 采用血培养法对疑似感染猪链球菌患者的血液进行细菌分离培养,对分离菌株采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增和DNA序列测定,将测序结果通过GenBank数据库的BLAST程序进行在线比对,再用猪链球菌种特异的16S rRNA 基因进行猪链球菌种的鉴定,进一步分别采用PCR检测常见强致病性血清型1、2、7和9型特异的cps 1j、cps 2j、cps 7h和cps9h基因以鉴定其血清型,并对菌株毒力基因gapdh、mrp、sly和ef进行检测。结果 血培养分离出1株链球菌可疑菌株,序列比对结果显示该分离菌株16S rRNA基因与猪链球菌的同源性最高,进一步的猪链球菌特异性PCR检测显示分离菌株16S rRNA基因为阳性,血清型特异PCR检测结果显示cps 1j基因为阳性,而cps 2j、cps 7h和cps 9h基因为阴性,毒力基因检测结果显示分离菌株gapdh,sly和ef毒力基因为阳性,而mrp为阴性。结论 本次从疑似感染猪链球菌死亡病例分离的菌株为猪链球菌1型,其毒力特征为gapdh、sly和ef基因阳性,mrp基因阴性,该病例为1型猪链球菌感染所致,且菌株毒力较强。     

荧光定量PCR基因检测在心血管病患者术后血流感染的诊断应用北大核心CSCD

目的建立16SrRNA基因荧光定量PCR方法检测心血管病患者术后血流感染的诊断技术,以提高临床细菌检测的准确性及敏感性,缩短检测细菌的时间。方法 2010年4月-2012年3月医院对411例术后疑为血流感染的标本进行常规血液培养,同时进行细菌16SrRNA基因的检测,包括DNA提取、设计引物和探针、聚合酶链反应(PCR)扩增及对扩增产物荧光定量检测,比较二者的诊断阳性率、敏感性和特异性,数据采用SPSS11.0软件进行统计分析。结果荧光定量PCR方法检测血流感染的阳性患者182例,阳性率为44.3%,明显高于血液培养的15.6%,差异有统计学意义(P<0.01);若以血液培养阳性和(或)临床诊断血流感染的标准作为对照,PCR的诊断敏感性为87.9%、诊断特异性为90.6%。结论荧光定量16SrRNA基因检测的阳性率远高于血液培养,可为心血管病患者术后血流感染提供早期、敏感的病原学诊断依据。     

抗生素应用对16S rRNA基因芯片检测腹水细菌的影响

目的 评价抗生素的应用是否影响基因芯片(寡核苷酸序列分析)检测腹水细菌16S rRNA 基因在自发性细菌性腹膜炎(SBP)诊断中的应用.方法 采用16S rRNA PCR-基因芯片检测76例临床疑似SBP肝病患者的腹水细菌16S rRNA基因,与同期患者的腹水细菌培养相比,分析两种不同检测方法对应用抗生素(31例)和未应用抗生素(45例)患者的细菌阳性率的差异.结果 76份疑似SBP患者的腹水样本中,基因芯片检测阳性率22.37％(17份),明显高于腹水细菌培养阳性率的7.89％(6份),两种方法差异有统计学意义( x2=18.05,P＜0.01).应用抗生素组腹水细菌基因芯片检测阳性率为19.35％(6份),略低于未应用抗生素组的24.44％(11份),但两组差异无统计学意义( x2=0.274,P＞ 0.05).应用抗生素组腹水细菌培养阳性率为0(0/31),而未应用抗生素组阳性率为13.33％(6/45),两组差异有统计学意义(x2=4.488,P＜0.05).结论 16S rRNA PCR-基因芯片检测腹水细菌与腹水培养相比可能更少受抗生素应用的影响.     

荧光定量PCR基因检测在心血管病患者术后血流感染的诊断应用

目的建立16SrRNA基因荧光定量PCR方法检测心血管病患者术后血流感染的诊断技术,以提高临床细菌检测的准确性及敏感性,缩短检测细菌的时间。方法 2010年4月-2012年3月医院对411例术后疑为血流感染的标本进行常规血液培养,同时进行细菌16SrRNA基因的检测,包括DNA提取、设计引物和探针、聚合酶链反应(PCR)扩增及对扩增产物荧光定量检测,比较二者的诊断阳性率、敏感性和特异性,数据采用SPSS11.0软件进行统计分析。结果荧光定量PCR方法检测血流感染的阳性患者182例,阳性率为44.3%,明显高于血液培养的15.6%,差异有统计学意义(P<0.01);若以血液培养阳性和(或)临床诊断血流感染的标准作为对照,PCR的诊断敏感性为87.9%、诊断特异性为90.6%。结论荧光定量16SrRNA基因检测的阳性率远高于血液培养,可为心血管病患者术后血流感染提供早期、敏感的病原学诊断依据。     

新疆石河子地区绵羊嗜吞噬细胞无形体的检测和16S rRNA序列分析

目的 调查新疆石河子地区绵羊嗜吞噬细胞无形体感染状况以及分析其病原16S rRNA序列特征.方法 在石河子地区采集羊血,提取DNA,巢式PCR扩增16S rRNA基因并与GenBank中相应基因序列进行比对分析.结果 在109份羊血样本中,检测出阳性样本37份,阳性率为33.94％,检测出的16S rRNA(524 bp)基因序列与部分GenBank中嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列同源性达99％.结论 新疆石河子地区绵羊中存在嗜吞噬细胞无形体的感染.     

巢式PCR用于疑似莱姆病患者血清标本检测的研究

目的 研究rrf(5S)～rrl(23S)rRNA基因间隔区巢式PCR用于疑似莱姆病患者血清标本的检测效果.方法 收集疑似莱姆病患者血清标本及其流行病学和临床资料,提取DNA进行巢式PCR、普通PCR检测.结果 共收集102份疑似莱姆病患者血清,巢式PCR检测阳性39例,阳性率为38.23％,其中蜱叮咬时间在2个月内的为33例,占84.62％;普通PCR只有1份阳性,阳性率为0.98％,远低于巢式PCR(38.23％).结论 rrf(5S)～rrl(23S)rRNA基因间隔区巢式PCR可用于疑似莱姆病患者血清标本检测,从病原学角度支持莱姆病的诊断.     

16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的应用

目的 建立基于16S rRNA基因的聚合酶链反应(PCR)细菌学检测方法,以指导临床快速诊断新生儿败血症.方法 以细菌16S rRNA基因为靶序列,利用计算机软件设计合成所有细菌保守区共有的一对通用引物,通过PCR扩增已知10株实验室保存菌株、人类基因组DNA、巨细胞病毒、白色假丝酵母菌和空白对照,并对其灵敏度和特异性作一评价.结果 对所测已知10株实验室保存菌株均获得920 bp扩增产物,其与人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无交叉阳性反应;PCR阳性率为26.8％,血培养阳性率为11.3％,两者比较有差异有统计学意义(P＜0.05),PCR灵敏度高于血培养.结论 与血培养比较,PCR具有检测速度快、特异性及敏感度高等特点.     

实时荧光定量PCR检测痰标本中军团菌属

目的建立荧光定量PCR方法,用于检测军团菌属特异性16S rRNA基因,并探讨广州地区军团菌属感染状况。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,对广东省中医院采集的532例肺部感染患者痰液标本进行检测。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属细菌检测结果均为阴性;检测灵敏度为102CFU/ml,临床检测532例肺部感染患者的痰液标本,荧光法检出军团菌阳性43例,阳性率为8.08%,16S rRNA PCR法加基因测序验证阳性率为7.71%,两者检测结果差异无统计学意义,表明其具有较好的符合性和等效性。结论 16S rRNA基因荧光定量PCR法检测患者痰液标本中军团菌属,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌属感染调查及快速检测。     

肺部感染患者军团菌属感染的调查

目的调查肺部感染患者嗜肺军团菌血清Ⅰ型(LENⅠ)尿抗原及军团菌属16S rRNA基因的阳性率。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增肺部感染患者尿液中军团菌属特异性16S rRNA基因,酶免疫法(EIA)检测其尿液中LENⅠ抗原。结果对213例患者进行LENⅠ尿抗原检测,其中10例阳性,阳性率为4.7%,对其进行军团菌属16S rRNA基因PCR扩增,同样有10例阳性,阳性率为4.7%,2种检测方法同时阳性的有3例;以LENⅠ特异性尿抗原或尿液中军团菌属特异性基因扩增结果任一阳性作为军团菌属感染的判定标准,军团菌属感染阳性率为8.0%。结论肺部感染患者中存在一定程度的军团菌属感染,可采用尿抗原及PCR技术进行检测。     

Broad-range PCR: Past,present, or future of bacteriology?

PCR targeting the gene encoding 16S ribosomal RNA (commonly named broad-range PCR or 16S PCR) has been used for 20 years as a polyvalent tool to study prokaryotes. Broad-range PCR was first used as a taxonomic tool, then in clinical microbiology. We will describe the use of broad-range PCR in clinical microbiology. The first application was identification of bacterial strains obtained by culture but whose phenotypic or proteomic identification remained difficult or impossible. This changed bacterial taxonomy and allowed discovering many new species. The second application of broad-range PCR in clinical microbiology is the detection of bacterial DNA from clinical samples; we will review the clinical settings in which the technique proved useful (such as endocarditis) and those in which it did not (such as characterization of bacteria in ascites, in cirrhotic patients). This technique allowed identifying the etiological agents for several diseases, such as Whipple disease. This review is a synthesis of data concerning the applications, assets, and drawbacks of broad-range PCR in clinical microbiology.     

应用通用引物PCR检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值

目的了解细菌和真菌性中枢神经系统（CNS）感染病原谱,并探讨通用引物聚合酶链反应（PCR)检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊CNS细菌或真菌性感染患者资料,分析其脑脊液培养病原菌种类,采用细菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物对患者脑脊液DNA进行PCR扩增和序列测定,并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似CNS细菌或真菌感染者400例,其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株,其中革兰阳性菌48株,革兰阴性菌90株,真菌12株;居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌（32株）、凝固酶阴性葡萄球菌（16株）和肺炎克雷伯菌（13株）;最常见真菌为新生隐球菌（8株）。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行PCR扩增,PCR扩增法灵敏度（35.23％,31/88）高于培养法（28.41%,25/88）（χ2＝4.17,P＜0.05）。PCR扩增和培养法阴性预测值分别为25.97%、24.10%,两种方法的特异度、阳性预测值均为100.00%。PCR扩增测序与培养结果符合率为84.00%（21/25）;PCR检测平均报告时间（48 h）较培养结果报告时间（细菌平均约72 h,真菌平均约96 h）更快速。结论CNS 感染病原分布广泛,以革兰阴性菌为主;通用引物PCR检测具有快速、灵敏、准确等特点,具有良好的临床推广和应用价值。     

Comparative analysis of the composition of bacterial communities from two constructed wetlands for municipal and swine wastewater treatment

This work provides information about bacterial community structure in natural wastewater treatment systems treating different types of wastewater. The diversity and composition of bacterial communities associated with the rhizosphere of Typha latifolia and Salix atrocinerea were studied and compared among two different natural wastewater treatment systems, using the direct sequencing of the 16S ribosomal RNA codifying genes. Phylogenetic affiliations of the bacteria detected allowed us to define the main groups present in these particular ecosystems. Moreover, bacterial community structure was studied through two diversity indices. Ten identified and five non-identified phyla were found in the samples; the phylum Proteobacteria was the predominant group in the four ecosystems. The results showed a bacterial community dominated by beta-proteobacteria and a lower diversity value in the swine wastewater treatment system. The municipal wastewater treatment system presented a high diverse community in both macrophytes (Typha latifolia and Salix atrocinerea), with gamma-proteobacteria and alpha-proteobacteria, respectively, as the most abundant groups.     

Footrot on a sheep breeding farm in the Himalayan state of Jammu and Kashmir

In the present study ovine footrot was detected clinically on a sheep farm in the Himalayan state of Jammu and Kashmir. Dichelobacter nodosus was confirmed by culture and polymerase chain reaction (PCR) using species-specific 16S ribosomal RNA primers. When cultured, the organism appeared as flat colourless colonies having a fine granulated structure with irregular margins, and showing characteristic Gram-negative rods with swollen ends. Detection by PCR from cultured bacteria resulted in amplification of a 783 base pairs (bp) product. Serogrouping by multiplex PCR using group (A-I)-specific primers revealed the presence of serogroup B-specific bands of 283 bp.     

乳酸杆菌及嗜热链球菌脉冲场凝胶电泳分子分型方法建立及应用

目的 建立乳酸杆菌及嗜热链球菌的PFGE分子分型方法,并对北京市售酸奶中分离的乳酸杆菌及嗜热链球菌进行分子分型.方法 选取ApaⅠ、NotⅠ、sfiⅠ、XbaⅠ和SmaⅠ共5种PFGE分析中常用的限制性内切酶,对从北京市售酸奶中分离到的52株乳酸杆菌、嗜热链球菌以及相应的标准菌株进行酶切,优化PFGE限制性内切酶种类及电泳条件,并用优化出的实验条件对菌株进行分子分型,同时进行聚类分析,与生化鉴定及16s rRNA基因鉴定结果进行对比分析.结果 限制性内切酶NotⅠ对保加利亚乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌和德氏乳酸杆菌的酶切效果较好,而限制性内切酶Apa Ⅰ对嗜热链球菌、嗜酸乳酸杆菌及干酪乳酸杆菌的酶切效果较好.24株保加利亚乳酸杆菌被分为8个PFGE型,15株嗜热链球菌被分为8个PFGE型,7株嗜酸乳酸杆菌被分为3个PFGE型,2株德氏乳酸杆菌分属于2个不同的PFGE型.结论 建立的PFGE方法分析结果与生化鉴定及16s rRNA基因鉴定结果高度符合,所建方法适用于乳酸杆菌及嗜热链球菌的分子分型.     

细菌核糖体23 S亚单位基因芯片在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的研究建立快速检测细菌DNA的方法,建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型. 方法使用合成的扩增细菌核糖体23 S亚单位(23S rDNA)寡核苷酸探针,制备基因芯片;设计23S rDNA通用引物,应用PCR(聚合酶链反应)法,扩增细菌核糖体23S亚单位基因(23S rDNA),扩增后产物与芯片上的探针杂交,用荧光扫描仪检测信号;对23种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用本方法进行检测,并与常规细菌培养法比较. 结果基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性. 结论利用寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力,比常规培养法快速、准确.     

Evaluation of bacterial flora in contaminated soil as a countermeasure against H2S gas production

Gas productions in illegal dumping sites and waste landfills have caused serious problems. The gas production was induced by bacterial flora inhabited soils. In order to construct a culture independent evaluation system of the soil bacteria, bacterial communities were analyzed quantitatively and qualitatively, about 16 soil samples at 4 sites, both using culture and culture-independent methods. The real time PCR method was developed for counting total bacterial number. Sequencing analysis of 16S rDNA amplified by a direct PCR method revealed that non-spore forming sulfate reducing bacteria and sulfur-oxidizing bacteria were detected at a similar frequency at an illegal dumping site near mountains. On the other hand, spore-forming sulfate reducing bacteria and Clostridium sp. were mainly detected in deep samples at reclaimed landfills from the sea, whereas sulfur-oxidizing bacteria was hardly detected. The result regarding sulfate-reducing bacteria was confirmed also by an anaerobic culture method. Culture-independent molecular analyses of soil bacteria would give us useful information for prediction of gas production and for the evaluation of soil equilibrium.     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。