去分化表皮干细胞的来源鉴定和分析

目的：利用染色体特异性分析方法鉴定去分化表皮干细胞的来源。方法：包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮。分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞。处理后的表皮片经免疫组化鉴定无表皮干细胞后移植到雌性BALB／c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5d后用免疫组化法检测皮片内角蛋白10（CK10）、CK19和β1整合素的表达,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内去分化来源的表皮干细胞,并采用PCR的方法检测去分化细胞内的Y染色体。结果：未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性。而去基底皮片移植后5d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞。Ⅳ型胶原粘贴分离去分化来源的表皮干细胞,结果表明,移植皮片组在10min内约有4．56％的贴壁细胞出现,而未移植皮片组3h内无贴壁细胞出现。PCR分析结果显示在上述贴壁细胞内能检测到Y染色体的特异序列,而宿主来源的组织检测不到。结论：去分化表皮干细胞来源于移植皮片内成熟表皮细胞的去分化,而非宿主体内的干细胞。     

不同来源的表皮干细胞促进皮肤创面愈合的研究

目的 观察表皮干细胞(ESCs)及去分化来源的表皮干细胞(DESCs)对皮肤创面愈合的促进作用及其异同.方法 由新鲜人包皮标本以贴壁法分离ESCs,随机分为3组,第1组作为原代ESCs:第2组传代培养至第6代时可见细胞成熟呈表皮细胞(ECs)形态,由原来的大克隆生长的小圆细胞形态变为较为肥大的不规则型细胞,无法形成克隆样增殖;其细胞表型也由β1整合素、CK19强阳性、CK10阴性变为β1整合素、CK19阴性,而CK10强阳性,予以100μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)培养48 h进行去分化诱导,48 h后ECs周边开始出现小圆细胞并呈克隆样生长,β1整合素、CK19、CK10等细胞表型也趋于与ESCs一致,即DESCs;第3组传代培养至第6代获得ECs.3组细胞皆以D-Hanks液重悬调其终质量浓度为2×106个/ml.将12只裸鼠每只背部左右各制备1个直径6 mm创面,共24个创面.将全部创面随机等分为4组,每组6个,分别以ESCs、DESCs、Ecs及生理盐水(NS)各0.2 ml进行创面注射.于术后0、3、7 d测量创面面积进行统计学分析,并于术后7 d行创面取材苏木素-伊红(HE)染色.结果 ESCs组与DESCs组在术后3 d时创面面积分别为(11.758±2.544)、(11.515±1.351)mm2,7 d时创面面积分别为(1.795±1.063)、(2.043±1.138)mm2,修复速度要明显快于ECs组与NS组[3 d时创面面积分别为(17.857±1.722)、(16.192±2.256)mm2,7 d时创面面积分别为(5.367±1.219)、(5.070±1.357)mm2,P＜0.01];而ESCs与DESCs组之间创面修复速度比较差异无统计学意义(P＞0.05);ECs组与NS组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).HE染色提示ESCs组与DESCs组的创面愈合质量优于ECs组与NS组,可见有皮肤附属腺的再生且纤维瘢痕组织较少.结论 ESCs与DESCs皆有促进创面愈合的作用,相互之间无明显差异.

Abstract：

Objective To investigate the enhancing effect of epithelial stem cells (ESCs) and dedifferentiation derived epithelial stem cells (DESCs) in the healing of epidermal wound. Methods ESCs were isolated from the fresh circumcised foreskins by using adherence method and randomly divided into three cohorts: ESCs cohort, DESCs cohort and epithelial cells (ECs) cohort. The final cell density was adjusted to 2 × 106/ml with D-Hanks in each group. The model of BALB/C mice full-thickness skin loss wounds was established. Two circular 6 mm-diameter skin loss wounds were cut on every BALB/C mouse back. Twenty-four wounds of 12 BALB/C mice were divided equally and randomly into 4 groups:DESCs, ESCs, ECs and NS. The cell suspensions of DESCs, ESCs and ECs were injected respectively into the wound edges with the density of 2 × 106/ml. And the volme was 0. 2 ml per treatment wound. The same volume of normal saline was injected in NS group. On the postoperative day 0, 3, 7, all of the wound areas were measured and analyzed statistically. On the postoperative 7 day, the sections were made and observed by using hematoxylin and eosin (HE) staining. Results The wound areas in DESCs group and ESCs group were ( 11. 758 ± 2. 544) and ( 11.515 ± 1.351 ) mm2 on the 3rd day postoperatively, and ( 1. 795 ±1. 063) and (2. 043 ± 1. 138) mm2 on the 7th day postoperatively, respectively. The wound areas in ECs group and NS group were ( 17. 857 ± 1. 722) and ( 16. 192 ±2. 256) mm2 on the 3rd day postoperatively,and ( 1. 795 ± 1. 063) and (2. 043 ± 1. 138) mm2 on the 7th day postoperatively, respectively. There was statistically significant difference in wound area between ESCs or DESCs group and ECs, NS groups on the 3rd, 7th day postoperatively ( P ＜ 0. 01 ), but there was no statistically significant difference between DESCs and ESCs groups ( P ＞ 0. 05 ). HE staining showed the repairing quality of treatment wounds was superior to that in the control wounds, and regenerating glands and less fibrous connective tissues were seen in ESCs and EDSCs groups. Conclusion Both ESCs and DESCs could promote the wound repair.     

热损伤与碱性成纤维细胞生长因子联合处理诱导表皮细胞去分化的实验研究

目的：体外建立表皮细胞去分化模型,为深入阐明表皮细胞去分化过程奠定基础。方法：离体条件下选择热损伤与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为联合诱导因素处理成熟表皮细胞。通过Giemsa染色和电镜观察细胞形态的改变;通过细胞培养和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤,观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变。结果：经联合诱导后,细胞形态发生改变,表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大。增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构。基因水平的改变表现为与角质化相关基因下调和与有丝分裂相关基因上调。结论：在热损伤与bFGF联合诱导下,已分化的表皮细胞会发生形态、功能和基因表达的改变,表现为干细胞的特性。     

DNA损伤在去分化源性表皮干细胞安全性评价中的作用及相关机制的研究

目的：：从分子、细胞及在体水平评估DNA损伤和非 DNA 损伤因素诱导所得去分化源性表皮干细胞的安全性,探讨DNA损伤及其应答分子对其安全性评估的意义与机制。方法：分别采用紫外线(UV)照射和bFGF处理诱导方案诱导表皮细胞去分化。采用 MTT法比较正常培养和血清培养条件下的两组去分化源性表皮干细胞的增殖能力;流式细胞术检测凋亡情况;Western blotting检测各组去分化过程中DNA损伤应答分子γ-H2AX、激活型 caspase、p53、p21表达的变化;在雌性BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下注射人黑色素瘤细胞及两种去分化源性表皮干细胞,同时设生理盐水注射对照,30 d 后取瘤块称重,评估两种去分化源性干细胞的成瘤性。结果：①两种去分化源性表皮干细胞均表现出较强的增殖能力,UV 照射所得干细胞具有较强的血清耐受性;②UV照射可导致表皮细胞DNA损伤和细胞凋亡,影响表皮细胞中 p53和 p21水平,而 bFGF处理组无此作用;③两种去分化源性表皮干细胞均无体内成瘤性。结论：去分化过程中细胞 DNA 损伤与否是评价去分化源性干细胞安全性的较敏感的关键指标,因此 bFGF处理诱导与 UV照射所得的表皮干细胞相比更为安全可靠。     

压应力对表皮干细胞增殖与分化的影响

目的：初步观察压应力对表皮干细胞增殖分化的影响。方法：以大鼠的皮肤扩张动物模型为在体观察对象;4、8、12kPa的压应力予体外培养的大鼠表皮干细胞进行间歇加压（每天3次,每次2h,共1周）为离体观察对象。利用免疫组化染色、免疫荧光双染、细胞克隆形成率等技术与方法检测β1整合素、角蛋白19（K19）、角蛋白14（K14）、角蛋白10（K10）、α6整合素、CD71的表达特征,以及压应力对表皮千细胞增殖分化的影响。结果：组织学观察显示,扩张皮肤的表皮层明显增厚;表皮层的β1整合素、K19、K14阳性细胞数量于扩张的第5天开始增多,至15d达峰值后下降,扩张完成后20d趋于正常;棘层和颗粒层不仅可见上述阳性细胞,且出现α6整合素^bri／CD71^dim细胞的表达。体外培养的表皮干细胞,8kPa、12kPa的压应力作用1周后,细胞克隆形成率分别为48．67％、49．36％,明显高于4kPa组（23．17％）与对照组（23．00％）,8kPa、12kPa组可见K10阳性细胞表达。结论：表皮干细胞具有压应力敏感性,适当的压应力可诱导表皮干细胞增殖与分化。     

诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞．利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF（50～1000ng／mL）作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型（NHE-1,NKCC-1）流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng／mL和100ng／mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异（P〉0．05）：500ng／mL和1000ng／mL EGF抑制细胞增殖。1000ng／mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显（P〈0．05）。表皮干细胞经过50ng／mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng／ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。     

表皮细胞体外去分化模型的建立

目的 探讨表皮细胞体外去分化模型的建立方法.方法 人表皮角质形成细胞(HEK)体外培养至24代,细胞体积膨大,形态发生明显改变.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导48 h后,观察细胞贴壁培养4、12、24、48、72 h时的生长及集落形成情况.以同期培养的表皮细胞作为阴性对照,采用免疫组织化学的方法检测实验组及对照组,β1整合素、CK19、CK14、CK10在表皮细胞中的表达差异;流式细胞仪测定细胞周期的改变.结果 bFGF诱导培养48 h后老化的表皮细胞周围分散出现幼稚型细胞,这些细胞体积小,形态均一,折光性强,核浆比大,并呈克隆样生长.免疫组织化学染色结果显示,bFGF诱导培养后,表皮细胞中CK19、CK14表达增强,而CK10表达减弱.流式结果显示:bFGF诱导培养后,细胞周期中G0/G1的细胞为53.08%,S期细胞为32.71%,G2期细胞为14.21%,而对照组中处于G0/G1、S期及G2期的细胞分别为63.9%、18.98%及17.12%.结论 bFGF能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型克隆形成细胞,具体机制需要进一步深入研究.     

在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的可行性.方法抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后,应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记技术进行细胞标记.将已标记的细胞以注射方式回植到提供骨髓的猪的皮内及皮下,分别于注射后1、2、4周取材,常规石蜡包埋,行BrdU和角蛋白免疫荧光双染色,激光共聚焦显微镜观察.结果大多数BrdU阳性细胞聚集在真皮中的小血管周围.但有少数BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层,并同时表达角蛋白.结论在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表皮细胞的潜能.     

去分化脂肪细胞与脂肪来源干细胞体内成脂能力比较的初步研究

目的 通过比较去分化脂肪细胞(dedifferentiated adipocytes,DA)与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)在体内的成脂分化能力,为脂肪组织工程筛选出成脂效率高的种子细胞.方法 取健康女性脂肪抽吸术的抽吸物,使用酶消化法获取成熟脂肪细胞及脂肪来源干细胞,采用天花板贴壁法培养成熟脂肪细胞使其去分化,获取去分化脂肪细胞,各取第3代细胞进行实验.将两种细胞分别与纤维蛋白胶(fibrin glue,FG)支架体外混合培养,光镜及扫描电镜检测细胞与支架的相容性;DiI荧光染料标记细胞,将DiI标记过的细胞支架复合物(DA-FG组,去分化脂肪细胞-支架,n=8;ASCs-FG组,脂肪来源干细胞-支架,n=8)以及空白支架(空白FG组,n=8)注射于裸鼠皮下.术后8周将新生组织取出,进行大体观察和湿重测定,HE染色、H染色和油红"O"染色后进行组织学观察、纤维化比率测定以鉴定新生物的性质、来源.结果 成熟脂肪细胞经天花板贴壁法培养后变为长梭形成纤维细胞状,即去分化脂肪细胞,脂肪来源干细胞呈长梭形.细胞-支架复合物体外培养3 d后光镜及扫描电镜检测发现细胞在支架上生长良好.术后8周DA-FG、ASCs-FG组裸鼠背部皮下均有新生组织块形成,经检测后证实其为成熟脂肪块并来源于植入的种子细胞,DA-FG组新生物平均湿重大于ASCs-FG组,平均纤维化比率则低于ASCs-FG组;空白FG组无新生组织形成,支架被降解吸收.结论 去分化脂肪细胞与脂肪来源干细胞均可作为种子细胞在裸鼠皮下构建出脂肪组织,较之脂肪来源干细胞,去分化脂肪细胞构建出的组织块具有湿重大,纤维化比率低的优点.     

整合素β1对人表皮干细胞增殖与分化的影响

目的构建针对整合索(intergrin)β1特异性的siRNA表达载体,并转染人表皮干细胞(KSC),探讨整合素β1对KSC增殖与分化的影响。方法针对目的基因intergrinβ1,选择RNA干扰作用靶点特异性的寡核苷酸序列,构建到siRNA表达质粒pSilencer3.1/H1中,并转染人KSC,转染分组为转染siIntegrinβ1组、非转染组、转染空载体组、转染siNegative组。通过蛋白质印迹法观察intergrinβ1及外皮蛋白的表达变化;应用流式细胞仪观察细胞周期变化;挑选干细胞克隆传代培养14 d后用1%罗丹蓝染色计算克隆形成率。结果重组载体siIntegrinβ1转染人KSC能够抑制intergrinβ1的蛋白表达,抑制效率达70%;KSC中外皮蛋白表达较对照组增加50%;G_0/G_1期细胞较对照组明显减少(P<0.01)、G_2期及S期细胞较对照组增多(P<0.05);干细胞克隆形成率较对照组显著降低(P<0.01)。结论重组载体转染人KSC能下调intergrinβ1的表达,下调intergrinβ1的表达可能是表皮干细胞走向分化的重要调控因素之一。     

表皮细胞去分化的初步实验研究

目的:进一步研究表皮细胞去分化,为创伤修复提供治疗途径。方法:包皮皮片去除脂肪细胞后,用蛋白水解酶消化分离表皮,分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘连并冲洗以去除表皮干细胞。处理后的表皮片用DAPI标记后移植到全层皮肤缺损的BALB/c裸鼠,并局部应用重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),7d后用免疫组织化学法和流式细胞仪法检测移植存活皮片的表型改变。结果:用Ⅳ型胶原反复粘连并冲洗的包皮皮片CK19和β1整合素染色阴性;移植后7d,部分皮片柔软、红润,部分皮片干硬呈黑色,皮片存活率为58·3%;存活皮片CK19和β1整合素染色呈多层分布,而不是正常表皮中的单层分布;流式细胞仪检测结果示:处理后的包皮皮片(移植前)α6 CD71-细胞占0·02%,α6 CD71 占0·03%;移植后7dα6 CD71-细胞占1·43%,α6 CD71 占2·82%,移植前与移植后α6 CD71-和α6 CD71 细胞比例有显著差异(P<0·05)。结论:细胞去分化参与创伤组织的修复,去分化源性干细胞可能成为一个新的干细胞来源。     

两种不同方法诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化效果的比较

目的 比较两种不同方法培养诱导脂肪干细胞(ASCs)向表皮细胞分化效果的差异,以寻找更好的诱导分化方法.方法 利用Transwell装置共培养HaCaT细胞与ASCs为共同培养组;在ASCs培养液中加入表皮生长因子(EGF)进行诱导培养为EGF诱导组;两种方法培养3、6d后的ASCs通过进行表皮细胞标志物角蛋白-19(CK-19)、β1整合素和广谱细胞角蛋白Pan-cytokeratin(Pan-CK)染色检测并计数.结果 共培养法诱导3d后的ASCs细胞CK-19、β1整合素、Pan-CK阳性率分别为(25.8±4.1)％、(29.2±3.9)％、(18.3±2.7)％,明显高于EGF诱导组的细胞阳性率,差异有统计学意义(P＜0.05).共培养法诱导6d后的ASCs细胞标记物CK-19、β1整合素、Pan-CK阳性率分别为(34.1±5.7)％、(42.8±4.3)％、(29.4±3.3)％,显著高于EGF诱导组的细胞阳性率(P＜0.01).结果提示采用共同培养法获得的表皮细胞数目多于EGF诱导组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 与HaCaT细胞共同培养诱导比单纯应用EGF诱导能够更好地促进ASCs向表皮细胞的转化.     

Investigations of prostate epithelial stem cells and prostate cancer stem cells

Although both prostate epithelial stem cells and prostate cancer stem cells are implicated in the differentiation of the normal prostate gland and carcinogenesis of prostate cancer, there has, until recently, been little information regarding their biology. This review summarizes the recent advancements in cell biological research including various in vitro culture systems that have offered the characterization and isolation of prostate epithelial stem cells and prostate cancer stem cells. In addition, the stromal niche or microenvironment of stem cells plays an essential role in proliferation and differentiation of normal stem cells. Stroma surrounding cancer cells, which also provide another unique niche, may involve the initiation and development of cancer stem cells. Investigation of stem cells and their microenvironments in the prostate should lead to the elucidation of biological features and the development of novel treatments for prostate cancer.     

Phosphodiesterase 4 inhibition decreases MUC5AC expression induced by epidermal growth factor in human airway epithelial cells

BACKGROUND: A common pathological feature of chronic inflammatory airway diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is mucus hypersecretion. MUC5AC is the predominant mucin gene expressed in healthy airways and is increased in asthmatic and COPD patients. Recent clinical trials indicate that phosphodiesterase type 4 (PDE4) inhibitors may have therapeutic value for COPD and asthma. However, their direct effects on mucin expression have been scarcely investigated. METHODS: MUC5AC mRNA and protein expression were examined in cultured human airway epithelial cells (A549) and in human isolated bronchial tissue stimulated with epidermal growth factor (EGF; 25 ng/ml). MUC5AC mRNA was measured by real time RT-PCR and MUC5AC protein by ELISA (cell lysates and tissue homogenates), Western blotting (tissue homogenates) and immunohistochemistry. RESULTS: EGF increased MUC5AC mRNA and protein expression in A549 cells. PDE4 inhibitors produced a concentration dependent inhibition of the EGF induced MUC5AC mRNA and protein expression with potency values (-log IC(50)): roflumilast (approximately 7.5) > rolipram (approximately 6.5) > cilomilast (approximately 5.5). Roflumilast also inhibited the EGF induced expression of phosphotyrosine proteins, EGF receptor, and phospho-p38- and p44/42-MAPK measured by Western blot analysis in A549 cells. In human isolated bronchus, EGF induced MUC5AC mRNA and protein expression was inhibited by roflumilast (1 microM) as well as the MUC5AC positive staining shown by immunohistochemistry. CONCLUSION: Selective PDE4 inhibition is effective in decreasing EGF induced MUC5AC expression in human airway epithelial cells. This effect may contribute to the clinical efficacy of this new drug category in mucus hypersecretory diseases.     

干细胞因子在2,5己二酮所致大鼠睾丸生精障碍模型中的表达

目的　探讨膜型及可溶型干细胞因子 (SCF)的表达与精子生成的关系。方法　 5只成年雄性SD大鼠水饲 2 ,5己二酮 5周 ,建立睾丸生精障碍模型 ;逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)和MIAGS 10 0 0凝胶电泳成像系统分析睾丸组织中两种SCF的表达及其表达水平 ,并与对照组比较。结果　实验组大鼠睾丸重 ( 0 .5 3± 0 .0 5 ) g ,与对照组 ( 1.6 7± 0 .0 7) g比较明显萎缩 ( P <0 .0 1) ;组织切片显示实验组大鼠睾丸生精上皮萎缩 ,仅有支持细胞和精原细胞 ,无成熟的精细胞 ;实验组中膜型和可溶型SCF的相对蛋白含量分别为 2 8.7和 73 .0 ,对照组为 83 .4和 75 .1,显示膜型SCF含量在实验组明显降低 (P <0 .0 1) ,而可溶型SCF无明显变化 (P >0 .1)。结论　膜型SCF表达水平降低可能在 2 ,5己二酮所致大鼠睾丸生精障碍中起重要作用。     

分层共同培养诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的 探讨体外联合HaCaT细胞共同培养诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向表皮细胞分化的可行性.方法 用聚碳酸酯细胞插入板分层后联合共同培养HaCaT细胞与MSCs,观察培养3、6、9d后的细胞形态,进行角蛋白(CK-19、CK-10)、整合素(α6、β1)染色并用流式细胞仪统计细胞阳性率.结果 共同培养后细胞形态变化明显,共培养3、6d后表皮细胞标志物CK-19、α6整合素、β1整合素免疫荧光染色阳性,细胞阳性率分别为9.3％、8.2％、11.5％和21.7％、34.1％、39.6％,CK10表达呈阴性;共培养9d后CK-19、α6整合素、β1整合素、表达较前减少,阳性率为12.2％、18.6％、16.3％,CK1O出现阳性表达,细胞阳性率为10.7％.结论 分层联合HaCaT细胞共同培养可以诱导骨髓干细胞向表皮细胞进行分化.     

表皮干细胞的研究现况

有关干细胞的研究最早起始于20世纪60年代,得益于生物医学实验技术的进步,干细胞的研究取得了众多突破,早已成为生物医学领域研究的热点之一。其中成体干细胞是一类存在于发育成熟机体组织中的具有高度自我更新和增殖潜能的未分化细胞,它们能够进行自我复制和特异分化,至少产生一种高度分化的子代细胞,并在细胞的生长和分化过程中具有主导作用,用于维持组织器官的新陈代谢、生长与凋亡的动态平衡,并可以参与创伤修复。