胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞(ESCSCs)的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况,本文从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清限定性培养基培养,并通过添加维甲酸(RA)、音猬因子(SHH)和神经营养因子-3(NT-3)等诱导因子,进行干细胞体外诱导,用免疫荧光细胞化学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明:从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,通过含EGF和bFGF的限定性培养基培养可获得干细胞球,通过添加RA、SHH和NT-3等诱导因子后,可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示,胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ESCSCs性状,在添加特殊因子的条件下,并在体外ESCSCs可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。     

骨髓基质细胞对共培养条件下的脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的诱导

目的：研究骨髓基质细胞对共培养条件下脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的情况。方法：从孕龄13 d的胚胎大鼠脊髓组织中分离神经干细胞,采用含EGF及bFGF的无血清限定性培养基培养,并通过与骨髓基质细胞进行共培养,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,用细胞免疫荧光染色鉴定分化结果。结果：从胚胎脊髓中分离得到大量的神经干细胞,通过限定性培养基培养可获得干细胞球,与骨髓基质细胞共培养可被诱导分化,用细胞免疫荧光染色鉴定,可见有胆碱能神经元生成。结论：胚胎大鼠脊髓源神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并保持稳定的性状,在与骨髓基质细胞共培养时,可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

人胚神经干细胞的分离、培养与鉴定

为了探讨人胚神经干细胞体外培养条件和分化情况，摸索出一种切实可行的获得较纯、多潜能人 胚神经干细胞的方法。我们取三月龄人胎脑，用胰蛋白酶消化法分离单个细胞，部分冻存，另一部分进行细胞培养，加EGF、bFGF刺激生长，有限稀释法将获得单细胞克隆，血清诱导分化，并用免疫组化方法进行鉴定。结果显示,EGF和bFGF同时存在的无血清培养基中有大量神经干细胞团生成，含血清培养基则诱导神经干细胞分化成为神经元、星型胶质细胞、少 突胶质细胞。这表明，神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bEGF的共同作用。经冻存后的胎脑细胞同样能分离培养出有活性的神经干细胞。     

NGF和GDNF对大鼠嗅鞘细胞体外增殖和分化的影响

本研究旨在比较神经生长因子(NGF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠嗅鞘细胞(OECs)体外增殖和分化的影响。在体外分离培养大鼠OECs的培养液中不加神经营养因子(对照组)或加入不同的神经营养因子(NGF组和GDNF组),倒置显微镜下进行观察,并通过S-100免疫荧光组织化学染色检测各组大鼠OECs体外增殖和分化情况。结果显示:NGF组和GDNF组OECs增殖和分化明显好于对照组(P<0.01),NGF组又明显好于GDNF组(P<0.01)。这些结果提示NGF能促进大鼠OECs体外增殖和分化。     

大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定和诱导分化

近年研究发现，哺乳动物无论在胚胎发育期还是在成年，其中枢神经系统内都存在具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞，这一发现为神经损伤修复的研究提供了一条新思路。分离培养神经干细胞，并在体外稳定的增殖与分化，为研究神经干细胞的增殖、分化特性、干细胞移植以及建立细胞系等，提供了细胞来源和保证。本研究利用胎鼠和乳鼠的大脑皮层和海马，用含EGFP和bFGF的NSC培养基培养、分离了具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞，并观察其生长、增殖和分化特点，以期为神经干细胞的基础研究奠定基础。     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

成年大鼠眼睫状体缘色素上皮组织的神经前体细胞的培养和鉴定

目的　探讨成年大鼠眼睫状体缘色素上皮产生神经前体细胞的潜力及其生物学特征。方法　取成年SD大鼠睫状体缘处的色素上皮组织块 ,置于含bFGF和B2 7的DMEM/F12 无血清培养液中进行神经前体细胞培养 ,免疫组化反应染色鉴定细胞的表型。结果　培养 5～ 8d ,组织块长出由众多无色素和色素细胞构成的细胞集落 ,集落的大多数细胞处于增殖状态(BrdU反应阳性 ) ,并表达神经前体细胞的标志物 (nestin)。撤掉bFGF和B2 7,加入胎牛血清培养 3～ 5d ,集落的细胞发生分化 ,分别表达神经元和星形胶质细胞的标志物 (NSE、GFAP) ,但不表达少突胶质细胞的标志物 (O4 )。结论　由成年大鼠睫状体缘色素上皮长出的细胞集落不仅含有增殖能力和多分化潜能的神经前体细胞 ,而且尚含有色素细胞 ,该部位可能是视网膜神经感觉层和色素上皮共同保守的细胞生发带     

促红细胞生成素促进体外鼠胚脑皮质神经干细胞增殖

目的检测体外培养SD大鼠胚脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的生物学特性,为NSCs研究提供适宜的细胞模型;探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对NSCs增殖的影响,为NSCs的相关研究提供实验依据。方法本研究对孕14d(E14)SD大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,以nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,微管相关蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)和神经胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acid protein,GFAP)检测NSCs分化。取第三代(P3)NSCs向悬浮培养基中添加不同剂量的EPO,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法检测NSCs的增殖情况。结果分离E14dSD大鼠胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。与对照组对比,加入≥5U/mlEPO后MTT检测NSCsOD值明显增高。结论 SD大鼠胚脑皮质体外培养可得到大量增殖的神经干细胞并能分化为神经元和神经胶质细胞,EPO可促进体外NSCs的增殖。     

胚胎小鼠纹状体神经干细胞的体外培养和分化

目的：探索胚胎小鼠纹状体神经干细胞(striatum-neural stem cells，^strNSC)的体外培养和分化鉴定方法。方法：无菌条件下分离E15天胚胎小鼠纹状体，制成单细胞悬液，在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增，通过免疫细胞化学显色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果：培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖，同时表达神经干细胞特异性抗原nestin，并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和神经胶质细胞分化。结论：胚胎小鼠纹状体存在具有多分化潜能的神经干细胞，它们能在体外培养、传代和自然分化．     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

NGF和GDNF基因重组逆转录病毒体外感染神经干细胞及其鉴定

目的 探讨神经干细胞（NSC）直接作为基因靶细胞能否被重组逆转录病毒感染以及感染后目的基因的表达。方法 分别用NGF和GDNF基因重组逆转录病毒上清液感染NSC2d;G418筛选后加入bFGF扩增培养;取感染后的NSC培养液（NGF／GDNF条件培养液）培养PC12细胞和中脑腹侧神经元;用免疫组织化学染色方法检测中脑腹侧多巴胺神经元的形态改变以及感染后NSC对目的基因的表达。结果 经G418筛选后,约50％感染NGF和GDNF基因重组逆转录病毒的NSC呈G418抗性;这些感染后的NSC开始分化,分裂球向四周长出放射状突起,部分细胞沿突起向外迁移生长;感染NGF基因的NSC呈星形,胞体较大,突起较粗,感染GDNF基因的NSC呈梭形,胞体较小,突起较长。经NGF条件培养液培养的PC12细胞,数量增多,突起明显变长。经GDNF条件培养液培养的中脑多巴胺神经元（TH阳性细胞）其胞体亦增大,突起伸长。大部分G418抗性的NSC出现NGF和GDNF免疫染色。结论 神经干细胞可直接作为基因靶细胞,能被NGF和GDNF基因重组逆转录病毒有效感染而表达和分泌有生物学活性的NGF和GDNF。     

EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

本研究旨在探索可促进成年大鼠神经干细胞增殖并形成较多的克隆球以及其分化出较多神经元的因素。取成鼠前脑室下区的组织进行原代培养 ,将之分为三组分别加入 EGF、b FGF以及 EGF+ b FGF,观察克隆球的形成状况。一周后收集三组原代细胞克隆球 ,加入完全培养液 (仅含 10 %胎牛血清 )进行分化实验。分化 14 d后 ,分别用 MAP-2和 GFAP的单克隆抗体进行免疫荧光标记 ,计算阳性细胞数量。无血清培养结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组原代培养液中形成的原代克隆球数量和直径的差别不明显 ,但都明显地大于 EGF组。免疫荧光结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组中的克隆球分化出 MAP-2阳性神经元的数量明显多于 EGF组 ,而 EGF组则能产生较多的胶质细胞。提示 ,b F GF能促进成年大鼠神经干细胞增殖 ,所形成的细胞克隆球能分化为较多的神经元。     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。 目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O₂)或低氧(体积分数3%O₂)环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1 µg/L胶质源性神经营养因子。 结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。