兔眼角膜成纤维细胞原代培养

目的:建立眼角膜成纤维细胞体外培养的方法。方法:采用全角膜组织培养法培养兔角膜成纤维细胞。结果:在培养皿中培养1天后细胞开始贴壁,6天有新生细胞分出,形成梭形的成纤维细胞。传代细胞经4-6天可形成密集的成纤维细胞,细胞呈纤维状,呈漩涡形排列,排列整齐,局部细胞相互平行,第4、5代生长情况良好,细胞生长旺盛,细胞呈密集漩涡形排列。结论:眼角膜成纤维细胞全角膜组织培养法是可行的。     

兔角膜成纤维细胞的两种培养方法

角膜组织细胞培养中有关成纤维细胞培养的报道极少，而成纤维细胞在许多角膜疾病、外伤及角膜手术的修复及愈合过程中起着重要的作用。近年来，随着准分子激光屈光性角膜切削术（ＰＲＫ）被广泛接受，关于角膜成纤维细胞在ＰＲＫ后角膜愈合过程及并发症形成过程中所起的重...     

酶消化法原代培养兔结膜成纤维细胞及进行传代培养的体会

目的 用酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞并进行传代培养。方法 取兔眼结膜，加入胰蛋白酶及乙二胺四乙酸二钠直接消化后放入孵箱培养，并通过改进后的传代培养技术将原代培养成功的成纤维细胞进行传代，观察细胞的生长情况。结果 原代培养7～9d成纤维细胞在培养基中长成单层且分布均匀。传代培养后3～4d成纤维细胞铺满培养基，即可再传代。结论 酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞比常规的组织块培养法更快促使细胞长成单层，且贴壁细胞分布更均匀。运用改进后的传代培养技术可以使成纤维细胞的增殖和纯化更加方便快捷。     

丝裂霉素C对人结膜囊成纤维细胞胶原合成的影响

目的　观察丝裂霉素 C(MMC)对培养的人结膜囊成纤维细胞胶原合成的影响 .方法　用 3H-脯氨酸掺入和原位杂交法观察 MMC对培养人结膜囊成纤维细胞胶原合成活性的作用 .结果　 0 .4g· L- 1 MMC作用 5 min,可使结膜囊成纤维细胞对 3H-脯氨酸的摄取减少 5 5 %以上 (P<0 .0 5 ) ,并降低了 型前胶原 m RNA原位杂交信号 .结论　临床青光眼滤过手术中使用的 MMC剂量与作用时间 ,可减少成纤维细胞胶原的合成 ,有利于青光眼滤过手术成功率的提高     

丝裂霉素C抑制人结膜囊成纤维细胞生长及增殖

目的　观察丝裂霉素 C( MMC)对培养人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的作用 .方法　用 MTT比色法、3H- Td R掺入法及流式细胞仪检测细胞增殖周期观察 MMC对培养的人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的影响 .结果　 0 .4 g· L- 1MMC作用 5 min后 ,可使成纤维细胞 MTT比色 A570 nm值 7d内无显著变化 ( P>0 .0 5 ) ,3H- Td R掺入实验 CPM第 1日较对照组降低了 72 .5 % ,至第 7日时仍低于对照组 86.2 % ( P<0 .0 1) .细胞增殖周期中 ,MMC组 S期细胞的百分比明显低于对照组 .结论　临床使用剂量 MMC可使结膜囊成纤维细胞增殖能力下降 ,处于增殖抑制状态 ,而不引起明显的细胞死亡 .     

皮肤成纤维细胞培养的体会

国内已有一些科研单位开展了皮肤成纤维细胞的培养技术〔１〕，因其在核型分析中稳定性好，并能够表达其来源个体的基因组中与代谢有关的绝大多数基因，利用理化方法予以检测。此外皮肤组织取材方便、安全，易为患者接受，可以动态观察，细胞株可储存备用，故有着重要的实...     

兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的培养及冻存

目的 探讨体外培养兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的最佳方法,为进一步研究结膜的生物学特性和结膜重建提供基础。 方法 分别用组织块法培养结膜上皮细胞和混合消化法培养结膜基质细胞,用倒置显微镜观察其生长方式和形态特征;收集第2代细胞,-80℃冻存。结果 兔眼结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞可以在体外成功培养,结膜上皮细胞呈圆形或多角形,成纤维细胞呈长梭形;冻存细胞1个月后复苏成功率达80%。结论 组织块法和混合消化法培养可成功获得结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞。     

环孢素A壳聚糖纳米微粒抑制兔结膜成纤维细胞增生的作用

目的研究自制的环孢素A壳聚糖纳米微粒[CS（CsA）-NP]对兔结膜成纤维细胞（RCFs）增生的抑制作用。方法取第4～6代培养的兔结膜成纤维细胞,分别加入CS（CsA）-NP、环孢素A（CsA）原药、壳聚糖纳米微粒（CS-NP）及平衡盐溶液,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测对RCFs的抑制作用。结果 CS（CsA）-NP、CsA原药、CS-NP以质量浓度和时间依赖方式抑制RCFs的增生。对RCFs的抑制作用CS（CsA）-NP组显著强于CsA原药组及CS-NP组（均P〈0.01）。结论 CS（CsA）-NP可缓慢释放药物,能有效抑制RCFs的增生,随时间延长,作用显著强于CsA原药,可作为缓释药物载体。     

成纤维细胞胶质凝胶培养研究

建立一种成纤维细胞的三维培养方法。方法将胶原，成纤维细胞、血清和培养基在正确的比例下混合，使可形成凝胶。结果：在凝胶中成纤维细胞具有良好的活力，使之形成有一定弹性和抗拉伸能力的凝胶块。结论：真皮替代物培养是研究成纤维细胞与细胞外基质间相互作用的良好模型。     

兔角膜上皮体外培养及其生物学特性的研究

应用组织培养技术对兔角膜上皮进行了研究,观察了其形态、生物学特性及超微结构,对影响上皮生长的某些因素进行了讨沦。结果表明:组织块培养及角膜基质对上皮的生长有促进作用。细胞群体平均倍增时间17.60±4.51h((?)±s),细胞平均直径24.20±3.85μm((?)±s),平均密度2174.10个/mm~2。光镜及电镜显示培养的细胞与正常活体内的细胞相似,可代替活体内的细胞用于多方面的研究。     

兔眼结膜上皮细胞体外培养

目的 探讨体外分离培养结膜上皮细胞的方法。方法 兔眼结膜上皮组织,用组织块培养法,分别种植于培养皿及处理过的羊膜上,培养2周,观察结膜上皮细胞的生长特性。结果 接种在培养皿的结膜上皮8天左右组织块之间可融合成膜状,细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织,生长较快,6天左右组织块之间可互相连接,融合成膜状,细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定,结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论 组织块培养法是结膜上皮细胞培养的较好方法,种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

人、兔结膜上皮细胞的原代培养

目的探索结膜上皮细胞体外培养的最佳方法,研究其生长特性,为毒理实验及体外结膜上皮移植提供基础。方法分别用3种培养方法：(1)组织块培养法;(2)混合肖化法;(3)组织块消化后贴壁法来培养人、兔的结膜上皮细胞,观察细胞状态、不同部位的长生特性等,并尝试在羊膜、饲细胞层上培养建系。结果3种培养方法中,组织块培养法能获得较纯的结膜上皮细胞但生长缓慢,消化法能获得大量细胞,生长较快,但常常混有其它杂细胞,组织块消化后贴壁法获得细胞量较少。观察到来自兔、睑结膜及穹隆部结膜上皮的细胞生长速度较快,细胞量多,来自球结膜的细胞生长较慢。应用间接免疫荧光染色,人结膜上皮细胞K13染色阳性。结论组织块培养法及混合消化法皆能培养结膜上皮细胞,各有利弊。     

钙拮抗剂对兔结膜成纤维细胞的抑制增殖作用

目的：研究钙拮抗剂维拉帕米（verapamil,Ver)和硝苯地平（nifendipin,Nif)单独及与5-氟脲嘧啶（5-Fu)联合使用时对兔结膜成纤维细胞的抑制增殖作用。以探讨防治增殖性玻璃体视网膜病变发生的理想药物。方法：取培养第3-5代的成纤维细胞接种于24孔培养板中,加入含不同浓度Ver和Nif的培养液,培养48h后计算细胞抑制率,并逐日在倒置显微镜下观察细胞形态变化。同样将前两个药物与5-Fu合用,观察细胞抑制效果。结果：在5、10、20、40mg/L浓度时Ver和Nif对细胞增殖均表现出抑制作用,并呈浓度依赖性,与1mg/L和10mg/L5-Fu合用时,两者的抑制作用都得到加强,两种钙拮抗剂单独使用时对细胞形态无明显影响,与5-Fu合用时,随药物浓度的提高,出现细胞的皱缩和死亡。结论：钙拮抗剂Ver和Nif对兔结膜成纤维细胞的增殖具有抑制作用,两药与抗肿瘤药物5-Fu合用时,抑制作用得到加强。     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

无血清饥饿法去除神经组织培养中的成纤维细胞

介绍去血清饥饿培养方法去除神经组织培养中的成纤维细胞。取 2日龄大鼠双侧坐骨神经和双侧嗅球 ,酶消化、离心 ,1 0 %胎牛血清 (FCS)DMEM体外培养 ,如果成纤维细胞生长迅速 ,换无血清DMEM培养液培养。根据细胞生长状况可反复上述过程。S 1 0 0免疫荧光染色鉴定雪旺细胞和嗅鞘细胞纯度。结果 :换无血清培养液后 ,成纤维细胞迅速死亡 ,S 1 0 0免疫荧光染色雪旺细胞和嗅鞘细胞的纯度可达 98%～ 99%。此方法简捷、易操作 ,为神经组织培养中去成纤维细胞的一种好方法。     

ET-1、rhEGF、bFGF对培养的兔角膜内皮细胞的影响

目的 研究内皮素-1(ET-1)、重组人表皮生长因子(rhEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对培养的兔角膜内皮细胞增殖能力的影响及其相互作用。方法 在体外培养的兔角膜内皮细胞中单独使用或联合应用ET-1、rhEGF、bFGF，采用MTT方法观察对细胞增殖的影响，免疫组化染色法和计算机图像分析系统检测对细胞增殖细胞核抗原(PcNA)表达的影响。结果 一定浓度ET-1促进培养的兔角膜内皮细胞的增殖，且呈剂量相关性。10pmol／L时起作用，200pmol／L时发挥最大作用。10ng／ml rhEGF、2ng／mlbFGF也促进培养的兔角膜内皮细胞的增殖。联合应用ET-1 rhEGF、ET-1 bFGF、ET-1 rhEGF bFGF，细胞吸光度(A)值明显高于单独使用相应药物时A值之和。ET-1、rhEGF、bFGF单独使用可促进培养的兔角膜内皮细胞PCNA表达，联合应用时PCNA表达平均吸光度A值明显强于单独使用相应药物时表达强度之和。结论 ET-1可作为一种生长因子，它和rhEGF、bFGF单独使用可促进培养的兔角膜内皮细胞增殖能力，联合应用时具有协同作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用研究

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用。方法 :实验分为两组 ,即加入浓度 2 0ng·ml-1bFGF的bFGF组及不加bFGF的对照组。采用Pepper等介绍的三维培养胶原基质配制及细胞培养方法制作标本 ,透射电子显微镜下观察结果。 结果 :对照组内皮细胞在胶的表面呈单层生长 ,未见其向深层生长及管腔结构形成。bFGF组内皮细胞在胶内呈多层浸润生长 ,伸展、变形呈扁平状 ;内皮细胞与胶原纤维之间可见半桥粒结构 ,内皮细胞之间以桥粒连接 ,形成毛细血管样管腔结构 ;在形成管状结构的内皮细胞中可见空泡样变 ,边界由胞质与胞膜组成 ,细胞核变形 ,凹陷 ,可见切迹 ,或呈薄片状 ;内皮细胞游离面有微绒毛突起。结论 :三维培养技术简单易行 ,是揭示在体血管形成的最简单模型 ;bFGF有利于三维培养内皮细胞在有展性的胶原基质面形成血管样结构。     

飞秒激光及机械刀制备兔眼角膜瓣后角膜生物力学变化的比较

 【目的】 比较飞秒激光、微型机械角膜刀制备角膜瓣愈合后对角膜生物力学的影响。【方法】 新西兰白兔10只,全麻下双眼分别用微型角膜刀及飞秒激光来制备角膜瓣。术后1 d、3 d、1周、1月、3月、6月行裂隙灯照相。术后6月全麻下处死兔,剜除双眼,将离体角膜片固定在改良的人工前房上并联合眼前节分析仪测量角膜的生物力学变化。【结果】 机械刀制备的角膜瓣厚度(107 ± 27) μm,飞秒激光角膜瓣的厚度(107 ± 18) μm,两组角膜瓣的厚度差异无统计学意义(P > 0.05)。随着前房压力的增加,中央前房深度不断增加,在压力60、75 mmHg时机械刀组前房深度分别增加(0.25 ± 0.06)mm、(0.30 ± 0.06)mm;而飞秒激光角膜瓣组增加(0.18 ± 0.03)mm、(0.22 ± 0.06)mm;两组分别比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。随着前房压力的升高,角膜前后表面的曲率逐渐增加,在前房压力达到30 mmHg以上时角膜曲率趋于稳定;角膜后表面曲率在前房压力超过30 mmHg时飞秒激光及机械刀两者间差异均有统计学意义(P < 0.05)。随着前房压力的升高,角膜厚度及角膜的体积变小,前房容积增加,但各压力梯度下飞秒激光及机械刀两者相比差异无统计学意义(P > 0.05)。【结论】 在高眼内压状态下,与微型机械角膜刀相比,飞秒激光制备的角膜瓣在角膜愈合后角膜后表面曲率及角膜前突变化更小;飞秒激光制备角膜瓣具有更好的角膜生物力学稳定性。