兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

人皮肤成纤维细胞原代培养方法的改良

目的：改良人皮肤成纤维细胞培养方法。方法：采用培齐后组织块消化法(简称改良法)培养成纤维细胞，以组织块贴瓶法(简称贴瓶法)作为对照。结果：改良法成功率为100％，43d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代；贴瓶法成功率为66．7％，47d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代结论：改良法是一种可行的成纤维细胞培养方法。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

酶消化法原代培养兔结膜成纤维细胞及进行传代培养的体会

目的 用酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞并进行传代培养。方法 取兔眼结膜，加入胰蛋白酶及乙二胺四乙酸二钠直接消化后放入孵箱培养，并通过改进后的传代培养技术将原代培养成功的成纤维细胞进行传代，观察细胞的生长情况。结果 原代培养7～9d成纤维细胞在培养基中长成单层且分布均匀。传代培养后3～4d成纤维细胞铺满培养基，即可再传代。结论 酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞比常规的组织块培养法更快促使细胞长成单层，且贴壁细胞分布更均匀。运用改进后的传代培养技术可以使成纤维细胞的增殖和纯化更加方便快捷。     

兔眼角膜成纤维细胞原代培养

目的:建立眼角膜成纤维细胞体外培养的方法。方法:采用全角膜组织培养法培养兔角膜成纤维细胞。结果:在培养皿中培养1天后细胞开始贴壁,6天有新生细胞分出,形成梭形的成纤维细胞。传代细胞经4-6天可形成密集的成纤维细胞,细胞呈纤维状,呈漩涡形排列,排列整齐,局部细胞相互平行,第4、5代生长情况良好,细胞生长旺盛,细胞呈密集漩涡形排列。结论:眼角膜成纤维细胞全角膜组织培养法是可行的。     

大鼠Tenon''''s囊成纤维细胞体外培养及生长特性的研究

目的 探讨建立体外大鼠Tenon’s囊成纤维细胞的培养方法，并对体外培养的Tenon’s囊成纤维细胞的生长特性进行观察。方法 选用健康年幼的SD大鼠40只，采用断颈法将其处死，摘除眼球，无菌条件下，分离剪下Tenon’s囊组织，采用植块法对Tenon’s囊成纤维细胞进行体外培养；通过细胞形态学观察和细胞免疫组化染色技术对其细胞性质进行鉴定；通过细胞记数和MTT法对其生长特性进行研究。结果 原代培养的大鼠Tenon’s囊组织块接种后，约48h即可见细胞由组织块中爬出，培养8～10d，细胞汇合程度大约可达70％左右；培养14～16d，细胞完全汇合；在细胞汇合程度达到70％-80％时，可以进行细胞传代，传代细胞接种后4—5h大部分细胞贴壁，10-12d左右传代细胞完全汇合。光镜下观察，可见Tenon’s囊成纤维细胞，在汇合程度低时细胞呈细长梭形外观，汇合程度高时细胞可呈多边形改变。免疫组化染色可见Tenon’s囊成纤维细胞角蛋白染色阴性，波蛋白染色阳性。细胞生长曲线显示，在2—8d细胞处于对数生长期。结论 体外成功地培养了大鼠Tenon’S囊成纤维细胞，这不仅为青光眼滤过泡瘢痕化防治的基础研究提供了一种新的细胞来源，同时为抗结膜瘢痕化药物的研究和开发提供了一种新的简便实用的细胞来源途径。     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定

目的：建立一种简单易行的自新生小鼠皮肤分离培养成纤维细胞的方法,并对分离细胞进行鉴定。方法：无菌取新生Balb/c小鼠背部皮肤,剪碎呈1 mm2大小,组织块均匀放置于培养皿并以DMEM（含10%胎牛血清）培养基对组织块进行培养;以胰蛋白酶消化分离细胞-重新贴壁法对分离培养细胞进行纯化;以NIH3T3细胞为对照,免疫荧光、流式细胞术、Western blot检测波形蛋白表达情况以对培养的成纤维细胞进行鉴定。结果：新生小鼠背部皮肤组织培养3 d时可见细胞呈细长梭形或呈多角形,组织培养5 d后可见大量细胞自组织块游离生长,组织培养7 d后可见细胞呈单层漩涡状排列或纵横交错,贴壁细胞团呈放射状生长。免疫荧光、流式细胞术、Western blot检测发现分离细胞和NIH3T3细胞均表达波形蛋白;流式细胞术证实分离的成纤维细胞波形蛋白表达阳性率和平均荧光密度分别为13.33%和9.89,而NIH3T3细胞波形蛋白阳性率和平均荧光密度分别为28.11%和14.16。结论：分离培养的细胞具有成纤维细胞的形态学特征,并表达成纤维细胞的特征分子波形蛋白。以组织块直接培养法成功自新生小鼠皮肤分离培养成纤维细胞,为建立肿瘤体外模拟微环境提供实验材料和研究基础。     

兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的培养及冻存

目的 探讨体外培养兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的最佳方法,为进一步研究结膜的生物学特性和结膜重建提供基础。 方法 分别用组织块法培养结膜上皮细胞和混合消化法培养结膜基质细胞,用倒置显微镜观察其生长方式和形态特征;收集第2代细胞,-80℃冻存。结果 兔眼结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞可以在体外成功培养,结膜上皮细胞呈圆形或多角形,成纤维细胞呈长梭形;冻存细胞1个月后复苏成功率达80%。结论 组织块法和混合消化法培养可成功获得结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞。     

小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

不同浓度牛磺酸对兔角膜内皮细胞的影响

目的 探讨牛磺酸对兔眼角膜内皮细胞的毒副作用。方法 取家兔6只（共12眼）,每只眼制取6片组织片,用组织块培养法培养兔角膜内皮细胞,细胞接种于12孔培养板,分别加入2%、4%、6%、8%、10%的牛磺酸液（同一动物的左右眼加同一浓度牛磺酸溶液）,设立空白对照。倒置显微镜观察角膜内皮细胞的生长情况;在培养的第1、2、4、6、8天,将部分培养细胞用Wright染色后观察细胞形态。结果 空白对照和加入2%、4%、6%牛磺酸溶液培养的角膜内皮细胞,1周后均形成内皮细胞层,细胞形态呈六角形或类圆形。加入8%牛磺酸液培养的角膜内皮细胞,在第4天时生长不良,细胞胞体小;第8天时培养细胞死亡。加入10%牛磺酸液培养的角膜内皮细胞,在第2天时出现生长不良,细胞胞体小,部分细胞已死亡。同一动物的左右眼角膜内皮细胞生长速度和细胞形态相似。结论 2%~6%牛磺酸对兔角膜内皮细胞的生长无不良影响,提示该浓度范围的牛磺酸对角膜内皮细胞无毒副作用。     

不同浓度牛磺酸对兔角膜内皮细胞的影响

目的 探讨牛磺酸对兔眼角膜内皮细胞的毒副作用.方法 取家兔6只(共12眼),每只眼制取6片组织片,用组织块培养法培养兔角膜内皮细胞,细胞接种于12孔培养板,分别加入2%、4%、6%、8%、10%的牛磺酸液(同一动物的左右眼加同一浓度牛磺酸溶液),设立空白对照.倒置显微镜观察角膜内皮细胞的生长情况;在培养的第1、2、4、6、8天,将部分培养细胞用Wright染色后观察细胞形态.结果 空白对照和加入2%、4%、6%牛磺酸溶液培养的角膜内皮细胞,1周后均形成内皮细胞层,细胞形态呈六角形或类圆形.加入8%牛磺酸液培养的角膜内皮细胞,在第4天时生长不良,细胞胞体小;第8天时培养细胞死亡.加入10%牛磺酸液培养的角膜内皮细胞,在第2天时出现生长不良,细胞胞体小,部分细胞已死亡.同一动物的左右眼角膜内皮细胞生长速度和细胞形态相似.结论 2%～6%牛磺酸对兔角膜内皮细胞的生长无不良影响,提示该浓度范围的牛磺酸对角膜内皮细胞无毒副作用.     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

兔眼结膜上皮细胞体外培养

目的 探讨体外分离培养结膜上皮细胞的方法。方法 兔眼结膜上皮组织,用组织块培养法,分别种植于培养皿及处理过的羊膜上,培养2周,观察结膜上皮细胞的生长特性。结果 接种在培养皿的结膜上皮8天左右组织块之间可融合成膜状,细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织,生长较快,6天左右组织块之间可互相连接,融合成膜状,细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定,结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论 组织块培养法是结膜上皮细胞培养的较好方法,种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

兔角膜内皮细胞的原代培养

目的: 探讨兔角膜内皮细胞的培养方法。方法: 显微分离兔角膜后弹力层-内皮细胞层,采用贴壁法、贴壁消化法及两种消化法培养,观察每种方法细胞生长的特点。结果: 4种方法培养的兔角膜内皮细胞均呈单层密集生长,形态为六角形或多边形,具有活体细胞的形态特征。培养周期最短约为1周。结论: 将揭取的附有内皮细胞的后弹力层预培养1天后再进行消化培养的方法,可为实验研究提供有效的角膜内皮细胞培养方法。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

ET-1、rhEGF、bFGF对培养的兔角膜内皮细胞的影响

目的 研究内皮素-1(ET-1)、重组人表皮生长因子(rhEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对培养的兔角膜内皮细胞增殖能力的影响及其相互作用。方法 在体外培养的兔角膜内皮细胞中单独使用或联合应用ET-1、rhEGF、bFGF，采用MTT方法观察对细胞增殖的影响，免疫组化染色法和计算机图像分析系统检测对细胞增殖细胞核抗原(PcNA)表达的影响。结果 一定浓度ET-1促进培养的兔角膜内皮细胞的增殖，且呈剂量相关性。10pmol／L时起作用，200pmol／L时发挥最大作用。10ng／ml rhEGF、2ng／mlbFGF也促进培养的兔角膜内皮细胞的增殖。联合应用ET-1 rhEGF、ET-1 bFGF、ET-1 rhEGF bFGF，细胞吸光度(A)值明显高于单独使用相应药物时A值之和。ET-1、rhEGF、bFGF单独使用可促进培养的兔角膜内皮细胞PCNA表达，联合应用时PCNA表达平均吸光度A值明显强于单独使用相应药物时表达强度之和。结论 ET-1可作为一种生长因子，它和rhEGF、bFGF单独使用可促进培养的兔角膜内皮细胞增殖能力，联合应用时具有协同作用。     

凝血酶对食管癌细胞EC109细胞迁移的影响

目的：探讨凝血酶对食管癌细胞EC109细胞迁移的影响。方法：EC109分别接种于96孔培养板各孔,贴壁后划痕,分别加入不同浓度的凝血酶,作用时间12、24、48、72h。同时设置水蛭素组、凝血酶＋水蛭素组及无药组。拍照并测量计算细胞迁移距离。结果：凝血酶组各浓度在不同作用时间的迁移距离与水蛭素组、凝血酶＋水蛭素组和无药组比有统计学意义（P〈0.05）,水蛭素组、凝血酶＋水蛭素组与无药组比无统计学意义,凝血酶组各浓度间比无统计学意义。结论：凝血酶可增强EC109细胞迁移能力。