人腹膜间皮细胞的分离培养

目的体外增减的人腹膜间皮细胞（ＨＰＭＣ）是研究腹膜功能的有用模型,我们为此建立了一种改良消化法,以从人大网膜分离腹膜间皮细胞。方法用０．２％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡＮa2消化大网膜组织碎片,细胞悬液经１００目筛网滤过后进行培养;瑞士姬姆萨染色观察细胞形态,计算细胞纯度;免疫组化（ＡＢＣ法）监定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路长鹅卵石状,纯度达９５％以上。细胞表面标志监定显示角蛋白、波形蛋白抗     

人腹膜间皮细胞的分离培养

目的体外培养的人腹膜间皮细胞（ＨＰＭＣ）是研究腹膜功能的有用模型,我们为此建立了一种改良消化法,以从人大网膜分离腹膜间皮细胞。方法用０．２％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡＮａ２消化人大网膜组织碎片,细胞悬液经１００目筛网滤过后进行培养：瑞士姬姆萨染色观察细胞形态,计算细胞纯度：免疫组化（ＡＢＣ法）鉴定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状,纯度达９５％以上。细胞表面标志鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞ＣＤ４５抗原阴性,证实分离培养的确是ＨＰＭＣ。结论胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离ＨＰＭＣ的方法。     

人腹膜间皮细胞的原代培养及传代

目的探讨建立一种有效的HPMC体外原代培养及传代的方法。方法用0.25%的胰蛋白酶0.02%EDTANa2消化腹部择期手术者大网膜组织,细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养。采用形态学、免疫组织化学（ABC法）、电镜等鉴定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路样鹅卵石状,免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,电镜下可见细胞表面的微绒毛,证明培养的细胞的为HPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简单实用的培养HPMC的方法 。     

大鼠腹膜间皮细胞的分离培养方法

目的建立简便有效的大鼠腹膜间皮细胞(passage of rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)的体外培养方法。方法采用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化大鼠大网膜及脾胃韧带,细胞悬液进行离心培养,沉淀重悬后进行培养。通过形态学、免疫荧光、免疫组化法鉴定细胞。结果分离培养的细胞在光镜下呈铺路鹅卵石状,免疫荧光鉴定显示细胞角蛋白阳性,免疫组化鉴定显示波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,证实培养的细胞为RPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简便而实用的分离RPMC的方法。     

改良法培养鼠腹膜间皮细胞

目的：建立一种从腹腔灌注消化液分离鼠腹膜间皮细胞的培养模型。方法：用0.125%的胰蛋白酶－0.01％EDTA Na2消化液注入鼠腹腔，抽取腹腔灌注液进行培养，采用相差`镜电镜和免疫组化鉴定间皮细胞。结果：分离并培养的细胞融合后在相差显微镜下呈铺路卵石状，纯度达95％以上。电镜下可见丰富的微绒毛。免疫组化鉴定角蛋白和波形蛋白阳性。Ⅷ因子和白细胞CD45抗原阴性。结论：鼠腹膜间皮细胞培养模型建立成功，该模型可为进一步研究腹膜透析并纤维化的防治提供实验基础。     

葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研究

目的:了解葛根素对体外培养的人腹膜间皮细胞增殖活性、氧化应激和转移生长因子-β1(TGF-β1)分泌的影响.方法:体外培养人腹膜间皮细胞,分对照组,腹膜透析液(PDS)组及葛根素1、2、3组(葛根素终浓度依次为50、100、200μg·ml-1)5组观察.检测各组间皮细胞的增殖活性,上清MDA、SOD、GSH水平以及TGF-β1的含量并进行比较.结果:在PDS干预下腹膜间皮细胞MTT还原能力明显下降,上清液MDA水平较对照组显著升高,SOD、GSH水平较对照组显著降低.葛根素组MDA水平显著低于PDS组,SOD、GSH水平显著高于PDS组.腹膜间皮细胞在PDS干预下分泌TGF-β1较对照组显著增加,葛根素组TGF-β1分泌与PDS组比较有显著下降.结论:葛根素可以拮抗商业性PDS对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用,可以抑制氧化应激和TGF-β1分泌.     

改良法培养鼠腹膜间皮细胞

目的 :建立一种从腹腔灌注消化液分离鼠腹膜间皮细胞的培养模型。方法 :用 0 .12 5 %的胰蛋白酶 - 0 .0 1%EDTANa2 消化液注入鼠腹腔 ,抽取腹腔灌注液进行培养 ,采用相差显微镜、电镜和免疫组化鉴定间皮细胞。结果 :分离并培养的细胞融合后在相差显微镜下呈铺路卵石状 ,纯度达 95 %以上。电镜下可见丰富的微绒毛。免疫组化鉴定角蛋白和波形蛋白阳性 ,Ⅷ因子和白细胞CD4 5抗原阴性。结论 :鼠腹膜间皮细胞培养模型建立成功 ,该模型可为进一步研究腹膜透析并纤维化的防治提供实验基础     

人腹膜间皮细胞的培养及特征

目的：建立人腹膜间皮细胞（HPMC）培养模型,检测HPMC细胞外基质蛋白及白细胞介素（IL－8）的表达。方法：采用胰蛋白酶－EDTA消化法,从人的腹膜组织中分离HPMC。采用形态学和链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连接法（即SP法）,对培养细胞进行鉴定。采用SP法检测HPMC纤维连接蛋白（FN）、胶原Ⅲ和胶原Ⅴ及转化生长因子（TGF）β1表达。采用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）检测HPMC IL－8 mNRA和FN mRNA的表达。结果：光镜示细胞融合后呈多边形,超微结构下可见丰富的微绒毛和内质网,免疫组化染色结果示HPMC可表达角蛋白,波形蛋白,胶原Ⅲ,FN,TGFβ1蛋白,Ⅷ因子、胶原Ⅴ表达阴性。人腹膜间皮细胞亦表达FN mRNA和IL－8 mRNA。结论：HPMC培养模型的建立,可为进一步研究腹膜纤维化的防治及IL－8在腹膜透析中的作用提供理论依据。     

高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白的影响

目的研究高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白（connexin43）表达的影响。方法分离培养人腹膜间皮细胞,细胞分为3组：正常糖组（含5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（含140mmol／L葡萄糖）和渗透压对照组（含5．5mmol／L葡萄糖加24．5mmol／L甘露醇）,培养24、48h后,应用Northernblot、Westernblot方法检测connexin43mRNA和蛋白质表达,比较3组之间的差异。结果正常糖组腹膜问皮细胞表达丰富的connexin43,高糖环境下培养的腹膜间皮细胞connexin43mRNA和蛋白质表达均较正常糖组显著下降（P〈0．05）。渗透压对照组与正常糖组之间无明显差异（P〉0．05）。结论高糖可抑制腹膜间皮细胞connexin43mRNA和蛋白质表达,可能为腹膜透析（PD）中腹膜间皮层完整性损伤的机制之一。     

腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征

目的 建立从腹膜透析(PD)流出液中分离、培养人腹膜间皮细胞(HPMC)的方法,并检测上皮黏附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白claudin-1及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平.方法 从25例持续不卧床腹膜透析(CAPD)患者PD流出液中分离HPMC,并在体外进行原代培养.根据开始透析的时间分为新开管组(10例)和透析半年以上组(15例).采用倒置相差显微镜、免疫组织化学染色和扫描电镜对培养的细胞进行鉴定;采用实时定量PCR检测细胞E-cadherin、claudin-1及α-SMA mRNA表达.结果 22例患者(新开管组10例,半年以上组12例)PD流出液分离的细胞在体外培养成活,经鉴定均具有HPMC的特征.实时定量PCR结果显示,半年以上组较新开管组分离的HPMC细胞E-cadherin、claudin-1 mRNA表达降低,α-SMA mRNA表达增高(P<0.05),提示出现了间充质细胞转分化(EMT).结论 该研究成功建立了PD流出液分离培养原代HPMC的方法,并证实长期PD患者HPMC存在EMT倾向.该研究的发现为进一步研究腹膜纤维化(PF)和超滤衰竭(UFF)提供了新的方法与实验依据.     

腹透液相关浓度葡萄糖对体外腹膜间皮细胞的影响

目的 研究腹透液相关的三种浓度葡萄糖（1．5％、2．5％、4．25％）对体外培养的腹膜间皮细胞凋亡及其形态的影响。方法 胰蛋白酶消化法从腹膜组织中分离间皮细胞，建立体外培养模型。采用Hoechst 33258荧光染色法及流式细胞仪技术测定体外培养的腹膜间皮细胞在腹膜透析液相关浓度葡萄糖作用下的凋亡率；采用透射电子显微镜技术观察高浓度葡萄糖对体外培养的腹膜间皮细胞形态学的影响。结果Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞仪结果显示：与对照组比较，1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖均能引起明显的腹膜间皮细胞的凋亡（P〈0．05），三种浓度葡萄糖组间也有显著的差异（P〈0．05），4．25％甘露醇能引起明显的凋亡（P〈0．01），4．25％葡萄糖与4．25％甘露醇比较，前者能引起明显的凋亡（P〈0．05）；与正常对照组比较，1．5％葡萄糖分别作用于腹膜间皮细胞24h、72h、120h，各时间组均出现明显的凋亡（P〈0．05）。腹膜间皮细胞的凋亡率与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关（r〉0．7．P〈0.05）。透射电子显微镜观察4．25％葡萄糖作用72h后大鼠腹膜间皮细胞的形态变化：细胞表面的微绒毛倒伏、脱失；细胞质内出现线粒体空泡样变；细胞核内的染色质浓缩、边集；出现凋亡小体。结论 腹膜透析液相关的三种浓度葡萄糖和4．25％的甘露醇均能引起腹膜间皮细胞的凋亡；葡萄糖诱导的腹膜间皮细胞凋亡具有浓度和时间依赖性；葡萄糖引起的细胞凋亡不仅与其渗透压有关，还与葡萄糖代谢有关；葡萄糖引起的细胞形态改变有：腹膜间皮细胞表面的微绒毛倒伏、缺失；细胞质内的线粒体出现空泡样变：细胞核内出现染色质浓缩、边集的改变。     

含糖腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞自噬机理研究

目的:研究含糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)生长影响,探讨引发的线粒体氧自由基的产生、细胞氧自由基增加,以及炎症和自噬发生的可能机理。方法:用1.5%、2.5%和4.25%浓度的含糖低钙腹膜透析液及阳性对照鱼藤酮(Rotenone)刺激人腹膜间皮细胞48h,用流式细胞术检测人腹膜间皮细胞线粒体氧自由基产生和细胞内氧自由基变化、蛋白印迹检测NLRP3和LC3表达变化及透射电镜观察细胞器变化。结果:含糖低钙腹膜透析液在不同的浓度和不同的作用时间情况下,对HMrSV5线粒体及细胞内活性有不同的影响。随糖浓度的增加线粒体氧自由基含量明显增加。随糖浓度升高和时间延长,胞内氧自由基也明显增加;含糖低钙腹膜透析液诱导NLRP3与LC3的表达,并呈糖浓度与时间依赖性;透射电镜观察到细胞线粒体出现空泡及自噬小体的出现。结论:高糖低钙腹膜透析液可刺激HMrSV5细胞的线粒体氧自由基产生并泄露到胞质中,引发细胞炎症自噬的产生。这为基础研究及临床防治腹膜纤维化提供了一条新途径。     

腹膜间皮细胞在腹膜纤维化中的作用及机制研究进展

腹膜间皮细胞(PMCs)是腹膜组织的结构细胞,在腹膜纤维化(PF)的发生和发展过程中起着重要作用。PMCs损伤和凋亡是引发和促进PF增生的始动因素之一,其损伤后一方面导致腹膜结构发生改变,同时其分泌蛋白酶、炎性细胞因子及其他促纤维化因子,引起腹膜间质细胞的激活和基质重构,从而触发了PF的发生和发展。另外,PMCs在PF过程中的作用与上述因素及其他细胞(尤其是成纤维细胞)之间的相互作用有关。体外研究发现,PMCs在肿瘤坏死因子β1的诱导下可以向间充质细胞转化,但其在PF过程中所起的作用及分子机制尚有待进一步阐明。     

人胎隔腹膜间皮细胞的冷冻复型电镜观察

Electron microscopy of mesothelial cells from the diaphragm peritoneum of human fetuses was conducted using the freeze-fracture replica method. The results were as follows: 1) Numerous vesicles were found in single or cluster forms. The latter type was often fused with large vacuoles and opened to the free surface of the cell as secretory granules. 2) On the fractured faces of plasma and nuclear membranes, different numbers of intramembraneous particles and exocytic pores were seen on the PF surface of the plasma membrane. The diameter of the exocytic pores averaged 43 nm, and their maximum number was 26/microns2. 3) Neighboring cells were conjoined by cytoplasmic processes which were seemed to form three-dimensional intertwinings. 4) The microvilli of the mesothelial cells were grouped into three morphological classes, i.e. fork-like microvilli, bulbous ending microvilli, and stick-like microvilli. In addition, the contrast between the present investigation and the results of fine section studies on the diaphragm peritoneum of human fetus is discussed.     

高糖对人腹膜间皮细胞生成活性氧的影响

[目的]研究不同浓度的葡萄糖对人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells,HPMCs）生成活性氧的影响。[方法]HPMCs体外培养并进行免疫组化鉴定,取第3代细胞用于实验。分别按照不同的实验要求将细胞分组。不同葡萄糖浓度干预组：①空白对照组;②1．5％葡萄糖组;③2．5％葡萄糖组;④4．25％葡萄糖组。不同作用时间组：①空白对照组;②2．5％葡萄糖组。两组细胞分别培养12、24、48h。应用流式细胞仪检测细胞对氧化剂敏感的2．7-二氢二氯荧光素（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein,DCFH）发生氧化所产生的荧光量,从而间接的反映细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平,观察随葡萄糖浓度变化及不同作用时间对人腹膜间皮细胞产生活性氧的影响。[结果]（1）与空白对照组比较,高糖干预人腹膜间皮细胞后,其细胞内平均荧光强度明显升高（P〈0．05）,并且随葡萄糖浓度升高而逐渐增高,其中4．25％葡萄糖组最高。（2）与空白对照组比较,随着时间的延长,高糖作用下细胞内平均荧光强度明显升高（P〈0．05）,培养48h其水平最高。[结论]高糖可刺激体外培养的人腹膜间皮细胞ROS的生成。     

高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞分子机制的研究

目的：探讨高浓度葡萄糖损伤人腹膜间皮细胞的机制。方法：（1）人腹膜间皮细胞分别经含1．5％、2．5％、4．25％葡萄糖的M199培养基培养48小时后，检测间皮细胞线粒体膜电位（Ψ）、凋亡率、caspase-3活性、bax和bcl-2基因mRNA表达；（2）分别用0．1μmol／L和0．01μmol／L环孢素A（CsA）与4．25％葡萄糖共同作用人腹膜间皮细胞，检测细胞凋亡率和caspase-3活性。结果：（1）随着葡萄糖浓度增加，Ψ丧失的细胞百分率、bax mRNA表达量、caspase-3活性、凋亡率增加（P〈0．05），而bcl-2 mRNA表达量减少；（2）随着葡萄糖浓度增加，bax mRNA的表达量与皿丧失的间皮细胞百分率呈显著正相关（P〈0．01）；bcl-2 mRNA的表达量与Ψ丧失的间皮细胞百分率呈显著负相关（P〈0．01），Ψ丧失的间皮细胞百分率与间皮细胞凋亡率、caspase-3活性呈显著正相关（P〈0．01）：（3）0．1μmol／L CsA组间皮细胞凋亡率和caspase-3活性显著低于高糖对照组（P〈0．05）。结论：（1）高糖可能通过上调bax基因表达和下调bcl-2基因表达，诱导人腹膜间皮细胞线粒体活化、caspase-3活化和凋亡。（2）高糖诱导人腹膜间皮细胞caspase-3活化和凋亡可能依赖于线粒体活化。     

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响。方法HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验。将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平。分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响。结果高糖明显抑制HPMC细胞活力(P<0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势。高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高。结论高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关。     

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的 研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响.方法 HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验.将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平.分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响.结果 高糖明显抑制HPMC细胞活力(P＜0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势.高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高.结论 高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关.     

己糖激酶在原代培养腹膜间皮细胞的表达

目的 :探讨大鼠腹膜间皮细胞 (peritonealmesothelialcell,PMC)的原代培养方法及其己糖激酶 (hexoki nase ,HK)的表达。方法 :胰蛋白酶 EDTA消化法进行PMC的分离、培养 ,6 磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6PDH)偶联比色法检测其HK总活性。结果 :PMC的原代及传代细胞 5～ 8d即可达到融合 ,其HK的基础活性为 (4.80± 0 .39)U/g蛋白。结论 :改良的胰蛋白酶消化法是进行PMC原代培养的一种可靠的实验方法。PMC有较强的HK活性 ,参与了腹膜透析时对葡萄糖吸收和利用方面的调节 ,可能对透析超滤有较大的影响     

人参总皂甙对乳酸盐腹膜透析液致人腹膜间皮细胞损伤的保护作用

目的：观察人参总皂甙（GS）对乳酸盐腹膜透析液（L－PDS）在体外所致的人类腹膜间皮细胞（HPMC）活力和增殖抑制的影响。方法：采用胰蛋白酶消化法从人腹膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型;用乳酸脱氢酶（LDH）的释放和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）评估细胞的活性及增殖能力。结果：2．5％和4．25％葡萄糖L－PDS组与对照组相比HPMC的LDH释放增多,且两浓度差异无显著性;随L－PDS暴露时间的延长,HPMC的存活率逐渐降低;GS可以减少LDH的释放,提高细胞存活率（P＜0．01）,并能促进HPMC的增殖（P＜0．05）。结论：GS对L－PDS体外所致HPMC活力和细胞增殖的抑制具有一定的保护作用。