毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

目的开发新的组织工程表皮替代物,利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片(Chitosan-gelatin membrane,CGM)进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM,构建组织工程表皮膜片,裸鼠背部作直径1cm的全层皮肤缺损,将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞-CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖,表皮分化良好,而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。     

组织工程技术修复全层皮肤缺损的研究

目的　探讨用异体脱细胞真皮基质 (ADM )复合自体表皮角朊细胞 (AKCs)移植修复全层皮肤缺损的可行性。方法　用DispaseII/TritonX 10 0制备ADM。在猪背部两侧分别作 5cm× 5cm的全层皮肤缺损 ,用ADM覆盖创面。 7～ 10d后 ,将AKCs与Pluronic混匀涂布于一侧ADM表面 ,另一侧单纯ADM组作为对照组。术后观察愈合情况 ,比较创面收缩率 ,取材作组织学及电镜观察。结果　ADM去除了所有细胞成分 ,胶原束结构及排列均保持正常 ;ADM在创面成活 ,能诱导成纤维细胞长入和新生血管形成 ,并支持移植于其表面的AKCs生长。 4周时 ,对照组收缩至原面积的 41% ,实验组为原面积的 65 %。结论　ADM可以作为重建真皮层的诱导支架 ;ADM与AKCs复合移植可以形成新生皮肤并修复全层皮肤缺损。     

自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面中的作用研究

目的:探讨自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面的作用。方法:在20只大鼠身上分别取邮票大小自体全厚皮片进行消化,分离成单个表皮细胞的悬液;经传代培养后,使用自体表皮细胞悬液分别对20只大鼠背部表皮皮肤缺损创面进行覆盖移植,术后观察移植物成活率和植皮区收缩率,同时取移植物进行组织学观察;并与对照组20只自体愈合创面进行相互比较。结果:表皮细胞悬液移植后1周渐融合成片,伤口愈合;经6周后,伤口平整,轻度瘢痕愈合。而对照组在6周时伤口不平整,呈瘢痕愈合,色素沉着明显。结论:在表皮缺损创面上应用体外培养的自体表皮细胞悬液移植修复可达到重构皮肤的目的。     

复合型组织工程皮肤的体外快速构建

目的寻找一种体外快速构建复合型组织工程皮肤的方法,为大面积烧伤、创伤创面的覆盖提供足够的自体皮源。方法取人的包皮,进行表皮细胞及成纤维细胞的分离鉴定及体外培养扩增,对表皮细胞群行广谱角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、角蛋白19（cytokeratin19,K19）-FITC免疫荧光染色及K19流式细胞仪鉴定;对成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光鉴定。将表皮细胞接种于异体脱细胞真皮（acellular dermalmatrix,ADM）乳头面,于气-液平面培养构建表皮层,实验分两组进行,实验组培养基中添加25ng/ml角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）,对照组不添加。6d后,接种成纤维细胞于两组ADM的另一面,继续培养24h。收集构建的组织工程皮肤,切片行苏木素-伊红染色,观察所构建皮肤的镜下结构,并对比添加KGF对其影响。结果免疫荧光染色培养扩增的表皮细胞群广谱角蛋白抗体-FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性,流式细胞仪鉴定其中K19阳性表达的细胞接近17%。成纤维细胞体外培养7d可扩增超过100倍,波形蛋白-FITC免疫荧光染色呈阳性。经过7d的体外培养构建,可以得到复合型皮肤,经苏木素-伊红染色镜下观察显示,实验组表皮层连续,形成细胞层数2-3层的复层结构,真皮中含有成纤维细胞;对照组表皮层不连续,细胞层数少,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法进行种子细胞的分离,应用添加KGF的条件培养基,采用分步接种构建的方法,可在7d内构建出复合型组织工程皮肤。     

体外培养表皮干细胞构建组织工程皮肤的研究

目的探讨应用表皮干细胞构建组织工程皮肤修复皮肤缺损的可行性。方法运用黏附实验将人表皮干细胞分选出来后大量培养，将成纤维细胞和表皮干细胞转移到真皮底物上构建组织工程皮肤，并将之移植于裸鼠皮肤缺损模型，于术后第1、2、4周处死动物，收集标本，进行组织学、透射电镜及免疫组织化学检查。结果组织工程皮肤移植后4周具备完整的表皮层和真皮层，表皮层中具备基底层、棘层、颗粒层和角质层。表皮细胞间还可以看到有桥粒、半桥粒、角质透明颗粒和粗张力微丝柬。表、真皮层间有连续的、完整的基底膜。真皮网架破坏明显，大量的成纤维细胞增殖活跃，胶原纤维排列整齐，有丰富的毛细血管。结论本研究所构建的组织工程皮肤组织学形态和超微结构上已接近于正常的皮肤，从而为临床修复皮肤缺损的研究打下了坚实的理论和实践基础。     

毛乳头细胞促进组织工程皮肤血管化的实验研究

目的探讨毛乳头细胞对表皮干细胞与同种异体脱细胞真皮基质构建的组织工程皮肤血管化的影响。方法取门诊包皮环切术患者皮肤,用于表皮细胞培养;取孕19、20周引产胎儿头部皮肤,用于毛乳头细胞培养;患者及家属均知情同意。以中性蛋白酶联合胰蛋白酶消化、分离表皮细胞,IV型胶原黏附法分选表皮于细胞;以Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头,常规成纤维细胞培养液培养。以同种异体脱细胞真皮基质为支架,在真皮基质的真皮乳头侧种植毛乳头细胞,基底膜侧种植表皮干细胞构建实验组组织工程皮肤替代物;对照组组织工程皮肤替代物不种植毛乳头细胞。取6～8周龄BALB/C-nu裸鼠60只,随机分成实验组和对照组（n=30）;实验动物背部制造1 cm×1 cm大小全层皮肤缺损模型,将两组组织工程皮肤替代物移植修复创面,2周后观察移植皮肤成活率。术后2、4周,取移植皮肤替代物标本,行HE及免疫组织化学染色,观察移植皮肤替代物CD31表达水平,并计算两组标本血管密度。结果Ⅳ型胶原分选后表皮细胞同时表达角蛋白19、β₁整合素,提示为表皮干细胞。由毛乳头培养出的细胞表达α平滑肌肌动蛋白,提示为毛乳头细胞。动物移植术后2周,实验组移植皮肤成活率为93.3%（28/30）,对照组为80.0%（24/30）,比较差异有统计学意义（χ²=2.31,P=-0.00）。HE染色观察示实验组表皮层达12层,表皮细胞体积较大;对照组表皮层达4～6层,表皮细胞体积较小。实验组术后2、4周,血管密度分别为（38.56±2.49）个/mm2和（49.12±2.39）个/mm²,对照组分别为（25.16±3.73）个/mm²和（36.26±3.24）个/mm²,两组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论毛乳头细胞可促进移植皮肤替代物血管形成,利于表皮层重建,提高组织工程皮肤移植成活率。     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

构建含血管结构的组织工程皮肤的研究

目的　探讨应用组织工程方法构建含有血管结构的组织工程皮肤。　方法　以新生儿脐带静脉和包皮作为细胞来源 ,用消化法获得血管内皮细胞、皮肤角朊细胞和成纤维细胞 ,用设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。实验组 :真皮层含有 1∶ 1的成纤维细胞和血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮 ;对照组 :真皮层只含有成纤维细胞 ,不含血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮。 HE染色和免疫组织化学染色检测第 因子抗体 ,观察两种组织工程皮肤真皮层中血管结构的形成情况。用所构建的两种组织工程皮肤修复裸鼠的全层皮肤缺损。　结果　所构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,实验组真皮层内含有血管样结构 ,对照组未见到血管样结构。修复裸鼠全层皮肤缺损 ,肉眼观察皮肤缺损愈合 ,染色显示移植部位有大量血管长入。　结论　构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,真皮层中形成了微血管样结构。采用所构建的组织工程皮肤成功修复了裸鼠的皮肤缺损     

真皮源干细胞复合人血浆促进皮肤创面神经修复的实验研究

目的观察真皮源干细胞复合人血浆移植对皮肤创面神经修复的影响。方法培养人真皮源干细胞（DMSC），观察其体外分化情况；以人血浆为载体构建DMSC移植物；60只裸鼠背部制作皮肤缺损创面，随机分为干细胞移植组（A组）、单纯血浆支架组（B组）和空白组（C组）；创面愈合后第1、2、4、8周取材，免疫荧光检测表皮下及真皮层PGP9、5的表达．以此反映皮肤神经再生情况。结果DMSC体外向神经元样、胶质样、许旺细胞样分化。A组创面愈合后第1、2周表皮下及真皮层PGP9．5荧光密度高于B组、C组（P〈0．01）；B组第2周真皮层和第4周表皮下PGP9．5荧光密度高于C组（P〈0.05）。结论真皮源干细胞复合血浆移植有利于皮肤创面的神经修复。     

同基因细胞源组织工程皮肤修复皮肤缺损的实验研究

目的利用近交系大鼠实验模型评价同基因细胞源组织工程皮肤修复大鼠全层皮肤缺损的效果,为其临床应用奠定基础。方法取近交系F344大鼠乳鼠皮肤,采用Dispase-胰蛋白酶两步消化法分离培养表皮细胞;取SD大鼠皮肤,按照高渗盐-SDS-胰蛋白酶化学处理法制备脱细胞真皮基质;依次利用浸没式培养和气液分离培养法将第2代表皮细胞与脱细胞真皮基质复合体外培养构建组织工程皮肤。取4～5周龄近交系F344大鼠36只,于大鼠背部两侧对称制备全层皮肤缺损,缺损面积为预实验确定的1.5 cm×1.5 cm。将72个创面随机分为3组(n=24),两侧移植不同修复材料:实验组移植组织工程皮肤、阴性对照组移植同种异体脱细胞真皮基质、阳性对照组移植自体全层皮肤(非原位移植)。术后行大体观察、皮片成活率、创面收缩率测量及组织学观察,评价修复效果。结果实验组术后4周创面可达到Ⅰ期愈合,与周围组织紧密连接,外观接近周围正常皮肤。术后4周,阴性对照组皮片成活率为0;实验组为62.5%(15/24),与阳性对照组91.7%(22/24)比较差异有统计学意义(χ2=5.779,P=0.016)。术后4周,实验组和阳性对照组创面收缩率显著低于阴性对照组(P<0.05),实验组与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。组织学观察示实验组术后1周有轻微炎性反应;术后2周真皮层小血管和成纤维细胞大量增生,表皮层逐渐分化成熟;术后4周时伴随新生胶原纤维沉积,移植物真皮层出现胶原改建。结论同基因细胞源组织工程皮肤能够有效修复大鼠全层皮肤缺损,在防止创面收缩和促进创面愈合等方面均可达到类似于自体全层皮肤移植的效果。     

毛乳头细胞和表皮细胞构建带附属器的组织工程皮肤

目的根据毛囊形成原理,以人毛乳头细胞和表皮细胞为种子细胞,构建带附属器的组织工程皮肤替代物。方法分实验组和对照组,实验组皮肤替代物真皮层接种人毛乳头细胞和表皮细胞;对照组真皮层不接种任何细胞。在裸鼠背部作一圆形全层皮肤缺损,将两组皮肤替代物气-液界面培养5 d后移植到裸鼠背部。观察创面愈合情况,并在移植后第4、6、8周取材,进行组织学观察。结果皮肤替代物移植后2周,实验组创面已完全愈合,移植后4周对照组创面才完全愈合,并且对照组创面收缩比实验组明显。移植后6周,实验组真皮层内见到毛囊样结构和皮脂腺结构,对照组未见毛囊样结构和皮脂腺样结构。结论将人的毛乳头细胞和表皮细胞共同种植在皮肤替代物的真皮层,可以构建出带附属器的组织工程皮肤替代物,这种替代物对创面的修复能力更强。     

Construction of bilayered tissue-engineered skin with human amniotic mesenchymal cells and human amniotic epithelial cells

Human amniotic mesenchymal cells (hAMCs) and human amniotic epithelial cells (hAECs) have attracted increasing attention in recent years as a possible reserve of stem cells that may be useful for clinical application in regenerative medicine. The object of this study was to establish a new model for reconstruction of bilayered tissue-engineered (TE) skin with hAMCs and hAECs (amniotic cells TE skin, AC-TE skin). We studied these two types of cells and confirmed that they possessed the properties of stem cells. Mesenchymal-epidermal interactions are responsible for organogenesis. On the basis of this mechanism, we modified the constructing methods of traditional TE skin (TE skin with human fibroblasts and keratinocytes) and then established a new bilayered TE skin-AC-TE skin. Histological and immunochemical methods were carried out to assess AC-TE skin. The results showed that AC-TE skin was similar in morphology to human skin which had stratified epidermis and underlying dermis. AC-TE skin expressed proliferative cells marker Ki67 and epithelial stem cells marker K19; moreover, the constructed AC-TE skin could successfully repair full thickness skin defects on athymic mice. Our findings suggest that AC-TE skin is a useful skin equivalent which has good application prospects in regenerative medicine.     

应用胚胎皮肤细胞修复小鼠皮肤缺损的实验研究

目的：探索胚胎皮肤细胞修复小鼠背部皮肤缺损的疗效。方法建立小鼠皮肤损伤模型,将小鼠胚胎皮肤的细胞植入小鼠皮肤损伤处（Nor-T组,n=6）,与不作处理的小鼠（Nor组,n=6）进行皮肤损伤愈合的比较。分别在术后第1、2、3周采集标本,比较Nor-T组与Nor组创面愈合的情况,以免疫组织化学方法检测各组愈合过程中,TGF-β1和TGF-β3因子的表达情况。结果术后第1周,Nor-T组在创伤处形成再生皮肤覆盖创面;Nor组创面由痂皮覆盖;术后第2周,Nor-T组再生皮肤完全形成;Nor组瘢痕愈合。术后第3周,Nor-T组再生皮肤上生长出黑色毛发;而Nor组没有毛发生长。Nor-T组中,TGF-β1在术后第1周表达阳性,TGF-β3在术后第2周表达阳性。结论胚胎皮肤细胞具有形成再生皮肤和修复皮肤缺损的能力。     

The fetal dermal but not loose fascial mesenchymal cells possess regenerative activity of dermal structure

Fetal skin possesses a regenerative activity until certain developmental stages. However, the origin of cells that regenerate dermis after wounding has not been clarified yet. In the present study we located the origin of cells that reconstruct fetal dermal structure by histological examination and by marking cells in the loose fascia. Next we evaluated the regenerative activity of fetal dermal mesenchymal cells by cotransplanting with fetal epidermal cells onto the skin defect of scid mice. We conclude that fetal dermal mesenchymal cells but not loose fascial cells possess regenerative activity even on the environment in scid mice.     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。