刚地弓形虫细胞培养的研究：Ⅲ.不同毒力株速殖子培养检出时间的差异

本文观察了弓形虫ＲＨ株，Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ株和８株源自羊水等标本的野生株速殖子，在以单核细胞ＴＨＰ－１作为受污染细胞的培养系统中不同接种量其检出时间的差异，结果表明，ＲＨ株和Ｐｒｇｎｉ－ａｕｄ株各不同接种量最早可在１～４ｄ内获阳性结果，而野生株仅１株可检测一每管（２ｍｌ）１０速殖子的接种量（第１４ｄ）１００速殖子接种量６／８株在第１４ｄ检获阳性，提示在以细胞培养进行弓形虫病原检测时适当延长培养检测     

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅳ.临床标本培养检测技术的改进

本文以血清抗弓形虫抗体阳性的孕妇羊水进行细胞培养检测，实验组以ＴＨＰ－１细胞系培养并加入经离心过滤的ＲＨ株速殖子细胞培养上清作为培养佐剂，在第４－６ｄ，第７－１０ｄ，第１１－１４ｄ进行３次对照组以ＭＲＣ５细胞培养，在第４ｄ、第８ｄ进行２次常规检测。     

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅳ．临床标本培养检测技术的改进

本文以血清抗弓形虫抗体阳性的孕妇羊水进行细胞培养检测，实验组以ＴＨＰ一１细胞系培养并加入经离心过滤的ＲＨ株速殖子细胞培养上清（ＳＲＣ）作为培养佐剂，在第４～６ｄ，第７～１０ｄ，第１１～１４ｄ进行３次检验；对照组以ＭＲＣ５细胞系培养，在第４ｄ、第８ｄ进行２次常规检测。结果２６例羊水在ＭＲＣ５组全部阴性，而ＴＨＰ一１组分离出３株野生株，并在其后经同时接种小鼠的血清特异性ＩｇＭ抗体和脑包囊检测或脐血特异性ＩｇＭ检测所证实。提示加用ＳＲＣ并延长培养检测时间对提高弓形虫病以细胞培养作病原诊断的敏感性有显著意义。     

三株弓形虫速殖子的体外培养研究

目的为探索一种以体外培养方法收获弓形虫速殖子的较适条件。方法以ＲＨ、ＳＨ１、ＰＰ３个分离株的弓形虫速殖子，按１０５、１０４、１０３的接种量分别接种ＨｅＬａ细胞，调定培养基的ｐＨ值分别为８．０、７．０和６．５进行培养。结果发现接种后６ｄ速殖子的累积收获量存在差异性，其中以ＳＥ１株收获量大，ＲＨ株次之，ＰＰ株最少；接种量为１０５时，收获量大，１０４组次之，１０３最少。在培养基ｐＨ为６．５时的收获量大，ｐＨ７．０次之，ｐＨ８．０最少。结论ｐＨ６．５的培养条件较适于试验的３株弓形虫速殖子体外增殖，同时，弓形虫的体外增殖也与接种量及不同弓形虫分离株有关     

刚地弓形虫以成纤维细胞和单核细胞培养检测的比较

本文观察了刚地弓形虫ＲＨ株和Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ株速殖子在成纤维细胞ＭＲＣ５和单核细胞ＴＨＰ－１培养以ＩＦＡ检测的结果，表明以两种细胞系培养在较大接种量时（５００速殖子／ｍｌ）其检测敏感性相当，而在少量接种（５０／ｍｌ和５／ｍｌ速殖子）则单核细胞培养较成纤维细胞敏感，检出率分别为６０．０％和２５．０％，前者尚有６例ＩＦＡ阴性者以流式细胞仪（ＦＣＭ）检获阳性，因而ＴＰＨ－１组总阳性率为７５．０％。提示以细胞培养进行弓形虫病原分离时ＴＨＰ－１是较适宜的宿主细胞。     

激光照射对弓形虫速殖子作用的流式细胞分析

用流式细胞术（ＦＣＭ）检测分析了激光照射对弓形虫ＲＨ株速殖子的作用。结果显示，激光照射后弓形虫速殖子群体ＤＮＡ含量分布发生改变，ＤＮＡ含量的第１道数峰值（平均值）左移，第１峰值分布范围内速殖子数占总速殖子数百分率啬，３．５Ｗ和４．５Ｗ剂量组和对照组相比差异存在显著性（Ｐ〈０．０５）。提示激光照射能抑制弓形虫ＤＮＡ的合成，减少弓形虫群体ＤＮＡ的含量。     

刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅰ．磷脂酶A2对成囊株速殖子侵入细胞的影响

已知多种酶和细胞因子对弓形虫侵入细胞有促进或抑制作用。本研究旨在探讨利用对弓形虫侵入细胞有促进作用的因子提高以细胞培养作病原诊断的敏感性。以激素弱化的小鼠接种成囊株包囊获得速殖子，以单核细胞ＴＨＰ－１细胞系的培养系统定量接种速殖子并加入源自蛇毒的磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２），以免疫荧光法和流式细胞仪检测细胞感染率。结果表明ＰＬＡ２对弱毒株速殖子侵入细胞有明显促进作用，在４株成囊株培养不同时间的检测，其感染细胞比率均比对照有显著提高。     

L-精氨酸和L-瓜氨酸在体外活化巨噬细胞抗弓形虫感染中的作用

目的：探讨增加细胞外Ｌ－精氨酸（一氧化氮生物合成的底物）或Ｌ－瓜氨酸（通过再循环生成Ｌ－精氨酸）浓度是否可提高活化巨噬细胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，Ｍ）诱生一氧化氮（ＮＯ）的产量及其对细胞内抑制或杀伤弓形虫速殖子的能力。方法：用ＲＨ株刚地弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉ）速殖子感染活化Ｍ后，观察活化Ｍ在含不同浓度Ｌ－精氨酸和Ｌ－瓜氨酸培养基中培养１８ｈ后的ＮＯ产量、感染率以及纳虫泡内弓形虫速殖子数。结果：（１）活化Ｍ在生理水平的Ｌ－精氨酸浓度（８０μｍｏｌ／Ｌ）下可明显抑制细胞内弓形虫速殖子的增殖，并依赖于ＮＯ的产量；（２）增加细胞外源的Ｌ－精氨酸或Ｌ－瓜氨酸可明显提高Ｍ诱生的ＮＯ产量，进而降低Ｍ的感染率，并抑制细胞内弓形虫速殖子的增殖；（３）Ｌ－瓜氨酸可完全替代Ｌ－精氨酸提高Ｍ诱生的ＮＯ产量及其抑制或杀伤弓形虫速殖子的能力。结论：活化Ｍ胞浆内生理水平的Ｌ－精氨酸诱生的内源性ＮＯ产量足以抑制细胞内弓形虫速殖子的繁殖，但不能防止细胞感染，增加细胞外生物合成ＮＯ的底物浓度可提高Ｍ抑制或杀伤细胞内弓形虫速殖子的能力。     

人源弓形虫分离株的生物学鉴定及群体DNA含量分析

通过对不同分离株弓形虫抗原的分析,探讨弓形虫虫株间的差异性。取弓形虫ＣＡｇ阳性血液标本进行小鼠接种,对分离株进行生物学特性鉴定;采用流式细胞仪（ＦＣＭ）对分离株弓形虫速殖子进行群体ＤＮＡ含量分析。结果在５份ＣＡｇ阳性血液样本中分离到４株弓形虫,两者符合率达８０％;经生物学鉴定结果显示,４个分离株的形态大小、毒力及抗原性均与ＲＨ株弓形虫相似。上述５株弓形虫速殖子ＤＮＡ含量分析均呈明显规律性,即均有２     

脑脊液中弓形虫循环抗原的组分分析

本文在国内首先应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ对弓形虫循环抗原（ＣＡｇ）阳性脑脊液标本进行抗原组分分析，并用正常人脑脊液、ＲＨ株弓形虫速殖子的代谢抗原（ＭＡ）及细胞质抗原（ＣＡ）作为平行对照。结果显示，脑脊液及ＲＨ株ＭＡ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白区带范围均在１４－１０８ｋＤ和３８－６７ｋＤ处有明显的电泳区带。ＥＬＩＢ反庆后均在５０ｋＤ处出现明显的反应区带。从而证实，脑脊液标本中的ＣＡｇ为弓形虫虫体在宿主     

IFN-γ联合TNF-α活化小鼠腹腔巨噬细胞抗不同毒力株弓形虫的作用

目的： 比较ＩＦＮ－γ联合ＴＮＦ－α体外活化的小鼠腹腔巨噬细胞（ＭΦ） 对强毒株ＲＨ株及弱毒株Ｆｕｋａｙａ株的抗虫作用。方法： 体外以ＩＦＮ－γ与ＴＮＦ－α联合活化昆明系小鼠腹腔ＭΦ,观察其对入侵的ＲＨ株及Ｆｕｋａｙａ株速殖子的抗虫作用, 测定培养上清中ＮＯ的水平。结果： 在以ＩＦＮ－γ１００Ｕ＋ ＴＮＦ－α１００Ｕ 活化的ＭΦ中, 入侵２４ｈ 后的ＲＨ株弓形虫速殖子被完全杀灭, 而Ｆｕｋａｙａ 株速殖子则缓慢增殖, 且前者培养上清中ＮＯ水平显著高于后者。结论：ＩＦＮ－γ活化的ＭΦ对入侵的ＲＨ 株和Ｆｕｋａｙａ株速殖子的抗虫作用存在差异,这可能与ＮＯ的水平有关。     

IFN-γ联合TNF-α活化小鼠腹腔巨噬细胞抗不同毒力株弓形虫的作用

目的： 比较ＩＦＮ－γ联合ＴＮＦ－α体外活化的小鼠腹腔巨噬细胞（ＭΦ） 对强毒株ＲＨ株及弱毒株Ｆｕｋａｙａ株的抗虫作用。方法： 体外以ＩＦＮ－γ与ＴＮＦ－α联合活化昆明系小鼠腹腔ＭΦ,观察其对入侵的ＲＨ株及Ｆｕｋａｙａ株速殖子的抗虫作用, 测定培养上清中ＮＯ的水平。结果： 在以ＩＦＮ－γ１００Ｕ＋ ＴＮＦ－α１００Ｕ 活化的ＭΦ中, 入侵２４ｈ 后的ＲＨ株弓形虫速殖子被完全杀灭, 而Ｆｕｋａｙａ 株速殖子则缓慢增殖, 且前者培养上清中ＮＯ水平显著高于后者。结论：ＩＦＮ－γ活化的ＭΦ对入侵的ＲＨ 株和Ｆｕｋａｙａ株速殖子的抗虫作用存在差异,这可能与ＮＯ的水平有关。     

不同毒力虫株弓形虫对绿猴肾细胞侵袭及增殖的研究

目的：探讨弓形虫不同毒力株影响侵袭力的增殖因素。方法：在体外培养条件下采用ＲＨ、Ｂ３６和Ｆｕｋａｙａ虫株的弓形虫速殖子以绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ细胞）为攻击对象，根据虫体有否纯化及培养液中是否含小牛血清，系统地观察了各虫株的最早侵袭时间、侵袭率及胞内增殖变化。结果：ＲＨ、Ｂ３６、Ｆｕｋａｙａ３株种弓形虫速殖子在较短时间内即 有侵入宿主细胞，侵袭率随着时间的延长而增高，３株虫株在胞内增殖情况以ＲＨ株最为活跃、Ｂ３６株次之，而Ｆｕｋａｙａ株相对较为迟缓。结论：环境因素以虫体经纯化和培养液内含小牛血清对虫体的增殖的影响最显著。     

三株弓形虫速殖子体外培养形成包囊的研究

弓形虫RH、PP、SHI株速殖子以105、104、103的接种量接种24h的HeLa细胞，分别维持pH值为8．0、7．0和6．5的培养条件，并适时补充HeLa细胞，结果可见在不同pH值条件下，3株弓形虫均可成囊，其成囊现象与速殖子接种量及培养基pH值有关，并显示一定的虫株间差异。     

脑脊液中弓形虫循环抗原的组分分析

本文在国内首先应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＢ对弓形虫循环抗原（ＣＡｇ）阳性脑脊液标本进行抗原组分分析，并用正常人脑脊液、ＲＨ株弓形虫速殖子的代谢抗原（ＭＡ）及细胞质抗原（ＣＡ）作为平行对照。结果显示，脑脊液及ＲＨ株ＭＡ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白区带范围均在１４～１０８ｋＤ处，在３８～６７ｋＤ处有明显的电泳区带。ＥＬＩＢ反应后均在５０ｋＤ处出现明显的反应区带。从而证实，脑脊液标本中的ＣＡｇ为弓形虫虫体在宿主体内增殖的代谢及裂解产物。同时提示，酶联免疫印迹技术（ＥＬＩＢ）可代替弓形虫的病原学检查，以作为弓形虫病急性、活动性感染的确诊指标。     

刚地弓形虫RH株速殖子在HeLa细胞系体外培养的实验观察

目的 建立稳定高效的刚地弓形虫RH株速殖子(以下简称弓形虫速殖子)体外培养模型。 方法 ①将HeLa细胞（1×10⁴个）接种置于细胞培养皿内底部的盖玻片,12 h后将纯化的弓形虫速殖子接种于细胞培养皿（1×10⁴个/皿）,继续培养0.5～96 h,观察弓形虫速殖子在HeLa细胞内增殖情况;②将纯化的弓形虫速殖子接种于HeLa细胞后分为2组,一组于37 ℃分别培养24～120 h后,移入25 ℃培养120 h;另组于37 ℃培养48 h后,移入25 ℃分别培养72～168 h,观察不同温度和时间对弓形虫速殖子产率和活虫率的影响;③当培养的HeLa细胞80%发生细胞融合时更换速殖子培养液,同上法12 h后接种纯化的弓形虫速殖子进行培养,当80% HeLa细胞被感染增殖的弓形虫速殖子涨破时,收集、计数弓形虫速殖子,并用其感染（3×10⁶个/瓶）新的HeLa细胞,观察其连续传代情况;④每隔5代取弓形虫速殖子,腹腔接种昆明小鼠（3×10⁶个/只）,观察小鼠存活时间、评价该体外培养条件对弓形虫速殖子毒力的影响。 结果 接种弓形虫速殖子96 h后HeLa细胞均被感染及涨破,培养弓形虫速殖子30代（3～4 d为1代）增殖稳定,每代获得弓形虫速殖子1×10⁷～5×10⁷个,增殖5～20倍。各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为5.80～6.40 d, 毒力未见减弱(P>0.05)。HeLa细胞接种弓形虫速殖子,于37 ℃培养72 h后,移至25 ℃培养120 h,其产率高达40倍以上,活虫率为90%以上,仅残留极少量Hela细胞。 结论 刚地弓形虫RH株速殖子可在HeLa细胞中增殖并长期稳定传代。     

弓形虫RH株在实验感染小鼠体内分布的研究

以间接免疫酶法观察弓形虫感染时的急性期病变特点及虫体在主体脏器的动态分布,以期为弓形虫病的病理诊断提供依据,并对弓形虫致病机理加深理解。方法用弓形虫ＲＨ株速殖子１０＾３个经腹腔感染昆明小鼠,于感染后第２、４、６和８ｄ,取肝、脾、肺和脑进行间接免疫酶染色。     

弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系的建立

目的建立弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系。方法纯化弓形虫RH株速殖子,接种于NIH3T3细胞单层,进行体外培养。接种4h后,换用pH8.1的碱性培养基进行速殖子向缓殖子的诱导转化培养,RT-PCR检测缓殖子蛋白1(BAG1)基因的表达。将诱导的缓殖子重新用pH7.2的培养基在常规环境下培养,诱导缓殖子向速殖子转化。为探索温度对速殖子向缓殖子转化的影响,将接种RH株速殖子的NIH3T3细胞分别放在37℃、39℃、41℃、43℃中诱导转化培养,RT-RCR检测BAG1基因的表达。结果弓形虫RH株能在NIH3T3细胞单层中生长增殖,更换高pH值碱性培养环境后,能诱导弓形虫速殖子转化为缓殖子,RT-PCR检测出缓殖子期特异蛋白BAG1基因的表达,并且随着诱导时间的延长,BAG1基因mRNA的转录水平逐渐提高,表明有更多的速殖子转化为缓殖子。恢复pH7.2的常规培养条件,碱性诱导的缓殖子能转化为速殖子。在41℃诱导条件下,能诱导RH株速殖子转化为缓殖子。结论成功构建弓形虫体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系,为转化机制的研究奠定基础。     

人源弓形虫分离株的生物学鉴定及群体DNA含量分析

通过对不同分离株弓形虫抗原的分析 ,探讨弓形虫虫株间的差异性。取弓形虫 CAg阳性血液标本进行小鼠接种 ,对分离株进行生物学特性鉴定 ;采用流式细胞仪 ( FCM)对分离株弓形虫速殖子进行群体 DNA含量分析。结果在 5份 CAg阳性血液样本中分离到 4株弓形虫 ,两者符合率达 80 % ;经生物学鉴定结果显示 ,4个分离株的形态大小、毒力及抗原性均与 RH株弓形虫相似。上述 5株弓形虫速殖子 DNA含量分析均呈明显规律性 ,即均有 2个分布峰 ,但各虫株间的 2个分布峰中所占速殖子数存在显著性差异 ( P<0 .0 1)。表明检测弓形虫 CAg可作为弓形虫早期、急性期感染的确诊指标 ;采用流式细胞术进行 DNA群体分析 ,似可反映弓形虫虫株间的差异     

刚地弓形虫VEG株速殖子感染宿主细胞最优接种比的曲线拟合分析

目的 探讨不同浓度梯度的刚地弓形虫速殖子体外感染对侵蚀宿主细胞能力的影响及二者之间的最优接种比。方法 依照耗材规格和建议上液量,将宿主Vero细胞依次铺入96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶后培养12 h;常规纯化和计数VEG株速殖子并倍比稀释出8个梯度,分别用来感染上述细胞,使首个感染量与宿主细胞铺入数相等;继续培养4 d后全量收集培养物,经DNA提取和Real-time PCR定量检测,以7种回归模型对所得速殖子数的均值进行拟合分析(n=3),选出最佳函数类型并求极值,以此明确弓形虫感染与宿主细胞间的接种关系。结果 Real-time PCR定量结果显示,VEG株速殖子最初感染量及所用耗材培养规格对弓形虫侵蚀宿主细胞的能力均有影响,并且四次多项式函数为弓形虫感染宿主细胞4 d时的最佳拟合曲线方程;经求导和求极值发现,同种耗材培养条件下,弓形虫VEG株速殖子感染数与宿主Vero细胞间存在最优接种比例关系。结论 96孔、24孔、12孔、6孔细胞板和25T培养瓶内弓形虫速殖子与宿主细胞间的接种比例依次为1/7.20、1/5.32、1/4.53、1/4.03和1/43.02。