次乌头碱对心肌细胞Na+通道SCN5A及NCX mRNA表达的影响

目的：考察次乌头碱（HA）对原代培养乳大鼠心肌细胞钠通道SCN5A亚基、钠钙交换蛋白（NCX）mRNA表达的影响。方法：体外培养乳大鼠心肌细胞,采用RT-PCR法测定Na通道SCN5A及NCX mRNA表达。结果：HA作用15min时,60μΜ/L和120μΜ/L HA能分别增加心肌细胞膜Na通道SCN5A及NCX 的mRNA表达量（P＜0.05）;观察5min、15min、60min时HA对心肌细胞上述基因表达的影响,60μM/L HA对心肌细胞作用15min及60min可引发Na通道SCN5A及NCX mRNA的表达量增多（P＜0.05）。结论：次乌头碱（≥60μΜ/L）可通过增加心肌细胞膜Na通道SCN5A、NCX的mRNA表达,继而激活L-Ca通道,参与细胞内钙超载及心律失常的发生过程,在乌头碱类天然药物中毒时干预上述靶点基因改变可缓解中毒性心律失常的发生。     

次乌头碱对心肌细胞Ca2+调控蛋白mRNA表达的影响

目的 考察次乌头碱(HA)对原代培养乳大鼠心肌细胞L-钙通道、钙调蛋白(CaM)、肌质网雷诺定受体(RyR2)mRNA表达的影响.方法 体外培养乳大鼠心肌细胞,采用RT-PCR法测定L-钙通道α1C亚基、CaM及RyR2 mRNA的表达.结果 HA作用15 min时,60、120 μΜ/L能提高心肌细胞膜L-钙α1C ...     

哇巴因和乌头碱对豚鼠和大鼠心肌细胞钠电流的作用

目的 观察哇巴因和乌头碱对豚鼠和大鼠心肌细胞钠电流的作用,探讨二药诱发心律失常的机制.方法 用全细胞膜片钳技术分别记录豚鼠和大鼠单个心肌细胞钠电流.结果 在-40mV电压下,哇巴因5μmol/L使Ina从(-48.3±8.9)pA/pF减少到(-22.6±5.6)pA/pF(抑制60.1%,n=5,P＜0.01);乌头碱1μmol/L使Ina从(-21.8±5.8)pA/pF增加到(-67.3±7.8)pA/pF(增加208.7%,n=4,P＜0.01).结论 哇巴因抑制豚鼠心肌细胞钠电流而乌头碱增加大鼠心肌细胞钠电流.不论是抑制还是促进钠电流,二药均使离子通道失衡,这是其诱发心律失常的重要机制.     

表达心脏SCN5A基因的人胚肾细胞钠电流特性及其对钠通道阻滞剂的反应性

目的 利用人胚肾293细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并研究其钠电流特性和对钠通道阻滞剂的反应性.方法 野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于人胚肾293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录给药(氟卡尼与利多卡因)前后的钠电流.结果 SCN5A基因转染效率约为60%;测试电压为-40 mV时记录到钠电流峰值大小约为-8 nA;100 μmol/L的氟卡尼轻度抑制钠电流,使钠电流峰值减少(21.1±4.6)%[(-435.8±30.5) pA/pF vs.(-343.9±27.1) pA/pF,P＜0.01];氟卡尼使钠通道激活曲线和失活曲线均呈负向移动,改变的幅值分别是-6.08 mV[(-51.88±1.20) mV vs.(-57.96±0.79) mV,P＜0.05]和-9.08 mV[(-94.12±0.13) mV vs.(-103.20±0.11) mV,P＜0.05];1 Hz和10 Hz频率刺激时,氟卡尼使钠电流分别减少(64.5±10.7)%和(83.5±12.2)%(P＜0.01);30 μmol/L利多卡因使钠通道失活后快恢复时间常数和慢恢复时间常数分别延长2倍和3倍.结论 表达心脏钠通道SCN5A基因的人胚肾293细胞模型可用于基因特异性的钠通道阻滞剂安全性与药效学筛查.     

肝纤维化大鼠肝组织Na+/Ca2+泵mRNA表达

目的: 了解肝纤维化大鼠肝组织Na /Ca2 泵(Na /Ca2 exchanger,NCX) mRNA表达状况,探讨其与肝纤维化程度的关系及意义.方法: CCl4 sc法诱导大鼠肝纤维化,观察肝组织NCX及α1(Ⅰ) mRNA表达水平,检测血清HA,CⅣ,PCⅢ,血清肝纤维化相关酶 (β-NAG,MAO,ALD)、肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量及肝组织病理学变化,分析其相关性与临床意义.结果: 20只正常大鼠肝组织NCX mRNA表达除1只弱阳性外,其余均为阴性,半定量积分仅为(0.10±0.00);而30只模型组大鼠全部呈阳性,半定量积分显著增加(P<0.05).与正常组比较,模型组大鼠血清HA[(455.79±113.55) vs (112.41±45.62) μg/L],CⅣ,[(159.62±29.64) vs (35.69±9.68) μg/L],PCⅢ [(265.54±98.21) vs (89.99±10.85) μg/L]明显增高(均为P<0.01);β-NAG,MAO,ALD活性显著增加(分别增加2.20,2.14,1.57倍,P<0.01),模型组大鼠NCX mRNA表达与α1(Ⅰ) mRNA表达水平、肝组织Hyp含量、血清HA,CⅣ,PCⅢ水平、肝组织纤维化积分均呈正相关,相关系数r分别为 0.48, 0.64, 0.52, 0.49, 0.56, 0.60(均为P<0.05).结论: 肝纤维化大鼠肝组织NCX mRNA表达明显增强,与胶原代谢水平及肝脏组织病理学变化呈正相关,有望作为判断肝纤维化的有用指标,值得进一步研究.     

乌头碱诱发心律失常后心脏M3受体含量的变化

目的检测乌头碱诱发心律失常后心肌M3受体mRNA表达量的变化。方法静脉注射乌头碱(12.5μg/kg)制备大鼠心律失常模型,RT-PCR法检测心肌中M3受体mRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组心肌M3受体mRNA的表达增加,差别有统计学意义(P<0.05)。结论乌头碱诱发心律失常后心肌M3受体mRNA的表达增强。     

莲心碱对豚鼠心室肌细胞动作电位及钠与钙电流的影响

为探讨莲心碱 (liensinine,L ien)对心肌离子流的影响及抗心律失常作用机制。采用全细胞膜片钳技术 ,记录了 L ien对单个豚鼠心肌细胞动作电位 (AP)及纳电流 (INa)与 L -型钙电流 (ICa- L)的影响。 L ien 3～ 30μmol/ L 可剂量依赖性地降低 AP幅度 (APA)、静息电位 (RP) ,延长 AP时程。 L ien10 ,30 μm ol/ L 分别使 INa及 ICa- L从给药前的 (8.6± 2 .3) n A和 (75 8± 177) p A降至 (5 .4± 1.7)、(2 .2± 1.6 ) n A和 (335± 12 2 )、(137±10 0 ) p A。L ine10 μmol/ L 抑制 INa和 ICa- L的 I- V曲线并使后者的峰值电流电位略右移。结果表明 L ien有钠、L -型钙通道阻滞作用 ,这些可部分解释其抗心律失常作用机制     

钠钙交换体与心脏疾病的研究进展

钠钙交换体（Na＋/Ca2＋exchanger,NCX）在哺乳动物心肌组织中高度表达,参与胞内钙的调节,在维持心脏正常功能活动中起重要作用。本文就心肌组织钠钙交换体及与心脏疾病的研究进展作一综述。 1钠钙交换体的生物学特性 钠钙交换体是多种细胞的阳离子转运蛋白,在维持细胞钙稳态起到非常重要的作用。1968年Reuter 和Seitz首次在心肌细胞发现了钠钙交换现象。随后,Philipson等人首次从狗的心肌组织中分离出由938个氨基酸组成的NCX蛋白,具有9个跨膜螺旋,其分子量为110 KDa。NCX不仅存在于心肌细胞、神经细胞和平滑肌细胞,还分布在细菌、酵母等微生物细胞。 NCX包括3个亚型：NCX 1、NCX 2和NCX 3,其中NCX 1主要在心脏表达和分布,也是研究最多的一种钠钙交换体[1]。NCX 1亚型含有多种剪接变体,由互相排斥的外显子A或B,以及小的盒式外显子C-F共同组成,其中ACDEF组成最长的剪接变体构成心脏的NCX 1亚型[2]。基于跨膜结构域中含有2个保守的α-重复序列,     

钠通道重叠综合征相关基因SCN5A在H9C2细胞中的表达

目的构建表型重叠家系相关基因SCN5A del QKP1507-1509突变型真核表达载体,研究其在H9C2细胞中的表达。方法一步法定点诱变技术构建SCN5A基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体,电穿孔方法将野生型和突变型质粒转染至H9C2细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)及Western blot技术检测其mRNA及蛋白表达情况。结果琼脂糖凝胶电泳法及DNA直接测序法均表明定点突变成功,RFQ-PCR及Western blot结果显示,野生组、突变组和混合组SCN5A基因mRNA相对表达量分别为1.089±0.459、1.011±0.840和1.069±0.492,3组SCN5A基因mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。野生组、突变组和混合组SCN5A蛋白在H9C2细胞的相对表达量分别为3.781±0.221、3.466±0.176和3.714±0.198,3组SCN5A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建钠通道基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体并转染至H9C2细胞,该突变未引起钠通道在细胞膜的异常表达,为进一步功能研究提供了研究基础及方向。     

二乙酰基莲心碱对心室肌细胞膜钠、钙通道的影响

目的 :探讨二乙酰基莲心碱 (Diacetyl linesinine)对家兔心室肌细胞膜钠、钙离子通道的影响。方法 :选取10只体重 1.5～ 2 .0kg的健康新西兰大耳白兔 ,酶解法分离单个心室肌细胞 ,应用全细胞膜片钳技术观察 10 ,30 ,10 0 μmol·L-1的二乙酰基莲心碱对心室肌细胞膜钠通道和钙通道的作用。结果 :二乙酰基莲心碱浓度依赖性减少钠电流和L 型钙电流 ,10 ,30 ,10 0 μmol·L-1的二乙酰基莲心碱可分别使峰值钠电流降低 4 0 .7% ,78.4 %和 89.4 % ;使峰值L 型钙电流降低 5 6 .6 % ,6 5 .7%和 73.6 %。另外 ,二乙酰基莲心碱可使钠通道灭活曲线左移 ,并可减慢钠通道灭活后的恢复过程。结论 :二乙酰基莲心碱对钠电流及L 型钙电流具有浓度依赖性阻滞作用 ,并可作用于钠通道的失活态 ,这些可以部分解释其抗心律失常作用机制。     

大鼠在体心肌缺血再灌注损伤组织间液钙离子动态与胞膜钠钙交换体表达

目的检测大鼠心肌在体缺血再灌注损伤(IR)组织间液钙离子浓度,比较IR前后心肌胞膜钠钙交换体(NCX)mRNA表达水平,探讨其对钙超载的意义。方法 12只SD大鼠随机分为IR组和对照组,以微透析技术连续收集心肌组织间液标本,原子吸收光谱法检测钙离子浓度。IR组通过结扎(20min)后松解(60min)冠状动脉前降支造成心肌缺血再灌注,结束时收取左心室缺血区和右心室心肌行NCX mRNA定量PCR检测,实验前后采血检测血钙和肌钙蛋白T(cTnT)。对照组免除结扎、松解前降支,其余操作与IR组一致。结果 IR组血浆cTnT浓度显著升高[对照组vs IR组,ng/mL:(1.62±0.60)vs.(4.29±2.22),P=0.031]。IR组心肌组织间液钙离子浓度在缺血期无明显变化,再灌注20min显著下降,心肌析出液钙离子浓度与对照组存在显著性差异[对照组vs.IR组,ng/mL:(224±31)vs.(136±39),P=0.002]。血浆Ca2+浓度实验前后无显著差异。心肌细胞膜NCX mRNA表达水平在组间和组内均无显著差异。结论大鼠在体心肌缺血20min再灌注60min,组织间液钙离子浓度在缺血期无明显变化,再灌注期迅速下降,这种变化趋势与胞膜NCX表达无关。     

ω-3鱼油脂肪乳对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响

目的探讨ω-3鱼油脂肪乳对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响及相关机制。方法 50只雄性大鼠随机分为ω-3鱼油脂肪乳组和对照组,每组25只。实验前15 d,ω-3鱼油脂肪乳组大鼠隔日经尾静脉注射ω-3鱼油脂肪乳2 mL.kg-1;对照组注射等量的生理盐水。应用乌头碱诱发心律失常大鼠模型,观察记录2组大鼠室性期前收缩、室性心动过速出现的时间及心律失常评分,Western blot检测大鼠心肌组织缝隙连接蛋白43(CX43)的表达。结果ω-3鱼油脂肪乳组大鼠室性期前收缩和室性心动过速出现时间均显著长于对照组(P<0.05)。静脉注射乌头碱后1 min,2组大鼠心律失常评分比较差异无统计学意义(P>0.05);静脉注射乌头碱后3、5、7 min,ω-3鱼油脂肪乳组大鼠心律失常评分均低于对照组(P<0.05)。ω-3鱼油脂肪乳组大鼠心肌组织中CX43蛋白的表达高于对照组(P<0.05),但2组大鼠心肌组织中去磷酸化CX43蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论ω-3鱼油脂肪乳可能通过促进CX43的磷酸化改善乌头碱诱导的大鼠心律失常。     

细辛含药血清对大鼠心肌细胞钠通道的影响

目的：研究中药细辛含药血清对大鼠心肌细胞钠通道的影响,从离子通道水平揭示细辛抗缓慢型心律失常作用的可能机制。方法：用原代培养方法获得单个心肌细胞,用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞加入含药血清前后钠通道电流的变化。结果：25%细辛含药血清对钠通道的激活曲线、I-V曲线均有影响。结论：细辛含药血清对心肌细胞钠通道电流有增强作用。     

大鼠胚胎期心脏Na+通道基因SCN5A的表达

目的 研究大鼠胚胎发育过程中,编码心肌组织电压门控Na 通道α亚单位SCN5A基因mRNA的表达和蛋白定位.方法 大鼠胚胎期分7个时间点(E12.5-P1),提取心脏总RNA,RT-PCR和免疫组化方法分别检测SCN5A基因mRNA表达和蛋白定位.结果 大鼠胚胎发育期SCN5A基因mRNA表达呈动态模式,E12.5d(0.425±0.012)表达最少,E13.5d(0.532±0.012)和E14.5d(0.665±0.119)相对增加,E15.5d达到高峰(1.08±0.01),E17.5d(0.870±0.035)与E19.5d(0.855±0.057)相比略有降低,无显著性差别,提示胚胎发育后期表达量趋于平衡.出生后一天(P1)表达量(0.751±0.041)较胚胎期表达显著降低.除E17.5d与E19.5d比较无统计学意义外(P＞0.05),其余组间比较均有统计学意义(P＜0.001).免疫组化结果显示,SCN5A蛋白表达高峰及在左、右心室肌及室间隔中表达持续时间各不相同,胚胎早期SCN5A蛋白在不同心腔表达相对均匀,后期在心外膜和心室左、右束支位置表达增强.结论 SCN5A基因与大鼠胚胎心脏传导系统发生及其功能相关,Na 电流是形成胚胎发育中期心肌动作电位的主要成分.     

低氧对大鼠心肌细胞蛋白激酶A活性与SCN5A基因表达的影响

目的 研究低氧对培养大鼠心肌细胞蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)与SCN5A基因表达的影响.方法 将原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞随机分为5组:对照组、低氧(5%CO2+2%O2+93%N2)培养1h组、6h组、12h组和24h组,利用非放射性方法测定各组细胞内PKA活性,利用RT-PCR和Western blot等方法检测各组SCN5A基因表达情况.结果 各组PKA活性:低氧1h组和低氧6 h组高于正常组(P<0.01),低氧12 h组和24 h组低于正常组(P<0.01).SCN5A mRNA相对表达量与蛋白质表达量:低氧1h组和低氧6h组显著高于对照组;低氧12 h组和低氧24 h组显著低于对照组.结论 低氧对培养细胞内PKA活性与SCN5A基因的表达有一定调节作用,且对PKA的作用早于对SCN5A基因表达的作用,PKA可能参与影响大鼠心肌细胞缺氧后SCN5A基因的表达.     

Brugada综合征SCN5A基因G1712C突变的功能分析

目的 探讨Brugada综合征SCN5A基因G1712C新突变的电生理机制.方法 采用体外定点诱变法构建携带有基因突变G1712C的pRc/CMV-hH1的表达载体,lipo3000脂质转染法建立稳定表达pGFP-IRES-hβ1质粒的HEK293细胞系,并用G418进行筛选鉴定.分别做野生型的pRe/CMV-hHl (hHl)和携带有基因突变G1712C的pRc/CMV-hHl (mhHl)瞬时转染表达.进行全细胞膜片钳实验记录钠通道电流.实验结果由PatchMaster以及IGOR Pro 6.0软件分析.结果 G1712C位于Na+通道蛋白α亚单位的DⅣ区S5与S6之间的P-loop上.在瞬时转染野生型的hH1的细胞系中,指令电位从-60 mV逐渐上升时,钠电流也渐变大,在-20 mV时完全激活;激活电压在-60 mV到-50 mV,反转电位在50 mV左右.在瞬时转染突变型G1712C的细胞系中,没有发现钠电流.结论 野生型hH1所表达的钠通道蛋白与正常心肌细胞钠通道电生理特性相似.SCN5A基因G1712C突变导致Nav1.5通道失去功能,可能是该家系Brugada综合征的病因.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)诱导分化为心肌样细胞内向钠电流的状态.方法取健康SD大鼠骨髓,经密度梯度离心和贴壁培养获得MSCs,传至第两代,以10 μmol/L的5-氮杂胞嘧啶(5-aza)孵育诱导24h.培养4周,用免疫细胞化学染色方法鉴定心肌样细胞(cardiomyocyte-like cells);用全细胞膜片钳技术,检测胞膜内向钠电流,并与未经诱导的MSCs和急性分离的心肌细胞进行比较.结果MSCs经5-aza诱导后部分表达心肌特异性肌钙蛋白T,在诱导后4周记录到快速激活和失活的膜内向钠电流.与急性分离的心肌细胞比较,相同刺激脉冲下心肌样细胞所产生的电流幅值较小,Ⅰ-Ⅴ曲线向右偏移.结论经5-aza诱导后,MSCs可分化成具有兴奋性内向钠电流的心肌样细胞.     

尾加压素Ⅱ致体外培养乳鼠心肌细胞肥大效应研究

目的 观察尾加压素Ⅱ(Urotensin Ⅱ,U Ⅱ)对心肌细胞肥大的效应.方法 以体外培养的SD乳鼠心肌细胞为实验模型,分为正常对照组,单纯U Ⅱ作用组,环胞素A(CsA)阻断组.用real-time PCR方法分析β-MHC、 CaN(钙调神经磷酸酶)mRNA表达的变化,用免疫印迹法(Western blot)研究心肌肥大过程中β-MHC、CaN蛋白表达的变化,探讨U Ⅱ对心肌细胞肥大的影响.结果 ①随着U Ⅱ浓度的增加,心肌细胞β-MHC、CaN mRNA和蛋白表达明显增加,其中10-8 、10-7 mol/L U Ⅱ组与对照组相比较差异显著(P<0.05);②用10-8 mol/L U Ⅱ处理心肌细胞12、24、48 h,随着时间增加,心肌细胞β-MHC、CaN mRNA和蛋白表达呈递增趋势,其中处理24 h组与正常对照组有显著差异(P<0.05);③预先用环胞素A 5μmol/L(cyclosporin A CsA)处理正常心肌细胞24 h,然后用10-8 mol/L U Ⅱ作用24 h,心肌细胞β-MHC、CaN mRNA和蛋白表达与正常心肌细胞经10-8 mol/L U Ⅱ单纯作用24 h差异有显著意义(P<0.05).结论 U Ⅱ能够诱导心肌细胞的肥大,环胞素A(CsA)能阻断此效应,CaN参与了U Ⅱ诱导的心肌肥大过程.     

麻黄附子细辛汤中有效成分治疗缓慢性心律失常机制研究进展

麻黄附子细辛汤是中医治疗缓慢性心律失常的常用方剂,其作用机制有多种观点,众多研究认为这种抗心律失常药理作用是通过调节心肌细胞膜各离子通道完成的。目前研究表明麻黄主要有效成分麻黄碱可分别通过KCNQ1/KCNE1通道和cAMP/PKA途径刺激钾、钙通道激活;附子主要有效成分乌头碱及去甲乌头碱均可通过调节心肌细胞膜钠、钾、钙电流而影响心肌兴奋性和传导性;而细辛的有效成分β-细辛醚则可通过阻滞钙通道而扩张冠脉,并可激活心肌细胞膜钠通道而发挥强心作用。该文将针对这三种药物作用于心肌细胞膜离子通道调节机制、临床研究的不足等问题做一总结。     

乌头碱中毒及双黄连干预对心肌雷诺定受体表达的影响

目的：研究乌头碱中毒及双黄连注射液干预对心肌雷诺定受体(rynanodine receptor 2,RyR2)表达的影响,探讨双黄连对抗乌头碱致心律失常毒性的作用机制。方法：将52只SD大鼠随机分成3组：乌头碱组(A组,n=20),双黄连组(B组,n=20)和对照组(C组,n=12)。A,B两组先予乌头碱0.3 mg/kg灌胃,30min后A组予生理盐水腹腔注射,B组予双黄连100mg/kg腹腔注射;对照组两次均予生理盐水处理,连续给药10 d。于第1,3,6,10 天记录大鼠心电图变化并进行心律失常评分,采用免疫荧光染色及实时定量PCR技术检测大鼠心肌组织RyR2蛋白及基因的表达变化。结果：各时间点B组的心律失常评分均较A组低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);第1天A组心肌RyR2蛋白及RyR2 mRNA表达即较B,C两组增加,但差异无统计学意义(P>0.05);第3,6,10天A组RyR2蛋白及RyR2 mRNA表达较B,C两组均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：双黄连可有效治疗乌头碱中毒引起的心律失常,其机制可能与降低乌头碱引起的RyR2异常高表达有关。