基于细胞色素氧化酶CYP2D6的何首乌肝细胞毒性及相关成分研究

目的探究何首乌及其主要成分对人肝细胞L02中细胞色素氧化酶CYP2D6 mRNA表达的影响以及抑制CYP2D6活性或表达对何首乌肝细胞毒性的影响及相关成分辨识。方法利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)确定何首乌水提物(Polygoni Multiflori Radix,PMR)及其主要成分对L02细胞CYP2D6 mRNA表达的影响;使用CYP2D6抑制剂奎尼丁初步探究PMR对CYP2D6低活性L02细胞系的细胞毒作用;构建CYP2D6沉默的L02细胞系L02-shCYP2D6,进一步研究L02细胞中CYP2D6表达降低对PMR及其主要成分肝细胞毒性的影响;可能的肝细胞毒性成分与人肝微粒体进行体外孵育,通过考察加入不同CYP450酶特异性抑制剂对其代谢消除率的影响,探究影响其代谢的主要CYP450酶。结果在实验浓度下,PMR和芦荟大黄素(AE)对CYP2D6 mRNA表达有显著抑制作用(P<0.01),大黄素(EM)无明显影响,2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)仅在高浓度有一定激活作用,其余浓度无影响;PMR联合奎尼丁作用于L02细胞,发现PMR在高浓度下对L02细胞有一定毒性(P<0.01),各浓度抑制剂与之联用后均明显加重了其肝细胞毒性(P<0.01);PMR及其主要成分作用于CYP2D6敲低的L02细胞系,除TSG在高浓度下提升了肝细胞毒性外(P<0.01),PMR、EM、AE在实验浓度范围内肝细胞毒性均显著增加(P<0.01);人肝微粒体体外孵育实验显示,CYP2D6为EM、AE重要的代谢酶。结论PMR能够抑制肝细胞中CYP2D6的表达,而CYP2D6的低活性或低表达能够加重PMR肝细胞毒性,其中主要的毒性成分为EM和AE。     

抑制CYP2E1增强何首乌水提物肝毒性作用及其毒性成分筛选研究

目的研究肝细胞色素氧化酶P450(CYP450)亚型CYP2E1与何首乌肝毒性的关系并筛选有关毒性成分。方法MTT法检测CYP2E1特异性抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)作用后何首乌水提物(PMR)对人肝细胞L02的毒性作用,及PMR和6种成分2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4-tetrahydroxy stilbene glycoside,TSG)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucoside,EG)、大黄素(emodin,EM)、没食子酸(gallic acid,GA)、大黄素甲醚(physcione,PH)和大黄酸(rhein,RH)对稳定转染shCYP2E1的HepaRG细胞的毒性作用;利用CYP2E1特异性抑制剂4-甲基吡唑(4-methylpyrazole,4-MP)作用大鼠,进一步验证何首乌对大鼠的肝毒性作用与CYP2E1抑制的关系。结果DDTC处理L02细胞24 h后,CYP2E1活性显著下降(P<0.05),PMR联用DDTC后细胞活力明显下降(与PMR、DDTC组相比,P<0.01);成功构建了HepaRG-shCYP2E1细胞系,与空质粒对照组相比,其CYP2E1 mRNA表达下降70%以上;与对照组相比,何首乌提取物PMR、EM、PH及RH对HepaRG-shCYP2E1的细胞毒作用显著增加(P<0.01),而TSG和EG在一定浓度下细胞毒作用降低(P<0.01);大鼠实验表明,何首乌与CYP2E1抑制剂联合作用于大鼠后,与空白组、抑制剂组相比,ALT及AST的水平均明显升高,与何首乌组相比,AST水平显著升高,说明大鼠体内CYP2E1被抑制后,何首乌的肝毒性作用增强。结论CYP2E1活性或表达下降可导致何首乌水提物肝细胞毒性及大鼠肝毒性增加,其毒性成分可能为游离蒽醌类成分EM,PH及RH。     

CYP1A2低表达增强何首乌水提物及其相关单体成分肝细胞毒性的研究

目的建立CYP1A2低表达人正常肝细胞株,探究何首乌水提物(PMR)及其相关单体成分的肝细胞毒性与CYP1A2低表达的关系。方法运用RNA干扰技术构建稳定转染shCYP1A2的2种人正常肝细胞系L02、HepaRG,RT-qPCR验证干扰效果;PMR及其相关单体成分:二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucopyranoside,EG)、没食子酸(gallic acid,GA)、大黄素(emodin,EM)、大黄素甲醚(physcion,PH)、芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)、大黄酸(rhein,RH)作用CYP1A2敲低的L02及HepaRG细胞48 h,MTT检测细胞活力。结果成功构建了稳定转染shCYP1A2的2种人正常肝细胞系,L02-shCYP1A2、HepaRG-shCYP1A2与相应空质粒对照组相比,CYP1A2 mRNA表达分别下降了59.81%(L02-shCYP1A2)和66.60%(HepaRG-shCYP1A2)。1.5~3 mg/mL PMR作用CYP1A2敲低的L02-shCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.01);2.5~3 mg/mL PMR作用CYP1A2敲低的HepaRG-shCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.05、P<0.01);40~120μmol/L GA作用CYP1A2敲低的L02-shCYP1A2及HepaRGshCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.01、P<0.01);AE作用CYP1A2敲低的HepaRG-shCYP1A2细胞48 h,细胞毒性显著增加(P<0.01)。结论CYP1A2低表达显著增加PMR的肝细胞毒性,推测GA和AE可能为相关的增毒成分。     

何首乌提取物对正常与荷肝癌小鼠的急性肝毒性研究

目的:研究何首乌提取物对正常与荷肝癌小鼠的急性肝毒性。方法:50只ICR正常小鼠随机均分为正常对照(等容0.5%CMC-Na溶液)组、何首乌总提物(1 500 mg/kg)组、何首乌乙醇提取物大孔树脂吸附后50%乙醇洗脱部位(简称R50部位,500 mg/kg)组、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d葡糖苷(TSG,185 mg/kg)组、大黄素-8-O-β-d-葡糖苷(EG,2 mg/kg)组,灌胃给药,每天1次,连续10 d。40只荷肝癌小鼠随机均分为模型(等容0.5%CMC-Na溶液)组与R50部位高、中、低剂量(1 000、500、250 mg/kg)组,另设正常对照(等容0.5%CMC-Na溶液)组,灌胃给药,每天1次,连续10 d。观察小鼠一般状况,测定小鼠血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,称定小鼠肝质量、体质量,计算肝脏系数。结果:与正常对照组比较,何首乌总提物组、R50部位组、TSG组、EG组小鼠一般情况、ALT和AST活性、肝脏系数无明显改变(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组小鼠AST和ALT活性增强、肝脏系数升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,R50部位高、中剂量组小鼠ALT增强,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),R50部位中剂量组小鼠肝脏系数升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:何首乌水提物、R50部位及其主要成分对正常小鼠无明显急性肝毒性,但同样剂量的R50部位可能加剧荷肝癌小鼠的肝功能异常,在一定范围内呈剂量正相关。     

何首乌苷对对乙酰氨基酚致豚鼠听力损伤的保护作用

目的 探究何首乌苷(2,3,5,4’-tetrahydroxy stilbene-2-Ο-β-D-glucoside,TSG)对对乙酰氨基酚(4-acetaminophen,APAP)致豚鼠听力损伤的保护作用。方法 采用APAP诱导豚鼠耳损伤,TSG处理后,测试豚鼠的听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)、畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustie emissions,DPOAE)等,判断听力损失情况,免疫荧光观察耳蜗毛细胞损伤情况,对豚鼠肝肾组织进行病理学观察,判断TSG对肝肾的毒性;以APAP致HEI-OC1听神经细胞损伤为耳损伤细胞研究,通过MTT法、细胞形态学观察、流式细胞仪检测细胞存活及凋亡情况,荧光定量PCR检测Birc5基因的表达。结果 与模型组相比,第14天时,豚鼠ABR听力阈值显著降低,DPOAE测试频率为2 kHz时差异更加显著(P<0.01),听觉惊跳反射显示在100 dB时惊跳反射幅值显著降低(P<0.05),间隙前脉冲抑制试验表明在10,40,50 ms时惊跳反射幅值降低;剥离豚鼠耳蜗,免疫荧光染色后观察毛细胞完整性,与模型组比较,TSG组外毛细胞排列整齐,细胞无缺失,内毛细胞排列基本整齐;病理学观察发现TSG具有一定的肝毒性而肾毒性不明显。细胞实验发现,APAP对HEI-OC1听神经细胞的半数抑制浓度为800 µmol·L^-1,10 µmol·L^-1TSG干预APAP诱导的细胞损伤时,凋亡率下降至16.0%,显著低于模型组(APAP)组的25.5%。APAP组HEI-OC1细胞Birc5表达水平明显下降,TSG处理可明显升高Birc5表达水平。结论 TSG 15 mg·kg^-1处理14 d可以对100 mg·kg^-1APAP诱导的豚鼠听力损失产生保护作用,该保护作用与TSG抑制APAP导致的听神经细胞凋亡及促进凋亡抑制因子Birc5的表达有关。     

荧光分光光度法测定何首乌及人参首乌胶囊中总蒽醌的含量

目的:建立测定何首乌及人参首乌胶囊中总蒽醌含量的方法。方法:荧光分光光度法。以最佳 pH 条件的无水乙醇为溶剂,在λ_(EX)=440nm、λ_(EM)=515nm 处测定总蒽醌含量。结果:在0.03～0.15μg·mL~(-1)范围内,大黄素浓度和荧光强度有良好的线性关系,回归方程为 F=194.36C 2.9642,r=0.9996。平均回收率何首乌为98.1%,RSD 为1.9%;人参首乌胶囊为98.6%,RSD 为2.0%。测得总蒽醌含量何首乌中为0.522 mg·g~(-1),人参首乌胶囊中为0.443mg·g~(-1)。结论:本法简便快捷,准确灵敏,重复性好,可用于何首乌及人参首乌胶囊的质量控制。     

何首乌不同炮制品对肝细胞脂代谢的干预作用研究

目的 利用脂肪变性肝L-02细胞模型,比较何首乌的生品及不同炮制品(传统方法炮制品、发酵炮制品)对脂代谢的干预作用.方法 将肝细胞传板至6孔板,分为正常组、模型组、给药组细胞.模型组与给药组采用含医用脂肪乳的培养液诱导48 h,建立肝细胞脂肪变性模型,给药组给予何首乌生品及不同炮制品的各浓度水提取物、50％乙醇提取物刺激液进行培养,采用洛伐他汀、非诺贝特为阳性对照.24 h后测定肝细胞内三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)的量.结果 与模型组相比,何首乌米根霉发酵品水提取物及50％乙醇提取物、生何首乌水提取物、黑豆制何首乌50％乙醇提取物和清蒸何首乌50％乙醇提取物在该模型上具有较好的降脂作用.其中何首乌发酵炮制品的降脂活性尤其明显,何首乌米根霉发酵品能极显著地降低TG的量(P＜0.01)至模型组含量的25％;何首乌米根霉发酵品水提取物和黑曲霉发酵品的50％乙醇提取物均可降低TC的量(P＜0.01)至模型组含量的35％.结论 生何首乌及何首乌传统炮制品、发酵炮制品均有显著地降脂作用,其中由米根霉发酵得到的发酵品表现出的较好的降脂活性,表明发酵法可能成为何首乌炮制法研究的新方向.     

何首乌总苷调血脂、抗氧化的实验研究

目的:研究何首乌总苷(polygonum multiflorum total glycoside,PMTG)对载脂蛋白E基因缺陷(apoE-/-)小鼠实验性动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)病变血脂及抗氧化能力的影响.方法:将apoE-/-小鼠随机分为4组:何首乌总苷高剂量组(150mg/kg/d)、低剂量组(25mg/kg/d)、阿托伐他汀阳性药物组(5mg/kg/d)及空白对照组,给药第10周后全部处死,酶法检测四组血清脂质含量,化学法测氧化指标一氧化氮(NO)、总抗氧化能力(TAC)及丙二醛(MDA).结果:实验10周后,何首乌总苷高、低剂量组及阳性药物组与空白对照组比较,显示(1)何首乌总苷可以显著降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,升高高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平(P＜0.01);(2)明显增加血浆NO及TAC(P＜0.05及P＜0.01),减少MDA的生成(P＜0.01).结论:何首乌总苷可以调节apoE-/-小鼠血脂代谢、增强其抗氧化能力,起到防止apoE-/-小鼠实验性动脉粥样硬化病变形成的作用.     

何首乌大孔吸附树脂富集工艺提取物治疗高脂血症30例

目的观察何首乌大孔吸附树脂富集工艺提取物对高脂血症的，临床疗效。方法将60例高脂血症患者按1：1的比例随机分为两组，治疗组30例口服何首乌大孔吸附树脂富集工艺提取物（主要成分为二苯乙烯苷类成分）70mg／次，每日2次；对照组30例口服血脂康600mg／次，每日2次。两组疗程均为8周。结果两组治疗后血清总胆固醇水平下降不低于20％，甘油三酯水平下降不低于40％。结论何首乌大孔吸附树脂富集工艺提取物降低胆固醇、甘油三酯水平的作用明显，且疗效与血脂康类似。     

何首乌有效成分二苯乙烯苷对D-半乳糖致脑老化小鼠脑组织神经营养因子表达的影响

目的：观察何首乌有效成分二苯乙烯苷(2，3，5，4’-四羟基-二苯乙烯-13-D-葡萄糖苷TSG)对D-半乳糖致脑老化小鼠海马组织神经营养因子的影响，方法：I)实验分组：将三月龄Balb/c雌性小鼠随机分为正常对照组、模型组(p-半乳糖注射组)、D-半乳糖 TSG大剂量组(0．3g／kg／d)、中剂量组(0．1g／kg／d)、     

Chronic toxicity of both raw and processed Polygoni Multiflori Radix on rats

Recently, adverse effects of Polygoni Multiflori Radix (PMR) and Polygoni Multiflori Radix Praeparata(PMRP)have attracted intensive attention worldwide. These adverse effects most occurred in caseswith high dose of prolonged medication course.Liver is usually the target organ of these adverse effects. In the present research,we performedin vivo chronic toxicity study and aimed to evaluate relationships between major constituents of water extractions and total anthraquinone of PMR and PMRP and chronic toxicity.SD rats of both sexes were given water extractions as well as total anthraquinone of PMR and PMRP for 12 weeks.We evaluated basic biochemical indexes, conducted microscopic observations of main organs and assessed early indicators of liver and renal fibrosis. Simvastatin, with hypertriglyceridemia and hypercholesterolemia as its main therapeutic areas, was investigated in our study. Component-toxicity relationships were also discussed.Five male rats died in our study, while all female rats survived, suggesting that some gender differences might be involved. Body weightwas significantly changed, and basic biochemical indexes were sporadically occurred during the research. Pathological examinations on liver and kidney showed slight alternations after 12 weeks without dose-dependent relationship. Increase in serum laminin (LN) was observed in almost all male rats, indicating that the risks of liver or kidney fibrosis still existed, especially for males, although no fibrosis was found in the pathological examination of liver and kidney.No major and severe adverse effects were observed after 12 weeks of administration of PMR and PMRP. Regular safety monitoring is still necessary during medication in order to prevent possible risks.     

不同何首乌特征图谱的初步研究及发酵何首乌主要成分的初步鉴定

目的：通过对何首乌、制何首乌及发酵何首乌特征图谱的初步研究,比较何首乌、制何首乌及发酵何首乌化学成分的差异,并运用HPLC-TOF/MS技术对发酵何首乌中的主要化学成分进行初步鉴定,为阐明发酵何首乌的药理作用打下良好的基础。方法：采用HPLC梯度洗脱的方法测定了不同何首乌的特征图谱,计算它们的相似度并对发酵何首乌中主要色谱峰进行了初步鉴定。结果：4批何首乌,3批制何首乌及同一来源的何首乌、制何首乌、发酵何首乌特征图谱与其对照特征图谱的相似度均大于0.99。初步鉴定了发酵何首乌中的8个化合物。结论：4批何首乌、3批制何首乌之间亲缘关系可能较近。发酵何首乌与同一来源的何首乌、制何首乌之间相关性较好,化学成分总体相似,未发现新成分。     

2019—2020年上海中医药大学附属龙华医院首乌藤、何首乌和制何首乌临床应用分析

目的:了解上海中医药大学附属龙华医院(以下简称"我院")门诊及住院病房首乌藤、何首乌和制何首乌的使用情况,促进合理用药,提高用药安全性。方法:利用我院HIS系统,抽取2019—2020年门诊、住院患者处方,共207398张。运用我院自行研发的处方分析系统PA软件(软件登记号:2017SR012498),对首乌藤、何首乌和制何首乌的使用人群、适应证、使用科室、用法用量以及不良反应发生率等进行专项点评,并对点评结果进行统计分析,判断用药的合理性。结果:首乌藤使用最多,其次为制何首乌,何首乌使用最少;在门诊,首乌藤的处方数为163327张,约为制何首乌处方数(36278张)的4.5倍,约为何首乌处方数(121张)的1349倍;在住院病房,首乌藤的处方数为6251张,约为制何首乌处方数(1421张)的4.4倍。首乌藤和制何首乌多用于肿瘤科,与两者的功效相符合;何首乌多用于专家门诊和风湿科,反应出临床使用何首乌比较谨慎,与其功效也相符合。首乌藤、何首乌和制何首乌均存在不同程度的超剂量使用现象。门诊和住院病房的用药情况基本一致。首乌藤、何首乌和制何首乌致肝损伤发生率均<1%,属于偶见不良反应。结论:在注意好辨证论治、掌握用量、注意配伍药物、不长时间使用、不滥用和不用于有肝病史患者的情况下,可以较安全地使用蓼科植物何首乌的根和藤。     

制何首乌和白蒺藜对小鼠毒性作用的实验研究

目的：研究制何首乌和白蒺藜对小鼠的毒性作用。方法：通过测定制何首乌和白蒺藜的半数致死量及最大耐受量来评价两种药物的急性毒性。将实验小鼠分为空白组、制何首乌组、白蒺藜组及制何首乌伍用白蒺藜组,按临床常用剂量灌胃2周后观察两药单用及伍用后对小鼠肝脏的毒性作用。结果：小鼠对制何首乌和白蒺藜的最大耐受倍数均大于100,表明两药毒性甚小。各实验组小鼠血清ALT、AST、ALP、TBA测定及肝脏指数与空白组无明显差异;各组小鼠肝脏外观及病理观察均基本正常。结论：制何首乌和白蒺藜对小鼠无急性毒性作用,两药按临床常用剂量单用或伍用时亦无急性肝脏毒性。     

制首乌联合定量运动对大鼠肝脏微循环及肝功能的影响

目的探讨长期服用制首乌联合定量运动对肝脏微循环和肝功能的影响。方法采用2×2析因设计,大鼠随机分为静止不给药（S/C）组,静止给药（S／D）组,游泳不给药（SW/c）组,游泳给药（SW／D）组,每天给予不同水平的制首乌醇提物（0g·kg-1、20g·kg-1 p．o）及不同水平的游泳运动（0h、1h）,连续30d。采用激光散斑血流监测视频系统检测大鼠肝脏微循环血流灌注量的变化;检测大鼠血清NOS3含量及肝功能9项生化指标。结果与S／C组比,制首乌醇提物降低大鼠肝脏血流平均灌注量（P〈0．01）,同时显著降低血清内皮源一氧化氮合成酶（NOS3）含量（P〈0．05）,并可显著升高大鼠总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）,显著降低间接胆红素（IBIL）（均P〈0．001）。游泳对制首乌引起的肝脏微循环灌注量和血清NOS3含量下降均有显著恢复作用,但游泳不能改善制首乌引起的血清胆红素异常。结论本研究首次证明大剂量长期服用制首乌可导致肝脏微循环灌注量障碍,而适当的运动则可能拮抗药源性肝脏微循环障碍。     

山海丹片中何首乌定性定量方法的研究

目的 建立测定山海丹片中何首乌的定性定量方法,更好地控制产品质量.方法 采用薄层色谱法对处方中的何首乌进行鉴别,采用高效液相色谱法测定何首乌中2,3,5,4＇-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量.结果 薄层色谱鉴别斑点清晰,分离度好,阴性无干扰;2,3,5,4 ＇四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.015～0.30μg范围内线性关系良好(r＝1),平均回收率为95.5％,RSD＝0.48％.结论 本方法专属性强、灵敏度高、重复性好,可用于山海丹片中何首乌的质量控制.     

何首乌炮制前、后水溶性糖含量的比较研究

目的比较何首乌炮制前、后水溶性糖的含量。方法采用硫酸-蒽酮比色法测定何首乌生品及其炮制品中水溶性总糖、单糖-低聚糖、多糖的含量。结果葡萄糖检测浓度在0.06~0.60mg/ml范围内与吸收度线性关系良好;水溶性总糖、单糖-低聚糖平均回收率分别为99.2%(RSD=2.3%)、99.7%(RSD=2.5%)。结论何首乌炮制后水溶性总糖含量升高,其中单糖-低聚糖、多糖均有所增加,以多糖含量增加为主。