Effects of cyclic tension stress on proliferation of fibroblasts

目的 探讨周期性张应力对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞增殖特性的影响.方法 将体外培养的L929细胞分为加力组与对照组,加载周期性张应力的细胞为加力组,不加力的为对照组.应用细胞应力加载系统对L929细胞加载8％形变率、0.1 Hz的周期性张应力,分别在加力1h、2h、4h和8h后应用流式细胞仪分析细胞周期；四甲基偶氮唑盐比色法分析细胞的增殖活性.结果 加力组加力1 h(q =5.532,P＜0.01)与2 h(q=6.569,P＜0.01),S期细胞比率(S-phase fraction,SPF)较对照组出现了下降,并伴有细胞数量的增加(P＞0.05)；加力组在加力4h后,SPF较对照组下降(P＞0.05),细胞数量增加(P＞0.05)；加力组在加力8h后,SPF较对照组开始出现增高(q =4.287,P＜0.05),细胞数量显著增加(q=5.202,P＜0.01).结论 8％形变率、0.1 Hz的周期性张应力引起细胞增殖活性的变化,表现为随应力加载时间的延长,细胞的增殖活性出现先被抑制、后被促进的改变.     

周期性张应力对成纤维细胞增殖能力的影响

目的探讨周期性张应力对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞增殖特性的影响。方法将体外培养的L929细胞分为加力组与对照组,加载周期性张应力的细胞为加力组,不加力的为对照组。应用细胞应力加载系统对L929细胞加载8%形变率、0.1 Hz的周期性张应力,分别在加力1 h、2 h、4 h和8 h后应用流式细胞仪分析细胞周期;四甲基偶氮唑盐比色法分析细胞的增殖活性。结果加力组加力1 h(q=5.532,P<0.01)与2 h(q=6.569,P<0.01),S期细胞比率(S-phase fraction,SPF)较对照组出现了下降,并伴有细胞数量的增加(P>0.05);加力组在加力4 h后,SPF较对照组下降(P>0.05),细胞数量增加(P>0.05);加力组在加力8 h后,SPF较对照组开始出现增高(q=4.287,P<0.05),细胞数量显著增加(q=5.202,P<0.01)。结论 8%形变率、0.1 Hz的周期性张应力引起细胞增殖活性的变化,表现为随应力加载时间的延长,细胞的增殖活性出现先被抑制、后被促进的改变。     

TUNEL法和Annexin V-FITC流式细胞分析法检测成纤维细胞凋亡的对比研究

目的通过Annexin V-Fitc流式细胞分析法和TUNEL法检测凋亡,比较两种方法的优缺点。方法以成纤维细胞为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统,分别给予周期性张应力(频率为10个循环/min,每一循环包括3 s收缩/3 s舒张,力值定为12%)刺激6、12、24 h,并设立正常对照组。采用TUNEL染色法和Annexin VFitc流式细胞法检测成纤维细胞凋亡。结果 TUNEL染色结果显示,实验组较对照组的细胞核固缩,边界清楚,胞质淡染,染色质呈特异的棕黄色着染,而正常细胞的胞核不着染。流式细胞仪实验结果显示,实验组的G0/G1期的细胞比例明显增多,相对应的S期细胞比例明显减少,而在G2/M期较对照组却出现了明显的变化,6、12h组DNA含量分别为352.0±1.0、301.1±1.1,较未加力组255.2±1.7有显著延长,而24 h加力组DNA含量303.4±10.6与6 h组比较细胞周期却出现了缩短。结论Annexin V-Fitc流式细胞分析法特异性高,TUNEL法灵敏度高,两种方法相结合检测细胞凋亡更准确。     

尼古丁对牙周膜成纤维细胞的细胞毒性研究

目的体外研究尼古丁对牙周膜成纤维细胞（PDLFs）的细胞毒性作用,探讨尼古丁对牙周病的影响。方法用不同浓度的尼古丁作用于PDLFs,采用MTT比色法于24、48、72h测量细胞的活性：采用流式细胞仪技术于48h检测细胞周期和凋亡率。结果尼古丁抑制PDLFs细胞的生长．随着浓度的增加和时间的延长,抑制率明显增强;细胞周期分布发生了改变,G0／G1期的细胞DNA含量与正常对照组相比．明显增加．而G2期和S期则逐渐减少,同时出现了较高的凋亡率．周期阻滞及凋亡率随着浓度的递增而增加。结论尼古丁可能通过导致PDLFs细胞凋亡、抑制该细胞的增殖并使其DNA合成减少而导致牙周病的发生。     

牵张力作用下人牙髓细胞HIF-1α和VEGF的表达

目的:研究牵张力作用下人牙髓细胞HIF-1α和VEGF基因的表达变化,探讨 HIF-1α和VEGF与正畸牙髓组织维持内环境稳定的关系.方法:通过细胞牵张应力加载系统,对细胞施加频率为1.0 Hz、大小为15％形变率的牵张应力,分别加力6h、12h、24h、48 h和72 h实时定量PCR检测不同时间点HIF-1α和VEGF mRNA的表达变化采用SPSS 12.0软件包对数据进行统计学分析 结果:未加力前,HIF-1 αmRNA表达极其微弱;加力6 h时,表达开始升高(P＜0.05);持续增加至24 h时,表达最显著(P＜0.05);加力48 h时,表达缓慢下降(P＜0.01);至加力72 h时,表达下降至未加力前(P＞ 0.05).未加力前,VEGFmRNA表达微弱,加力6h表达开始升高,但无显著差异(P＞0.05);加力12 h 时,VEGF mRNA表达开始明显增强(P＜0.05),持续增加至72 h加力结束时(P＜0.05).结论:牵张力可诱导人牙髓细胞HIF-1α和VEGF mRNA的表达变化,两者可能在维持正畸受力后牙髓内环境稳定中发挥重要作用.     

周期性张应力对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的 探讨周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)增殖的影响及其机制。方法采用多通道细胞牵张应力加载系统,以hPDLF为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型。加力组分别给予1、2、4、6、12和24h的力学刺激,刺激幅度10％、频率为0.1 Hz。以静态组为对照组。应用细胞计数试剂-8(CCK-8)检测hPDLF增...     

压力对髁突软骨细胞增殖及TGF-β_lmRNA表达影响的体外研究

目的 :观察体外单层培养的髁突软骨细胞加载机械压力后增殖活性和转化生长因子βlmRNA(TGF βlmRNA)表达在不同时点的变化 ;对压力刺激导致的TGF βlmRNA表达与软骨细胞增殖之间的关系进行初步探讨。材料和方法 :选用新生SD大鼠的髁突软骨作为原代培养的组织来源 ,建立髁突软骨细胞有限细胞系 ;应用自行设计的静压力加载装置对培养细胞加载强度为 12 0 g/cm2的持续压力 1h。分别于加力后 0、6、12、18、2 4h收集样本 ,用流式细胞仪分析各样本中细胞的DNA含量和细胞周期并计算增殖指数 ;用原位杂交技术检测压力作用后细胞TGF βlmRNA的表达 ,以彩色病理图象分析仪检测各样本表达的阳性率。对照组细胞除不加力外 ,其它培养条件和检测方法与实验组相同。结果 :加力后 0h体外培养的髁突软骨细胞增殖活性和S期细胞百分比在加力结束时都较对照组增大 (P <0 .0 5 ) ,但在加力后 12h恢复 ,12～ 2 4h内实验组细胞增殖指数和S期细胞比例与对照组保持相同的变化趋势和相似的水平 ;实验组TGF βlmRNA表达在停止加力后 0h也较对照组明显增强 (P <0 .0 5 ) ,但 6h左右即恢复到与对照组相似的水平 ,之后 6～ 2 4h内的变化与对照组比较无明显差别。结论 :(1)本研究所设计的压力加载装置以气体为介质对细胞施加稳定、     

持续牵张促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化机制的研究

目的:研究p38MAPK在持续性机械牵张力促进C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制。方法:C57BL/6J小鼠BMSCs被随机分为对照组和牵张力阻断组。牵张力阻断组预先用p38MAPK特异性阻断剂SB203580处理1 h,后用Flexercell加力仪加载0.5Hz,0.8%的牵张力。对照组不做特殊处理。分别对两组细胞施加0、30 min和60 min的牵张力。采用Western blot检测P-p38MAPK蛋白的表达情况,Real time-PCR检测成骨基因ALP、COL I、OCN mRNA的表达变化。结果:C57BL/6J小鼠BMSCs传代后细胞生长状态稳定,呈梭形,具有多向分化潜能。Real time-PCR结果显示对照组BMSCs中ALP、COL I、OCN mRNA表达在不同时间点(30 min与0 min,60 min与30 min)间差异均有统计学意义(P<0.05);对照组ALP、COLI、OCN的表达量均明显高于同一时间点(30 min和60 min)牵张力阻断组(P<0.05)。Western blot结果显示,对照组内BMSCs中P-p38MAPK的蛋白水平在不同时间点间(30 min与0 min,60 min与30 min)差异均有统计学意义(P<0.05);对照组P-p38MAPK蛋白的表达量均明显高于同一时间点(30 min和60 min)牵张力阻断组(P<0.05)。结论:所采用的0.5 Hz,0.8%的机械牵张力在持续牵张力下可通过p38MAPK 通路促进小鼠BMSCs向成骨细胞分化。     

间歇性机械牵张力对人牙周膜成纤维细胞增殖动力学的影响

目的　观察间歇性机械牵张力作用下,人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)增殖动力学的变化,探究机械力介 导的牙周组织改建的可能机制。方法　体外培养hPDLFs,取第4~7代细胞,通过四点弯曲细胞力学加载仪对细胞 加载不同力值大小的间歇性机械牵张力(1 000,2 000,3 000μstrain),分别在不同时间点收集细胞,流式细胞仪测定 细胞DNA含量,计算增殖指数(PI)。结果　机械牵张力影响hPDLFs增殖活性。1 000μstrain和2 000μstrain机械牵 张力组与对照组相比,均能促进细胞增殖,hPDLFs DNA含量增多(P<0·05),增殖指数升高(P<0·05);3 000μstrain 机械牵张力组与对照组比较,增殖指数无差异(P>0·05),但抑制细胞DNA合成(P<0·05)。结论　一定力值范围 的机械牵张力能促进hPDLFs的增殖活性,过大力值的机械牵张力反而抑制细胞增殖。     

周期性牵张力调节人牙周膜细胞成骨相关基因表达的研究

目的探讨牵张力诱导体外培养的人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，HPDLC）成骨分化的基因调控机制。方法通过体外细胞加载系统对培养的人牙周膜细胞施加12％形变率、6周／min的周期性牵张力48h，使用点样数为96点的人骨再生基因表达谱芯片检测周期性牵张力加载组细胞成骨相关基因表达的变化。结果HPDLC在周期性牵张力作用下有21种成骨相关基因的表达明显升高，包括10种生长因子和相关分子，10种细胞外基质和相关蛋白，1种细胞黏附分子。有2种基因表达明显下降，包括1种生长因子和相关分子，1种细胞黏附分子。结论周期性牵张力作用于体外培养的HPDLC，可以通过调节部分成骨相关基因的表达，诱导牙周膜细胞的成骨分化。     

牵张力作用下培养的人牙周膜成纤维细胞生成NO的实验研究

目的：观察在机械牵张力作用下牙周膜成纤维细胞NO的生成情况以及iNOS的表达情况。方法：用自行研制的细胞加载系统，对培养至第4代的人牙周膜成纤维细胞施以频率为每分钟6个周期（5s拉伸，5s松弛）、拉伸率为12％的牵张力，分别于加载后3，10，20，40，60min取上清液进行NO含量检测；以及于加载24，48，96h后固定细胞，进行iNOS免疫组化反应。结果：NO含量在所研究时间范围内逐渐增加；iNOS免疫组化结果显示iNOS的染色强度随着作用时间延长而增强。结论：牙周膜成纤维细胞在机械牵张力作用下合成NO增多，它可能通过合成和释放NO这一途径，在应力作用下的牙周组织改建过程中起作用。     

尼古丁对人牙周韧带成纤维细胞增殖和细胞周期的影响

目的：研究尼古丁（nicotine）对人牙周韧带成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）增殖和细胞周期的影响.方法：用不同浓度尼古丁分别在不同时间作用于PDLFs,用MTF比色法及流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞增殖和细胞周期.结果：尼古丁能明显抑制PDLFs增殖,呈剂量依赖性和时间依赖性;FCM结果表明,经尼古丁作用后,PDLFsG0-G1期细胞百分比显著增加（P＜0.01）,G2-M期细胞、S期细胞百分比显著下降（P＜0.01）,反映细胞增殖和性的增殖指数PI值（S＋G2M）随着浓度的递增而下降.结论：尼古丁可抑制PDLFs增殖并减少细胞DNA合成.     

机械拉伸对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原及蛋白合成的影响

目的：研究拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞I型胶原及蛋白合成的影响。方法：应用酶联免疫吸附实验及考马斯亮蓝微板法对拉伸应变下的细胞合成代谢变化进行观察,应变范围为1－8％,结果：在0．5－8％拉伸应变范围内,人牙周膜成纤维细胞I型胶原合成无明显变化,但1－8％拉伸应变作用下细胞蛋白合成减少,其中2％拉伸应变影响最明显。结论：拉伸应变可改变人牙周膜成纤维细胞细胞外基质成分。     

乙二胺四乙酸和透明质酸对牙周膜成纤维细胞活力和细胞因子表达的影响

目的： 研究乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）和透明质酸（hyaluronic acid,HA）对牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）活力和细胞因子表达的影响。方法： 选取因正畸拔除的智牙12颗,制备成5 mm×4 mm大小根片,按照处理方式不同分为EDTA组、HA组、EDTA+HA组和未处理组。将其置于孔板中并在根片上接种PDLFs,于接种24、48 h后,采用MTT法检测各组细胞增殖活力,显微镜下观察PDLFs的黏附情况。利用ELLISA法和Western 免疫印迹法测定PDLFs产生的炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平,采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计分析。结果： 接种24、48 h后,与未处理组相比,各处理组均能促进PDLFs增殖和黏附,且联合处理促细胞增殖和黏附效果优于单一处理,差异均具有统计学意义（P<0.05）;EDTA组和HA组促细胞增殖和黏附效果随接种时间的延长而增加,但组间相比无显著差异（P>0.05）。ELLISA法和Western免疫印迹检测结果显示,各处理组较未处理组均能抑制炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达,促进IL-8表达,且EDTA+HA组的作用效果更明显,差异有统计学意义（P<0.05）。结论： EDTA+HA能显著促进牙周膜成纤维细胞生长和抑制炎性细胞因子表达,可能与其增强成纤维细胞黏附力、提高其生存能力有关。     

Novel isolation of alkaline phosphatase-positive subpopulation from periodontal ligament fibroblasts

BACKGROUND: Periodontal ligament fibroblasts (PDLFs) are the cells essential for periodontal regeneration. PDLFs comprise a heterogeneous cell population and consist of several cell subsets that differ in their function. It is known that PDLFs produce osteoblast-related extracellular matrix proteins and show higher alkaline phosphatase (ALP) activity compared with gingival fibroblasts (GFs), implying that PDLFs have osteogenic characterisitics. The aim of the present study was to isolate the osteogenic population of PDLFs according to their expression of ALP. METHODS: PDLFs and gingival fibroblasts were separated into two populations, ALP-positive and ALP-negative, with an immunomagnetic method using a monoclonal antibody against human bone type ALP and magnetic beads conjugated with a secondary antibody. Expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) receptor and transforming growth factor (TGF)-beta receptor was investigated in these two populations. Osteoblast-related molecules, osteocalcin, and bone sialoprotein; ALP activity; and effect of bFGF on proliferation were also compared. RESULTS: Effective separation was confirmed in both PDLFs and GFs by flow cytometry. The expression of FGF receptor (FGFR) and TGF-beta receptor was significantly higher in ALP-positive PDLFs than in ALP-negative PDLFs. ALP-positive PDLFs also expressed higher mRNA levels of osteocalcin and bone sialoprotein compared with ALP-negative PDLFs. The mitogenic effect of bFGF on ALP-positive PDLFs was greater than that of ALP-negative PDLFs. CONCLUSIONS: These results indicate that osteoblastic and/or cementoblastic PDLF subsets could be isolated from the PDLF populations using an immunomagnetic method. Magnetic isolation of PDLFs may be a useful tool to obtain the cells which will potentially induce mineralization on the root surface.     

小分子RNA干扰沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响

目的:探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响。方法:培养人舌癌细胞SCC-4,随机分为siRNA-Tiam1组、siRNA-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测不同转染组细胞中Tiam1基因和蛋白表达,MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,利用流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡情况,Transwell法检测不同转染组细胞迁移和侵袭能力。结果:siRNA-Tiam1组细胞中Tiam1基因和蛋白相对表达量均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);MTT实验结果显示,与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-Tiam1组细胞24 h、48 h、72 h和96 h时A值均降低(P<0.05);流式细胞检测结果显示,siRNA-Tiam1组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);siRNA-Tiam1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05)。结论:特异性沉默Tiam1基因可有效抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖能力,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力。     

The Effect of α‐Tocopherol and Selenium on Human Gingival Fibroblasts and Periodontal Ligament Fibroblasts In Vitro

Background: The aim of the present study is to evaluate the effect of α‐tocopherol and selenium on gingival fibroblasts (GFs) and periodontal ligament fibroblasts (PDLFs) in terms of proliferation, basic fibroblast growth factor (bFGF) release, collagen type I synthesis, and wound healing. Methods: Primary cultures of human GFs and PDLFs were isolated. Four test groups and a control group free of medication was formed. In group E, 60 μM α‐tocopherol was used, and in groups ES1, ES2, and ES3, the combination of 60 μM α‐tocopherol with 5 × 10^?9 M, 10 × 10^?9 M, and 50 × 10^?9 M selenium was used, respectively. Viability, proliferation, bFGF, and collagen type I synthesis from both cell types were evaluated at 24, 48, and 72 hours, and healing was compared on a new wound‐healing model at 12, 24, 36, 48, and 72 hours. Results: α‐Tocopherol alone significantly increased the healing rate of PDLFs at 12 hours and increased bFGF and collagen type I release from GFs and PDLFs at 24, 48, and 72 hours. The α‐tocopherol/selenium combination significantly enhanced the proliferation rate of both cells at 48 hours, decreased the proliferation of PDLFs at 72 hours, and increased the healing rate of GFs at 12 hours and PDLFs at 12 and 48 hours. bFGF and collagen type I synthesis was also increased in both cell types at 24, 48, and 72 hours by α‐tocopherol/selenium combination. Conclusion: α‐Tocopherol and α‐tocopherol/selenium combination is able to accelerate the proliferation rate and wound‐healing process and increase the synthesis of bFGF and collagen type I from both GFs and PDLFs.     

Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞增殖能力的影响

目的: 初步研究Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖能力的影响。方法: 采用体外贴壁式培养法培养人牙髓干细胞,应用Rho激酶抑制剂Y-27632,根据培养条件,分为普通培养液培养组(Con)及普通培养液+抑制剂Y-27632培养组(Con+Y),采用MTT法检测两种培养条件下人牙髓干细胞培养24、48、72、96 h细胞活性;采用DAPI染色法及流式细胞定量检测技术(FCM)比较两组在培养48 h的细胞数量及细胞周期分布情况。结果: MTT结果显示,实验组hDPSCs细胞增殖曲线较对照组明显上移,且增殖高峰期提前;培养48 h,DAPI染色结果显示,实验组细胞总数量明显多于对照组;FCM结果显示,对照组G₀/G₁期细胞比例为(66.8±6.84)%,S期细胞比例为(25.17±0.62)%,实验组G0/G1期细胞比例为(58.59±1.76)%,S期细胞比例为(31.34±1.16)%,实验组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)。 结论: Rho激酶抑制剂Y-27632促进人牙髓干细胞DNA合成、细胞分裂及增殖。     

兔脂肪源干细胞与牙周膜成纤维细胞共培养的实验研究

目的:研究脂肪源干细胞能否与牙周膜成纤维细胞直接共培养,在共培养状态下,脂肪源干细胞能否促进牙周膜成纤维细胞胶原特异基因的表达。方法:分别从新西兰白兔皮下脂肪和牙周膜组织中分离出脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞,体外常规培养;将两种细胞等量混合共培养,利用光镜和F-actin染色标记细胞骨架的方法观察共培养细胞的形态变化,并与单纯培养的细胞比较;利用DAPI染色标示细胞核细胞计数法检测共培养细胞的增殖情况;利用定量PCR法检测特异基因I型胶原在单纯培养和共培养细胞中的表达。结果:脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞能直接共培养;共培养细胞形态近似牙周膜成纤维细胞;共培养对细胞增殖无明显影响;脂肪源干细胞可提高牙周膜成纤维细胞I型胶原基因的表达。结论:脂肪源干细胞可与牙周膜成纤维细胞共培养,并促进牙周膜成纤维细胞的胶原分泌。     

维拉帕米对正常牙龈成纤维细胞增殖的影响

目的体外评价维拉帕米对正常牙龈成纤维细胞增殖的影响。方法分离、培养正常牙龈成纤维细胞。用0、0．1、1、10、100μmol／L5个浓度的维拉帕米分别作用于第5代正常牙龈成纤维细胞，采用甲基噻唑基四唑法检测细胞的增殖，流式细胞仪评价细胞生长周期。结果100μmol／L维拉帕米作用66h后，检测A值为0．046，与无药物作用组（A值为0．088）相比差异有统计学意义（P〈0．01）。100μmol／L维拉帕米作用18h后，69％的细胞处于G0-G1期，27％处于S期，而无药物作用组分别为41％和49％。两者间差异有统计学意义（P〈0．001）。结论100μmol／L维拉帕米在体外通过阻滞细胞生长周期抑制正常牙龈成纤维细胞的增殖。