晚期糖基化终末产物对卵巢原始卵泡的影响

目的探究晚期糖基化终末产物(AGEs)对原始卵泡激活的影响。方法取4日龄ICR小鼠卵巢,将其分别置于基础培养液(空白对照组)、包含200μg/ml牛血清白蛋白(BSA)培养液(溶剂对照组)以及包含200μg/ml AGE-BSA培养液(AGE-BSA组)中进行体外培养,4d后取材检测。HE染色观察各组卵巢卵泡构成比;免疫蛋白印迹法检测AGEs受体(RAGE)和卵泡激活相关指标细胞增殖核抗原(PCNA);免疫组织化学法检测PCNA定位表达。结果与溶剂对照组相比,AGE-BSA组中生长卵泡构成比增加(P0.001),同时伴随着卵巢髓质部原始卵泡的出现;AGE-BSA组RAGE、PCNA的蛋白表达较溶剂对照组显著增加(P0.05),而空白对照组与溶剂对照组间卵泡构成比以及RAGE、PCNA的蛋白表达均无显著差异(P0.05);免疫组织化学结果显示PCNA表达在卵巢各级卵泡卵母细胞和颗粒细胞中。结论 AGEs可能通过AGEs-RAGE轴激活卵巢内的原始卵泡,促进卵泡池耗竭。     

非酶糖基化终末产物抑制大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的生成

目的:研究非酶糖基化终末产物受体(RAGE)在大鼠睾丸Leydig细胞上的表达及非酶糖基化终末产物(AGEs)对大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成的抑制作用。方法:原代培养大鼠睾丸Leydig细胞,RT-PCR和免疫荧光技术检测RACE在大鼠Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理Leydig细胞(25、50、100、200μg/ml),ELISA法测定睾酮分泌量。结果:RT-PCR和免疫荧光结果表明RAGE在大鼠睾丸Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理后,人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的Leydig细胞睾酮合成量呈剂量浓度依赖性下降,与对照组相比,50、100、200μg/ml AGEs处理组差异显著(P0.01)。结论:大鼠Leydig细胞上存在RAGE受体,AGEs显著抑制原代培养大鼠Leydig细胞睾酮的分泌。     

高糖通过PI3K-AKT-mTOR信号通路增加足细胞自噬

目的 研究高糖引起足细胞自噬变化及其相关的信号机制.方法 培养的足细胞被分为6组,正常浓度葡萄糖(NG)组、高浓度葡萄糖(HG)组、NG+雷帕霉素(Rap)组、HG+Rap组、NG+LY294002组和HG+LY294002组.观察自噬增强剂Rap和PI3K抑制剂LY294002对高糖条件下培养的足细胞自噬和凋亡的影响.电镜和吖啶橙染色观察细胞内自噬体的形成;Western印迹检测自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)和自噬血管基因Beclin-1的表达;通过阻断自噬的信号通路观察磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)相关蛋白AKT和mTOR的磷酸化水平的改变.结果 高糖可导致足细胞凋亡增加,促进足细胞内自噬体和自噬相关蛋白表达增加(均P＜ 0.05).与高糖组相比,HG+ Rap组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达增加(均P＜0.05);LY294002部分抑制高糖导致的LC3-Ⅱ和Beclin-1表达增加(均P＜0.05).与高糖组相比,HG+ LY294002组足细胞内AKT磷酸化的水平增加(P＜0.05),mTOR的磷酸化水平降低(P＜0.01);HG+ LY294002组足细胞的AKT和mTOR磷酸化水平较高糖组均降低(均P＜0.05).结论 高糖可促进足细胞的自噬和凋亡,推测高糖诱导的足细胞自噬作用部分通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调节实现的.     

狼疮肾炎患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响

目的探讨狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)患者自噬水平及其对足细胞相关蛋白表达水平的影响。方法选择2017年5月至2019年5月于榆林市第一医院收治的69例LN患者为LN组,50例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者为SLE组,50例肾切除手术患者为对照组,观察3组肾脏足细胞内自噬体数量,比较3组肾脏组织中自噬相关蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3)、B淋巴细胞瘤蛋白质-2-相互作用蛋白(Beclin1)的表达,以及足细胞相关蛋白,肾病蛋白(Nephrin)、足突蛋白(Podocin)的表达。分离狼疮肾炎患者肾脏足细胞,将足细胞分为自噬抑制组和自噬诱导组,自噬抑制组加入100 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA),自噬诱导组加入100 nmol/L雷帕霉素(RAPA),比较3组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin等蛋白的表达。结果LN组、SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);SLE组肾脏足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于LN组(P<0.05);自噬诱导组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于正常对照组、自噬抑制组(P<0.05);正常对照组足细胞内自噬体数量及LC3、Beclin-1、Podocin、Nephrin蛋白表达量显著高于自噬抑制组(P<0.05)。结论LN患者自噬水平呈升高状态,自噬水平升高可能通过上调足细胞相关蛋白Podocin、Nephrin水平而减轻足细胞损伤,抑制LN病情进展。     

GPSM2过表达对人胰腺癌细胞迁移能力的影响

目的:构建G蛋白信号调节蛋白2(GPSM2)稳定高表达的胰腺癌细胞株,探讨GPSM2与人胰腺癌细胞迁移能力的关系。方法:构建GPSM2基因过表达质粒(pCMV-Tag3B-GPSM2)并鉴定,将人胰腺癌MIA-PaCa-2细胞分别转染pCMV-Tag3B-GPSM2(GPSM2转染组)或p CMV-Tag3B空载体(阴性对照组),以无处理的MIA-Pa Ca-2细胞为空白对照,用RT-PCR检测各组细胞GPSM2 mRNA表达;Westernblot检测各组细胞GPSM2、β-连环蛋白(β-catenin)的表达;用Transwell实验检测各组胰腺癌细胞迁移能力。结果:成功构建了GPSM2稳定高表达的重组细胞株。与空白对照组比较,GPSM2转染组细胞GPSM2 mRNA表达量明显上调,达前者73.3倍、GPSM2、β-catenin蛋白表达量明显升高、迁移细胞计数明显增加(均P0.05)。此外,胰腺癌细胞中GPSM2与β-catenin的表达水平呈明显的正向线性关系(P0.05)。阴性对照组与空白对照组间各指标的差异均无统计学意义(均P0.05)。结论:上调胰腺癌细胞中GPSM2的表达能增加胰腺癌细胞的迁移能力,该作用可能与β-catenin蛋白表达升高有关。     

番茄红素对高糖诱导的足细胞自噬以及凋亡的影响

目的探讨番茄红素(Lyc)对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响,旨在为临床治疗糖尿病肾病提供可靠的理论依据。方法采用条件永生化小鼠足细胞系为研究对象,通过添加不同剂量的Lyc对高糖诱导的足细胞进行干预。实验细胞分6组,分别为正常对照组(5.5m m ol/L葡萄糖)、高渗对照组(5.5 m m ol/L葡萄糖+1 9.5 m m ol/L甘露醇)、高糖组(2 5 m m ol/L葡萄糖)、低剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+3.125μmol/L Lyc)、中剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+6.25μmol/L Lyc)和高剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+12.5μmol/L Lyc)。在细胞培养4 8 h后,用吖啶橙染色法观察各组细胞的自噬体变化情况;流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率变化;采用实时定量荧光PCR和蛋白质印迹法分别检测自噬相关基因LC3、beclin-1、p62/SQSTM I m RNA和蛋白的表达变化情况。结果与正常对照组、高渗对照组相比,高糖组细胞中的自噬体数目明显增多,细胞的凋亡率极显著增加(P0.01),自噬相关基因LC3-II、beclin-1的表达量显著增加(P0.05),而p62/SQSTMI基因的表达量则显著降低(P0.05)。与高糖组比较,不同剂量Lyc组中的足细胞自噬体数目更多;细胞的凋亡率显著降低(P0.05),且高剂量Lyc组细胞的凋亡率降低极显著(P0.01);自噬相关基因LC3-II、beclin-1表达量显著增加(P0.05);而p62/SQSTMI基因表达量则显著降低(P0.05);且高剂量Lyc组基因表达量变化极显著(P0.01);蛋白水平上的检测结果与mRNA水平基本一致。结论Lyc能进一步增强高糖诱导引起的足细胞的自噬,但对足细胞的凋亡却起到了一定的抑制作用,且高剂量的Lyc作用效果更加明显。     

益肾胶囊含药血清对高糖环境下肾小球足细胞自噬的影响

目的:观察益肾胶囊含药血清对高糖环境下小鼠肾小球足细胞自噬的影响。方法:制备不同浓度益肾胶囊含药血清,对体外培养的小鼠肾小球足细胞进行分组干预,细胞分为:正常组(NG)、高糖组(HG)、低浓度益肾胶囊含药血清组(LY)、中浓度益肾胶囊含药血清组(MY)、高浓度益肾胶囊含药血清组(HY)、贝那普利含药血清组(BP)。Western Blot检测自噬相关LC3蛋白及泛素结合蛋白p62(p62/SQSTMl)蛋白的表达变化。透射电镜下观察各组足细胞内自噬体的变化。结果:与NG组相比,HG组足细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达减少,泛素结合蛋白p62(p62/SQSTMl)表达增多(P0.05);与HG组相比,HY组足细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达增多,泛素结合蛋白p62(p62/SQSTMl)表达减少(P0.05)。透射电镜提示,与HG组相比,HY组足细胞自噬体增多(P0.05)。结论:高糖可导致足细胞自噬障碍,而益肾胶囊可通过改善其自噬障碍,进而发挥足细胞保护的作用。     

陈氏益气活血化湿方通过调控足细胞自噬减轻PAN诱导的足细胞损伤

目的:本研究旨在观察陈氏益气活血化湿方水溶剂对氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导足细胞损伤的保护作用,并探讨这一作用与足细胞自噬(autophagy)的关系。方法:体外培养永生化小鼠足细胞系作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)、western bloting法检测不同浓度PAN对足细胞的存活率的影响,建立PAN诱导的足细胞损伤模型。后将足细胞分为:正常组、PAN组、PAN+中药低剂量组、PAN+中药高剂量组,采用western bloting法检测足细胞p-mTOR、mTOR、LC3、synaptopodin蛋白的表达情况。结果:(1) CCK-8、western bloting检测结果显示50μg/ml浓度时P-mTOR表达最明显(P 0. 001),确定为造模浓度;(2) PAN造成足细胞p-mTOR表达升高,LC3II、synaptopodin蛋白表达降低(P 0. 05),mTOR磷酸化水平升高,足细胞自噬功能受到抑制,足细胞骨架蛋白表达降低(P 0. 01),足细胞受损;(3)陈氏益气活血化湿方水溶剂处理细胞后p-mTOR表达降低,LC3II、synaptopodin蛋白表达升高(P 0. 05),且高剂量组效果优于低剂量组。结论:陈氏益气活血化湿方水溶剂可能是通过上调足细胞自噬功能,发挥足细胞保护作用。     

N-乙酰半胱氨酸对AGEs诱导的HK-2细胞IL-1β、IL-6的抑制作用

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(Nac)对终末糖基化产物(AGEs)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)IL-1β(白介素-1β)、IL-6(白介素-6)的抑制作用。方法:将体外培养的HK-2细胞分成正常对照组(NG组)、AGEs组、药物干预组1(N1组)、药物干预组2(N2组),培养72 h,应用反转录实时定量聚合酶链式反应(RT-qP CR)方法检测IL-1β和IL-6 mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中细胞因子的蛋白浓度。蛋白质印迹法(Western blot)检测NF-κB/p65的含量。结果:NG组、AGEs组、N1组和N2组细胞内IL-1β和IL-6 mRNA和蛋白表达,以及NF-κB/p65含量差异均有统计学意义;与NG组比较,AGEs组细胞内IL-1β和IL-6mRNA和蛋白表达明显增加。N1、N2组较AGEs组表达水平下降,AGEs组NF-κB/p65含量高于其他组,差异均具有统计学意义(均P 0. 05)。结论:AGEs可诱导HK-2细胞表达IL-1β和IL-6,NF-κB信号通路可能参与了此过程。     

金雀异黄素对终末糖基化产物刺激大鼠系膜细胞终末糖基化产物受体表达的影响

目的 研究金雀异黄素(Gen)对终末糖基化产物(AGEs)刺激下其系膜细胞受体(RAGE)表达的影响。方法 以AGEs刺激高糖培养的SD大鼠系膜细胞,采用细胞免疫组化法检测系膜细胞RAGE表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞内.RAGEmRNA水平;比色法检测细胞内丙二醛(MDA)水平。结果 AGEs刺激高糖培养的系膜细胞后RAGE表达及RAGEmRNA水平明显增加(P<0.05);MDA水平显著增加(P<0.01)。Gen能有效抑制RAGE及其:mRNA的表达,减少MDA水平,且呈时间和浓度依赖效应,以200μmol／L作用48 h效果最显著(P<0.01)。结论 体外模拟糖尿病环境下,AGEs刺激使。肾系膜细胞内RAGE高表达。Gen可以下调AGEs刺激后系膜细胞RAGE的异常表达,其可能的机制是阻断了氧化应激介导的AGEs-RAGE之间的正反馈途径,表现为细胞内MDA含量减低。     

阿霉素诱导的足细胞转分化中β-catenin及TGF-β的变化及活性维生素D_3的干预作用

目的:探讨阿霉素诱导的足细胞转分化(EMT)中β-catenin及TGF-β的变化及活性维生素D3干预作用。方法:以体外培养的小鼠足细胞系为研究对象,分6组进行实验:正常组(C组)、阿霉素组(即模型组,ADR组)、低剂量活性维生素D3组(LVD组)、高剂量活性维生素D3组(HVD组)、缬沙坦组(ARB组)、缬沙坦+高剂量活性维生素D3组(AHVD组)。各实验组干预24 h、48 h时通过RT-PCR检测β-catenin、TGF-βmRNA的表达,Western Bolt检测β-catenin蛋白的表达。结果:用药物干预24 h及48 h时,与正常对照组相比,ADR组足细胞β-catenin mRNA及蛋白表达均上调(P<0.01);与ADR组相比,四个药物干预组(ARB组、LVD组、HVD组、AHVD组)β-catenin mRNA及蛋白表达均下调(P<0.05)。24 h时与正常对照组相比,ADR组TGF-βmRNA表达上调(P<0.01);与ADR组相比,四个药物干预组TGF-βmRNA表达明显下调(P<0.01)。48 h时与正常对照组相比,ADR组TGF-βmRNA表达上调(P<0.01);与ADR组相比,HVD组与AHVD组TGF-βmRNA表达明显下调(P<0.01),而LVD组及ARB组无显著下降(P>0.05)。结论:活性维生素D3通过抑制信号转导通路中β-catenin、TGF-β的表达而抑制足细胞发生EMT。     

异氟醚后处理对局灶性脑缺血-再灌注大鼠海马神经损伤的影响

目的观察异氟醚后处理是否通过Wnt/β-catenin信号通路减轻局灶性脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)大鼠海马神经元损伤。方法 60只雄性SD大鼠随机分为五组,每组12只。采用大脑中动脉栓塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血90min、再灌注24h制备大鼠局灶性CIRI模型:假手术组(S组)、模型组(M组)、异氟醚后处理+模型组(MI组)、Wnt/β-catenin拮抗剂Dicckkopf-1(DKK-1)+异氟醚后处理+模型组(MDI组)、DKK-1+模型组(MD组)。S组仅分离暴露一侧颈内动脉,不插入线栓。MI和MDI组于再灌注即刻行1.5%异氟醚后处理60min。MDI组和MD组于建立模型前30min行侧脑室注射DKK-1(5μg/kg)。所有模型组大鼠在再灌注24h后,采用Longa评分法进行神经行为学评分,HE染色观察神经细胞形态学变化,免疫组化检测大鼠海马CA1区β-catenin的表达,Tunel荧光检测大鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况,Western Blot检测Bcl-2、Bax、β-catenin及GSK-3β蛋白含量,并计算Bcl-2/Bax比值。结果与S组比较,M组大鼠神经行为学评分、神经细胞损伤及凋亡数目、Bax以及GSK-3β蛋白含量均明显增加(P0.05),而β-catenin蛋白含量及Bcl-2/Bax比值明显减少(P0.05)。与M组比较,MI组大鼠神经行为学评分、神经细胞损伤及凋亡数目以及Bax蛋白含量明显减少(P0.05),Bcl-2和β-catenin蛋白含量以及Bcl-2/Bax比值明显增加(P0.05)。与MI组比较,MDI组大鼠神经行为学评分、神经细胞损伤及凋亡数目及Bax、GSK-3β蛋白含量明显增加(P0.05),而Bcl-2、β-catenin蛋白含量及Bcl-2/Bax比值明显减小(P0.05)。结论异氟醚后处理可能是通过影响Wnt/β-catenin信号通路,调控Bcl-2及Bax的表达,从而减轻局灶性CIRI大鼠海马神经元损伤。     

1,25(OH)2D3对人骨肉瘤MG63细胞基质GLA蛋白及Wnt信号通路的影响

目的观察1,25(OH)_2D_3对人成骨肉瘤MG63细胞株Wnt信号通路及MGP表达的影响,探讨其在骨质疏松发病中可能的新机制。方法分别使用10-8mol/L 1,25(OH)_2D_3、200 ng/ml Wnt信号通路阻断剂DKK-1、10-8mol/L 1,25(OH)_2D_3+200 ng/ml DKK-1干预人骨肉瘤细胞MG63细胞株48 h,使用实时荧光定量RT-PCR及western-blot技术测定Wnt/β-catenin信号通路中相关因子β-catenin、Runx2、LRP5及MGP基因及蛋白表达的影响。结果 (1)10-8mol/L 1,25(OH)_2D_3上调MG63细胞中Wnt/β-catenin信号通路中相关因子β-catenin、Runx2、LRP5及MGP的基因表达及蛋白的表达,其中上调基因分别是对照组的2.73倍、3.72倍、1.53倍、2.31倍,差异有统计学意义(P0.05);上调蛋白表达分别是对照组的1.13倍、1.17倍、1.14倍、1.21倍,差异有统计学意义(P0.05)。(2)DKK1下调β-catenin、LRP5、Runx2、MGP的基因及蛋白表达,其中下调基因表达分别是对照组的0.34倍、0.52倍、0.42倍、0.78倍,差异有统计学意义(P0.05)。下调蛋白表达分别是对照组的0.93倍、0.92倍、0.87倍、0.86倍,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 1,25(OH)_2D_3有可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响MGP的表达。     

HMGB1促进血管平滑肌细胞增殖与迁移的机制研究

目的:探讨高迁移率蛋白B1(HMGB1)促进血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与迁移的机制。方法:检测人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)与HMGB1孵育后增殖与迁移的活性、晚期糖基化终产物受体(RAGE)与P38MAPK表达改变,以及RAGE抗体、P38MAPK抑制剂SB203580预处理的影响。结果:HMGB1孵育后,HA-VSMC增殖与迁移活性、RAGE和P38MAPK的表达均明显增加(均P0.05),且均呈一定的浓度依赖性。用RAGE抗体和SB203580预处理后,HMGB1促进HA-VSMC增殖及迁移的作用均被明显抑制(均P0.05),RAGE抗体预处理后,HMGB1对P38MAPK表达的诱导作用明显抑制(P0.05)。结论:HMGB1可能通过与细胞表面RAGE受体结合,激活P38MAPK表达进而促进VSMC的增殖及迁移。     

阿魏酸钠对大鼠脊髓损伤中NLRP3炎性小体的影响及机制

目的:探究阿魏酸钠(SF)对大鼠脊髓损伤(SCI)模型中NLRP3炎性小体的影响及机制。方法:体内研究采用压迫法建立大鼠脊髓损伤模型,雌性SD大鼠随机分成3组(n=12),Sham组不损伤脊髓,SCI+SF组按100mg/kg/d的剂量连续腹腔注射SF给药7d,SCI组给予等量的生理盐水溶液,术后第3天提取脊髓组织蛋白进行Western blot检测NLRP3和激活效应蛋白pro-caspase-1、P20、IL-1β以及自噬蛋白P62、LC3Ⅱ的表达,并对脊髓样本进行免疫荧光染色观察NLRP3变化,术后第7天对脊髓样本进行Nissl染色检测神经元存活情况。体外实验中对大鼠小胶质细胞(正常培养为对照组)采用LPS诱导NLRP3表达(LPS组),加入自噬阻断剂氯喹(CQ)(CQ组及LPS+CQ组)检测NLRP3激活效应以及溶酶体组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)活性,验证自噬与溶酶体功能对NLRP3激活的影响,再通过SF干预(LPS+CQ+SF组)带来的分子水平变化探讨其中的机制。结果:与Sham组相比,SCI组NLRP3表达升高并被激活,pro-caspase-1降解减少,活性产物P20、IL-1β增多,且自噬蛋白p62、LC3Ⅱ均在较高水平(P0.05);与SCI组比较,SCI+SF组NLRP3数量减少,激活减弱,P62、LC3Ⅱ水平下降(P0.05),Nissl染色显示前角神经元存活情况改善(P0.05)。与之相似,体外实验中,相比对照组,LPS组细胞NLRP3的表达上升(P0.05),但激活不显著,而LPS+CQ组NLRP3的水平更高,激活明显,pro-caspase-1降解,活性产物P20、IL-1β增多,此外,P62、LC3Ⅱ的水平异常升高,CTSB活性下降(P0.05),而相比LPS+CQ组,LPS+CQ+SF组中P62、LC3Ⅱ的水平出现同步下降,CTSB活性增强(P0.05),自噬流恢复。结论:阿魏酸钠通过保护自噬和溶酶体的功能,能够抑制NLRP3炎性小体的产生和激活,从而减轻SCI大鼠神经细胞损伤。     

雷公藤甲素对PAN致足细胞损伤中自噬作用的影响

目的:通过观察雷公藤甲素对氨基核苷嘌呤霉素(puromycin amino nucleotide,PAN)损伤足细胞的m TOR通路及自噬水平的影响,探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对m TOR-自噬通路的影响及其保护足细胞的可能机制。方法:体外培养的小鼠足细胞系(MPC5)为研究对象,PAN分别不同时间(0 h、1 h、3 h、4 h、6 h、24 h)刺激小鼠足细胞,检测p-m TOR、Beclin1、synaptopodin表达含量的变化,成功构建PAN致足细胞损伤模型。后将足细胞随机分为以下4组:(1)对照组(Con组);(2)PAN组(PAN组,PNA 50μg/ml);(3)雷帕霉素(rapamycin,Rap)组(Rap组,PNA 50μg/ml+RAP 200 ng/ml);(4)PAN+TP组(TP组,PNA 50μg/ml+TP 10 ng/ml)。各组培养时间均为4 h;采用western blot检测足细胞p-m TOR、p-Akt、p-ULK1、LC3、Beclin-1、Synaptopodin蛋白表达量。结果:PAN处理不同的时间梯度,与Con组相比,PAN处理4 h后,诱导p-m TOR的表达、减少Beclin1、synaptopodin表达(P0.05),成功建立PAN作用致体外足细胞损伤模型。与PAN组比较,雷公藤甲素可使p-m TOR、p-ULK1及p-Akt的表达明显上调(P0.05),而LC3、Beclin1及Synaptopodin的表达明显下降(P0.05)。结论:实验表明足细胞损伤可能与足细胞内自噬水平的变化有关,PAN刺激可能呈时间依赖性通过m TOR通路降低足细胞自噬水平,诱导足细胞损伤;雷公藤甲素可能通过作用m TOR通路调节足细胞自噬水平,从而对足细胞起保护作用。     

白藜芦醇通过Wnt/β-catenin信号通路调控髓核细胞细胞外基质表达

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)表达的调控作用及其相关分子机制。方法选取临床上接受椎间盘摘除术的10例患者,其中5例为年轻脊柱爆裂骨折患者,作为对照组;余5例为老年腰椎间盘突出症患者,作为退变组。取两组患者髓核组织,免疫组织化学染色比较β-catenin的原位表达,Western blot检测β-catenin、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白表达。取退变组髓核组织分离、培养NPC,分别用IL-1β单独(B组)或联合RES(C组)刺激第3代NPC,并设未刺激细胞作为空白对照组(A组),Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。进一步采用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)靶向沉默SIRT1和β-catenin后,采用Western blot、实时荧光定量PCR检测β-catenin、SIRT1蛋白和基因表达。用完全培养基(1组)、IL-1β(2组)、RES+IL-1β(3组)、SIRT1-si RNA+RES+IL-1β(4组)刺激第3代NPC培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测β-catenin核转位情况;用完全培养基(Ⅰ组)、IL-1β(Ⅱ组)、IL-1β+β-catenin-si RNA(Ⅲ组)、IL-1β+RES(Ⅳ组)、IL-1β+RES+SIRT1-si RNA(Ⅴ组)刺激第3代NPC培养24 h后,采用Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。结果免疫组织化学染色及Western blot检测示,与对照组比较,退变组髓核组织中β-catenin阳性表达的细胞比例显著升高(t=4.616,P=0.010);β-catenin蛋白相对表达量显著升高,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白相对表达量显著下降(P0.05)。细胞学实验发现,B组β-catenin蛋白相对表达量显著高于A、C组,Ⅱ型胶原和Aggrecan相对表达量显著低于A、C组(P0.05)。si RNA转染后,Western blot检测显示SIRT1、β-catenin蛋白表达显著降低(P0.05)。细胞免疫荧光染色结果进一步提示与3组相比,4组SIRT1被si RNA沉默后,RES减弱的β-catenin核转位现象加剧。Western blot检测示,Ⅱ组Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅰ组明显降低(P0.05);Ⅲ组NPC转染β-catenin-si RNA后,IL-1β对ECM的降解作用被明显抑制,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅱ组明显升高(P0.05);Ⅴ组NPC转染SIRT1-si RNA后,抑制了RES对ECM降解的保护作用,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅳ组明显降低(P0.05)。结论 RES可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路维持NPC ECM的表达,为椎间盘退行性疾病的治疗提供了新思路。     

精索静脉曲张大鼠睾丸自噬对生精细胞的影响

目的:研究精索静脉曲张(VC)大鼠模型中睾丸不同水平自噬对生精细胞凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠54只随机分为6组:空白对照组、雷帕霉素对照组、氯喹对照组各6只,VC组、VC+雷帕霉素组、VC+氯喹组各12只。采用HE染色观察睾丸、附睾组织形态学变化,并对睾丸及附睾中精子形成情况进行评分,TUNEL染色检测生精细胞凋亡指数(AI),Western印迹检测LC3、p62、Bax、Bcl-2的表达。结果:空白对照组、雷帕霉素对照组、氯喹对照组大鼠睾丸及附睾组织均未发生明显形态学变化,精子形成情况评分及AI亦无显著差异(P>0.05);VC组大鼠睾丸及附睾组织发生明显病理损伤,精子形成情况评分显著降低(P<0.01),AI显著升高(P<0.01),但VC+雷帕霉素组较VC组明显改善,而VC+氯喹组较VC组轻度加重。此外,与空白对照组比较,VC组自噬相关蛋白LC3(包括LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值)和促凋亡蛋白Bax表达显著增加(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表达则显著降低(P<0.01);且VC+雷帕霉素组LC3与Bcl-2表达显著高于VC组(P<0.01),p62和Bax表达则显著低于VC组(P<0.01);而VC+氯喹组LC3与Bcl-2表达显著低于VC组(P<0.01),p62和Bax的表达则显著高于VC组(P<0.01)。结论:VC可诱导大鼠睾丸自噬和生精细胞凋亡,上调自噬可抑制生精细胞凋亡,阻滞自噬则可促进生精细胞凋亡。     

自噬激活对带状疱疹后神经痛模型小鼠脊髓背角GABA能神经元凋亡的影响

目的探讨不同自噬程度对带状疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia,PHN)模型小鼠脊髓背角GABA能神经元凋亡的影响。方法使用SPSS 19.0的随机数字发生器将48只昆明小鼠,6~8周龄,体重18~22 g,随机分为树脂毒素+自噬诱导剂组(PHN+Rapa组)、树脂毒素组(PHN组)、树脂毒素+自噬抑制剂组(PHN+3-MA组)和空白对照组(C组),每组12只。C组不做任何处理,其余各组均腹腔注射0.2μg/g树脂毒素(resiniferatoxin,RTX)制备PHN模型。在构建模型成功后,PHN+Rapa组给予1μg·kg-1·d-1的自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa),PHN组给予生理盐水,PHN+3-MA组给予2μg·kg-1·d-1的自噬抑制剂3-MA,连续14 d腹腔注射。检测机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)、热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)至稳定后处死各组小鼠,采用荧光Tunel法检测脊髓凋亡细胞数;提取脊髓L4~6节段组织,采用Western blot法检测抑凋亡蛋白bcl-2、促凋亡Bax和自噬相关蛋白LC3的相对表达量;免疫荧光标记脊髓背角GABA能神经元数。结果与C组比较,PHN+Rapa组、PHN组和PHN+3-MA组的LC3-II/I和Bax的蛋白相对表达量均明显升高,凋亡细胞数量明显增多,bcl-2蛋白相对表达量明显降低,脊髓背角GABA能神经元数明显减少(P0.05);与PHN组比较,PHN+Rapa组的LC3-II/I比值和Bax的蛋白相对表达量,凋亡细胞数量明显增多,bcl-2蛋白相对表达量明显降低,脊髓背角GABA能神经元数明显减少(P0.05)。与PHN组比较,PHN+3-MA组的LC3-II/I比值和Bax的蛋白相对表达量明显降低,凋亡细胞数量明显减少,bcl-2蛋白相对表达量明显升高,脊髓背角GABA能神经元数明显增多(P0.05)。结论自噬过度激活可能是导致带状疱疹后神经痛脊髓背角GABA能神经元凋亡的机制之一。     

骨质疏松合并骨关节炎患者血清中Wnt通路调节因子研究

目的 探讨骨质疏松(osteoporosis,OP)合并骨关节炎（osteoarthritis,OA）患者血清中β-catenin、Dickkopf-1（DKK-1）和Matrix metalloproteinase-9（MMP-9)的表达模式及其与临床参数的相关性。 方法 选取2017年1月至2018年3月在本院就诊的肌肉骨骼疾病患者158例,根据其症状分为OP（58例）、OA（52例）和OP＋OA（48例）,另外选取40例健康个体作为对照组。所有受试者血清中的β-catenin、DKK-1和MMP-9表达量采用酶联免疫吸附方法（enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA）进行检测。用Pearson相关性分析方法来检测这三种因子的表达量和临床参数：红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR) 、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP) 、骨密度（bone mineral density,BMD）,分析三者之间的关系。 结果 各组参与者在年龄上和体质量指数上无明显差别（P=0.356,P=0.438)。各组骨骼疾病患者（OP、OA和OP＋OA）在性别比例上均约为1：2。与健康组相比,OP＋OA组患者血清中的β-catenin含量明显下降（P=0.024),而DKK-1（P=0.013)和MMP-9（P=0.003) 的表达水平显著升高,这种表达模式和OP组患者的表达模式相似。在OP＋OA组中β-catenin含量比OP组明显升高（P=0.047),但比OA组明显降低（P=0.018);而DKK-1和MMP-9含量与OP组（P=0.041/0.007)和OA组（P=0.006/0.002)相比明显升高。Pearson相关分析显示OP+OA组患者血清β-catenin和DKK-1与临床参数ESR/CRP存在相关性（r =0.713/0.621,r =0.462/0.321);β-catenin和腰椎BMD/股骨颈BMD存在正相关（r =0.425/0.545),但DKK-1与腰椎BMD/股骨颈BMD 呈负相关（r = -0.376/-0.315);MMP-9仅和腰椎BMD/股骨颈BMD存在弱负相关性（r = -0.525/-0.324)。 结论 OA+OP组血清β-catenin、DKK-1和MMP-9的表达不是OP组与OA组相关产物的简单混合。β-catenin/DKK-1/MMP-9与OP/OA临床参数的相关性表明这些因子表达的变化可作为临床炎症程度和骨质量诊断的参考。