CAG方案对HL-60细胞及耐药株作用机理的研究

目的研究小剂量阿糖胞苷和阿克拉霉素联合G-CSF（CAG方案）对HL-60细胞及其耐药株HL-60／A的作用机理。方法以白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60／A为实验模型，模拟临床给药方式，体外加入Ara-C、ACR、G-CSF三药，作用24、48小时后收集细胞，分别进行细胞计数，细胞形态观察，MTr法检测不同药物对两种细胞株的生长抑制率，流式细胞仪检测细胞早期凋亡标记Anncxin V，细胞分化抗原CD11h以及进行细胞周期分析。结果经CAG作用48h后，两种细胞株数量明显减少，形态显示凋亡小体增多；早期凋亡标记Annexin V明显增高，CD11b表达轻度升高，与CA组比较，结果有显著差异（P〈0．05）。细胞周期分析显示，CAG作用24h后，与CA组比较，S期细胞比例增高（P〈0．05）；48h后比例下降，结果未见明显差异（P〉0．05）。HL-60细胞与HL-60／A细胞比较，两种白血病细胞株经CAG作用48h后，在细胞数量、细胞形态、凋亡细胞比例、CD11b表达及S期细胞比例的改变方面未见明显差异。结论CAG方案对白血病细胞株HL-60、HL-60／A的作用机制主要是通过GCSF促使白血病细胞进入细胞周期S期，增加小剂量Ara-C、ACR对自血病细胞的细胞毒性，以诱导细胞凋亡为主，轻度诱导分化。     

肌醇六磷酸对结肠癌HT-29细胞分化的影响

目的 研究肌醇六磷酸（IP6）对结肠癌细胞株HT-29细胞周期的影响,探讨IP6诱导HT-29细胞分化的作用及其机制。方法 将HT-29细胞与不同浓度（0、1.8、3.3 mmol/L）IP6共同孵育24、48、72 h后,收集细胞,使用流式细胞仪检测细胞周期,并用透射电镜观察细胞结构的变化。结果 除1.8 mmol/L IP6作用24 h对HT-29细胞周期分布没有明显的影响外,其他各组G0/G1期细胞明显增多,S期、G2/M期细胞则相应减少。同时,IP6作用后细胞结构发生改变,出现核固缩、细胞器丰富、微绒毛增多等分化趋势。结论 IP6能够调节HT-29细胞周期,阻止细胞从G0/G1期进入S期,从而诱导细胞分化。     

JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达及意义

为了研究JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达规律,探讨其在白血病细胞分化和凋亡中的意义及可能的作用机制,应用FCM检测HL-60细胞经ATRA（10^-6 mol/L）、Ara-C（10 ng/ml）、TPA（10^-8 mol/L）作用后2、4、6、8天CD13、CD14、CD15、CD11b改变及细胞周期变化;应用半定量RT-PCR及蛋白印迹技术检测JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达趋势以及相关凋亡因子Bcl-2、HSP27和HSP70的表达.结果表明：经上述药物分别处理HL-60细胞后,不同时段FCM相关指标检测结果证明其分别向粒、单核、巨噬细胞样分化.JWA基因表达呈时间依赖性升高;Bcl-2则呈时间依赖性下降;HSP70在ATRA及TPA组与JWA表达呈正相关,与Bcl-2呈负相关,而各组HSP27并无表达.ATRA处理HL-60细胞后JWA基因表达趋势与原代细胞相反,且不需要ATRA诱导分化作为前提.分别以Ara-C 10 ng/ml和Ara-C 20 ng/ml处理HL-60细胞后,JWA基因的表达呈反向变化,即前者呈时间依赖性增加,而后者则下降.结论：JWA基因在实现ATRA及TPA诱导白血病细胞分化和凋亡中可能具有双重调节作用;JWA基因表达的高低与Ara-C诱导分化作用及细胞毒作用有关;HL-60细胞与原代白血病细胞在诱导分化机制方面可能不尽相同.     

塞来西布对HL-60细胞增殖、凋亡及表达VEGF影响的体外研究

目的研究塞来西布（Celecoxib）对急性髓系细胞白血病（AML）HL-60细胞的增殖抑制、诱导凋亡作用及其机制。方法以不同浓度的Celecoxib作用于体外培养的HL-60细胞,用MTT法检测细胞生长抑制率;用流式细胞仪分析凋亡细胞的百分率和细胞周期变化;QRT—PCR法检测VEGF表达水平。结果Celeeoxib以浓度依赖性方式有效地抑制HL-60细胞增殖,Celecoxib增加G0／G1期HL-60细胞百分率,降低S、G2期HL-60细胞百分率;Celecoxib能以浓度依赖性方式诱导HL-60细胞凋亡。当Celecoxib浓度大于40μmol／L时,随着Celecoxib浓度增高,HL-60细胞VEGF-mRNA的表达逐渐降低,呈浓度依赖性变化。结论Celecoxib对HL-60细胞具有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用,增殖抑制可能在于阻断了细胞周期的进行,降低VEGF活性可能是其诱导凋亡重要作用机制之一。     

1,25-二羟基维生素D3诱导HL-60细胞向成熟单核细胞的分化

目的：观察1，25-二羟基维生素D3对白血病细胞株HL-60的分化诱导作用及其分子机制。 方法：实验于2005-08／11在中南大学湘雅二医院中心实验室进行。将细胞浓度为2&;#215;10^8L^-1-HL-60细胞，分别以0，10^-9，10^-8，10^-7，lO^-6mol／L的l，25-二羟基维生素D3孵育72h，对照组加入等量的无水乙醇。Western印迹技术鉴定维生素D受体在各组HL-60细胞的表达；Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化；流式细胞术检测细胞表面标志物CDl4抗原的表达；反转录-聚合酶链反应法分析c-myc基因的表达。 结果：①10^-8mol／Ll，25-二羟基维生素D3作用前后HL-60细胞均表达维生素D受体，且药物作用后维生素D受体的表达上调。②10^-5mol/L，25-二羟基维生素D3可明显诱导HL-60细胞向成熟单核细胞系分化，54．02％的细胞CDl4表达阳性，对照组为5、23％（P〈0．01）。⑨l，25（0H）：D3作用72h后，HL-60细胞的c-myc／f3一actin比值为0、27，对照组为0．89，两者比较差异显著（P〈0．01）。 结论：①l，25-二羟基维生素D3可诱导HL-60细胞向成熟单核细胞分化，其受体维生素D受体参与了HL-60细胞代谢的调节。②1，25-二羟基维生素D，诱导细胞分化的同时伴随c-myc基因表达下调．表明c-myc基因表达下调是其诱导HL-60细胞分化的分子机制之一。     

二乙酰己二胺治疗高危型骨髓增生异常综合征的研究

本研究探讨癌细胞诱导分化剂二乙酰己二胺(CAHB)对高危型骨髓增生异常综合征(MDS)的疗效,查明其在体外对HL-60细胞的作用及可能机制.高危型MDS患者8例,给予CAHB治疗2个疗程,用药前后计数骨髓原幼粒细胞和单核细胞的比例.在体外试验中用MTT法检测CAHB对HL-60细胞增殖的抑制作用,流式细胞术(FCM)检测CAHB时HL-60细胞表面CD11b和CD14分化抗原表达的影响,Annexin V/PI双染色法检测CAHB诱导HL-60细胞凋亡的作用,FCM检测CAHB对HL-60细胞周期分布的影响.结果表明,8例患者用CAHB治疗后.骨髓的原幼粒细胞和单核细胞比例有不同程度的下降,造血系统毒副反应主要是血小板减少.MTT检测发现,HL-60细胞经1、2、3、4 mmol/L CAHB作用72小时后,HL-60细胞的增殖受到抑制,并且该作用随药物浓度的增加而增强.HL-60细胞分别经1、2、3、4 mmol/L CAHB作用72小时后,CDIlb的阳性表达率为(22.39±3.97)%、(33.12±4.46)%、(49.25±5.27)%和(78.05±5.66)%,与空白对照组的(5.89±2.94)%比较,差异有统计学意义(p＜0.01).而CD14的表达在各组细胞中均为阴性,这表明CAHB可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞系分化,并且该作用随药物浓度的增加而增强.HL-60细胞经1、2、3、4 mmol/L CAHB作用72小时后,其凋亡率(Annexin /PI-)仅较空白对照组略有增加.此结果提示在1-4 mmol/L浓度下,CAHB诱导HL-60细胞凋亡的作用很微弱.HL-60细胞经1、2、3、4 mmol/L CAHB作用72小时后,随药物浓度的增加,G0/G1期细胞的比例逐渐增加,而S期和G2/M期细胞的比例相应地逐渐减少,这表明CAHB能阻滞HL-60细胞于G0/G1期,并且该作用随药物浓度的增加而增强.结论CAHB对MDS有减少原幼粒细胞和单核细胞的作用,该治疗作用可能主要是通过诱导分化实现的,在治疗浓度时无诱导凋亡的作用,细胞周期的阻滞作用可能是CAHB诱导分化的基础.用药后血小板减少的副作用可能与CAHB的抑制造血相关.     

1，25—二羟基维生素D3诱导HL—60细胞分化并下调nm23基因的表达

目的 观察1,25-二羟基维生素D3[1,25（OH）2D3]对白血病细胞株HL-60的诱导分化作用并探讨其机制。方法 通过MTT试验、细胞形态观察,表面标志分析和硝基四氮唑蓝（NBT）还原反应。观察1,25（OH）2D3作用后HL-60细胞增殖的改变和分化情况;通过流式细胞仪和RT-PCR检测细胞周期和nm23基因表达的变化。结果 HL-60细胞经1,25（OH）2D3作用后增殖受抑制,向成熟单核细胞系分化。细胞被阻滞在G1期、nm23基因的表达下调。结论 1,25（OH）2D3对HL-60细胞株具有诱导分化作用。其作用机制可能与下调nm23基因的表达有关。     

钠氢交换蛋白-1特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪对HL-60/ADM细胞pHi变化及细胞增殖、凋亡的影响

为了探讨钠氢交换蛋白-1（NHE-1）抑制剂二甲基氨氯吡咪（DMA）对HL-60/ADM细胞pHi变化及细胞增殖、凋亡的影响,以敏感HL-60细胞为对照,用不同浓度的DMA干预后,荧光指示剂（BCECF/AM）检测法检测细胞内pHi,微量噻唑蓝法（MTT）检测细胞生长的抑制率,流式细胞术检测细胞周期变化,TUNEL法检测原位细胞凋亡,对比HL-60/ADM细胞与HL-60细胞之间的差异.结果显示：HL-60/ADM细胞内pHi较HL-60细胞显著升高;DMA作用下,HL-60/ADM细胞的pHi降低幅度、生长抑制率、细胞凋亡率均显著高于HL-60细胞;当DMA浓度100-150 μmol/L时,HL-60/ADM细胞的G0/G1期细胞比率增加幅度、S期及G2/M期细胞比率降低幅度均高于HL-60细胞.结论：NHE-1特异性抑制剂DMA引起HL-60/ADM的pHi降低,可抑制细胞生长并诱导细胞凋亡;且DMA对HL-60/ADM细胞的生长抑制作用显著高于HL-60细胞.     

脐带间充质干细胞降低HL-60对阿糖胞苷的敏感性

本研究探讨脐带间充质干细胞（hUC-MSC）对HL-60白血病细胞药物治疗敏感性的影响,为研究hUC-MSC对白血病细胞的调节作用提供资料。体外建立HL-60细胞与hUC-MSC的transwell及直接接触共培养体系;使用流式细胞仪检测阿糖胞苷对HL-60细胞凋亡的影响,并检测与hUC-MSC共培养对HL-60细胞细胞周期的影响;应用RT-PCR和Western blot检测Caspase 3 mRNA和蛋白表达变化;通过transwell共培养体系观察hUC-MSC对HL-60细胞凋亡影响的作用机制。结果表明,与hUC-MSC共培养可以显著减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡（P〈0.05）;hUC-MSC可以将HL-60细胞阻滞于G0/G1期,阻止其进入S期（P〈0.05）;与hUC-MSC共培养可以降低HL-60细胞中Caspase 3 mRNA和蛋白水平的表达（P〈0.05）;transwell体系中hUC-MSC同样可以减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞的凋亡（P〈0.05）。结论：hUC-MSC通过分泌可溶性细胞因子减少阿糖胞苷诱导的HL-60细胞凋亡,其机制可能与通过调节HL-60细胞周期及下调Caspase 3表达有关。     

2-甲氧基雌二醇诱导HL-60、K562细胞分化作用初探

2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）为雌二醇的生理代谢产物，已被证实具有多种抗肿瘤活性。国外有文献报道2ME2浓度〉0．5μmol／L即可抑制白血病等肿瘤细胞的增殖，并且对正常细胞无明显毒副作用，目前该药已应用于Ⅱ期临床试验中。但低剂量的2ME2是否具有诱导白血病细胞分化的作用目前尚未见报道。我们以髓系白血病细胞系HL-60和K562为研究对象，初步探讨2ME2对HL-60和K562细胞系的体外诱导分化作用。     

Primary small cell carcinoma of the esophagus: Case presentation and review of the literature

A case of primary small cell carcinoma of the esophagus is presented. The clinical, radiologic, and pathologic findings of our case and 72 other cases were reviewed. The most common presenting symptoms were weight loss and dysphagia. Eighty percent were larger than 4 cm at presentation and 97% were in the mid to distal esophagus. The esophageal tumors were identical histologically to small cell carcinoma of the lung. Esophageal luminal widening on esophagram has been found to be more common in nonsquamous cell carcinomas. While rare, small cell carcinoma should be considered in the differential diagnosis of primary esophageal tumors, particularly in the presence of these findings.     

氯化镉对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12增殖与分化的影响

目的研究不同浓度氯化镉对鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)增值和神经生长因子(NGF)诱导下PC12细胞分化的影响。方法①采用MTT比色微量分析,观察不同浓度的氯化镉对PC12细胞增值影响。②采用形态学方法,观察不同浓度的氯化镉对NGF诱导的PC12细胞分化的影响。结果不同浓度的镉对PC12细胞的增值有明显的抑制作用,存在剂量效应关系。不同浓度的氯化镉、不同作用时间对NGF诱导的PC12细胞分化无明显影响。结论氯化镉对PC12细胞的增值有抑制作用,而对NGF诱导的PC12细胞的分化无显著的影响。     

骨髓增生异常综合征CD34~ 细胞增殖与分化特性

利用吸附单克隆抗体的MACS分离系统分离纯化了16例MDS患者骨髓CD34~ 细胞,研究了其体外增殖与分化特性。结果表明:MDS CD34~ 细胞中CFU-GM,BFU-E和CFU-E均低于正常对照组,以BFU-E为显著,尤其是在MDS高转组。在MDS高转组中部分患者还可有白血病细胞集落的形成,说明MDS患者CD34~ 细胞在增殖与分化过程中存在明显异常,对其体外集落的培养在一定程度上可预测该MDS患者的预后。     

骨髓增生异常综合征患者骨髓T细胞功能状态研究

目的　研究骨髓增生异常综合征 (myelodysplasticsyndrome ,MDS)患者骨髓中辅助性T淋巴细胞 (Thelper,Th)亚群数量和比例改变及Th1细胞所承担的肿瘤负荷情况。方法　用流式细胞术检测 2 1例MDS患者、18例正常对照和 13例重型再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞胞浆内表达IFN γ的CD4 细胞 (Th1细胞 )和表达IL 4的CD4 细胞 (Th2细胞 )的数量和比例 ;分析MDS患者骨髓原始细胞比例与Th1细胞的相关性。结果　正常对照组骨髓Th1细胞、Th2细胞、Th1细胞 /Th2细胞分别为 (0 .4 8± 0 .10 ) %、(0 .2 4± 0 .19) %、2 .31± 0 .76 ;而MDS患者分别为 :(0 .36± 0 .11) %、(0 .76± 0 .35 ) %、0 .5 1± 0 .13,MDS患者骨髓Th1细胞减少 ,Th1细胞 /Th2细胞比例明显降低 (P <0 .0 1)。重型再生障碍性贫血患者三者指标分别为 (4.75±0 4 9) %、(0 .4 0± 0 .2 8) %、2 6 .5± 8.79,与正常对照组相比较 ,Th1细胞明显增多、Th1细胞 /Th2型细胞比例明显升高 (P <0 0 1) ;随着MDS及MDS转为的AML患者骨髓Th1细胞数量下降 ,白血病转化倾向细胞 ,即原始细胞数量逐渐增多。二者呈负相关 (r =- 0 .5 6 3,P <0 .0 1)。结论　 1.MDS患者T细胞免疫异常 ,Th1细胞 /Th2细胞失衡 ,抗肿瘤细胞免疫中起主要作用的Th1细胞数目减少 ,功     

骨髓间充质干细胞对异体自然杀伤细胞调节作用的研究

本研究探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对异基因自然杀伤细胞(NK)和NK-T细胞增殖和杀伤功能的影响。分离健康供者外周血单个核细胞,在抗人CD3单克隆抗体、IL-2和PHA诱导下培养扩增NK和NK-T细胞,用流式细胞术分析MSC共培养对扩增体系中NK和NK-T细胞比例的影响,MTT法观察MSC对NK细胞杀伤K562细胞的影响。结果表明:高密度MSC能抑制NK细胞的生成,MSC在0、1×105/ml和5×105/ml时培养体系中NK细胞的比例分别为(16.9±4.6)%、(14.0±8.6)%和(6.4±4.6)%,统计学分析有显著意义(P<0.05),但MSC在低密度条件下(1×104/ml)可促进NK细胞的生成,NK细胞比例可达(20.9±7.1)%,与无MSC相比有统计学意义(P<0.05)。MSC剂量的变化对共培养体系中NK-T细胞的比例无明显影响。MTT法检测结果显示,共培养体系中K562细胞杀伤作用与NK细胞比例平行,不同密度MSC可能通过对NK细胞比例的双向调节而调节NK细胞对K562细胞的杀伤作用。结论:MSC在低剂量时可促进NK细胞形成并增强其肿瘤杀伤作用,但在高剂量时可抑制NK细胞形成从而抑制其对肿瘤细胞的杀伤作用。     

检测白血病细胞增殖力的MTS/pms比色分析法的建立

为了探讨建立一种更为快速、安全、灵敏的白血病细胞增殖力的检测方法，本研究应用HL—60和K562细胞可转化MTS／pms形成水溶性待测产物，其光密度值在492nm波长下半自动测定的特点，研究了MTS／pms比色分析法取代MTT和INT用于白血病细胞增殖力的检测。结果表明，只有活的白血病细胞才能转化MTS／pms形成待测产物，且白血病细胞数与所测光密度值(OD)之间具有良好的相关性(γ＝0．963)；与MTT和INT法相比较，MTS／pms比色分析法中所形成的最终待测产物为水溶性，省略了上清波去除和加入有机溶剂的步骤。结论：MTS／pms比色分析法对白血病细胞增殖力的检测更具有快速、安全、准确、灵敏的优点。     

Sysmex SE—9500血细胞分析仪对异常形态细胞提示的可信性分析

目的：对Sysmex SE-9500全自动血细胞分析仪做出的异常形态细胞提示进行可信性分析,及初步评价其测定干细胞（HPC）的能力。方法：随机抽取本院332例住院患者的静脉抗凝血用SE－9500血细胞分析仪测试,同时每份标本都推片镜检,对SE－9500做出的异常形态细胞提示进行分析;选取做自身外周血干细胞移植的恶性肿瘤患者5例,在经过干细胞动员后抽取其血样本同时用流式细胞仪（FCM）测定CD34^ 细胞和用SE－9500的IMI通道测定HPC。结果：SE-9500对原始细胞、未成熟粒细胞,核左移,异形淋巴和有核红细胞提示的灵敏度分别为100％,92．9％,92．1％,65．9％,73．2％;特异性分别为90．8％,77．1％,70．9％,95．4％,96．0％。5例自身干细胞移植患者的外周血中都可以用SE－9500的IMI通道检出HPC细胞。结论：SE－9500对异常形态细胞的提示具有一定程度的可信性,但是不能够完全代替显微镜检查;SE-9500有望在未来的自身干细胞移植中发挥作用。     

T淋巴细胞对人骨髓造血细胞体外扩增的负调节作用

采用抗CD3或抗CD8单克隆抗体的补体细胞毒方法体外清除人骨髓MNC(单个核细胞)中的T淋巴细胞和用流式细胞技术(FACS)分析细胞表面标志,观察人骨髓T淋巴细胞对造血细胞增殖的负调节效应.将MNC加入含多种造血生长因子的培养基进行液态扩增并检测其CD34+细胞绝对数、粒-巨噬集落(CFU-GM)和多向祖细胞集落(CFU-GEMM)形成能力.结果表明,抗CD3,抗CD8或抗CD3+抗CD8单抗清除T淋巴细胞的骨髓MNC,其细胞总数经造血生长因子刺激培养20天分别扩增了75.8,79.6和77.4倍,明显高于对照组(67.0倍).体外培养6天时CD8清除组CD34+细胞的扩增最高可提高17.82%.上述3个清除组的CFU-GM产率分别为173.67±18.90,165.33±26.58和170.33±21.50,对照组79.67±8.33.这3个清除组与对照组比较差异显著(P＜0.05).上述3个清除组的CFU-GEMM产率分别为431.33±34.56,370.33±42.10和386.67±10.02,对照组为177.67±26.86.这3个清除组与对照组比较P值分别为＜0.002,＜0.05和＜0.005.此研究结果提示骨髓中T淋巴细胞可以抑制造血细胞的体外扩增、CFU-GM和CFU-GEMM产率,其作用机制有待进一步探讨.     

Stem cells in the treatment of diabetes

Clinical islet transplantation trials based on cadaveric allogenic islets have demonstrated that it is indeed possible to restore near‐physiological insulin secretion capacity in a type 1 diabetic patient through transplantation of insulin‐producing cells. In order to develop this form of therapy to become available for the vast majority of patients with diabetes, new sources of transplantable insulin‐producing cells need to be identified. Stem cells provide the best potential to achieve this goal. Controversial results have been presented concerning the existence and nature of pancreatic islet stem or precursor cells. An increasing body of evidence suggests that the pancreatic and hepatic cell types (hepatocytes, islet, acinar and ductal cells) have remarkable plasticity and can de‐ and trans‐differentiate into each other under appropriate conditions. Elucidation of the molecular mechanisms regulating these processes could lead to clinically applicable ways of either inducing pancreatic islet regeneration in situ or to expanding the insulin‐producing cells in vitro for transplantation. The emergence of human embryonic stem cells has led to an active area of research aiming to achieve targeted differentiation of these cells into a safely transplantable beta‐like cell. After initial excitement, it appears that much basic research is still required before this goal could be achieved.     

大剂量地塞米松导致胸腺细胞损伤的作用研究

本研究观察大剂量地塞米松对胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells,TEC）的结构和功能的影响.将6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分为地塞米松（20 mg/kg）处理组以及正常对照组.给药后第5d,取小鼠新鲜胸腺标本,应用常规病理学和免疫荧光技术观察TEC的形态学变化,并用流式细胞术分析胸腺内细胞总数、TEC和各胸腺细胞亚群数量的变化,同时应用实时定量PCR分析与TEC功能相关的基因的表达情况.结果表明,与正常对照组相比,大剂量地塞米松处理组TEC结构被破坏、胸腺内总细胞数减少（P＜0.05）;胸腺细胞各亚群构成发生变化,其中双阳性（double positive,DP）胸腺细胞数急剧降低（P＜0.05）;与胸腺修复功能相关的因子Foxn1和IL-22的表达量较正常对照小鼠明显增加（P＜0.05）.结论：大剂量地塞米松的使用可导致TEC的结构和功能破坏,并诱导与TEC修复相关的基因的表达水平上调.