猪Ia相关恒定链定位基元突变对其定位功能的影响

目的研究猪Ia相关恒定链(Ii)胞质区2个亮氨酸基元(Leu7/Ile8和Met16/Leu17)周围氨基酸对基元内膜系统定位功能的影响。方法通过大引物PCR定点突变法,将2个亮氨酸基元及其周围氨基酸分别突变并导入pEGFP-C1真核表达质粒,获得21个突变Ii重组质粒。经LipofectamineTM2000将突变Ii重组质粒分别转染COS-7细胞,荧光显微镜检测突变Ii在细胞内的定位。结果 Leu 7/Ile 8和Met 16/Leu 17独立调控Ii分子的细胞内化。当保留其中一个亮氨酸基元,突变另一个亮氨酸基元周围氨基酸时,GFP-Ii融合蛋白或定位于内膜系统或分布于整个细胞。结论猪Ii链含有2个亮氨酸定位基元,亮氨酸基元的定位功能需要周围特定位置的氨基酸的支持。     

恒定链辅助肿瘤免疫逃逸的研究进展

<正>恒定链(Invariant chain,Ii)属于Ⅱ型跨膜糖蛋白,在MHCⅡ类分子与抗原肽复合物的装配过程中发挥重要作用。在内质网中,Ii在calnexin辅助下形成三聚体,然后与MHCⅡ类分子的α和β链形成九聚体,占据Ⅱ类分子的抗原肽结合槽,阻止内源性抗原肽的结合,与MHCⅡ类分子聚合后将其靶向定位到内体中。此外,Ii还能与MHCⅠ类分子结合,辅助MHCⅠ类分子进行抗原的交叉呈递[1]。早在     

小鼠Ii分子的克隆表达及在COS-7细胞中的亚细胞定位

目的 获取BALB／c小鼠Ii链编码基因，构建真核表达载体并在真核细胞中表达。方法 RT-PCR获取BALB／c小鼠Ii链编码基因，插入pEGFP真核表达载体，脂质体转染COS-7细胞，荧光显微镜和激光共聚焦观察外源基因的表达。结果 外源基因在COS-7细胞中得到高效表达，激光共聚焦的结果显示，外源基因定位在细胞的内膜系统，并能够和I-A^d分子形成聚集体。结论 Ii链在真核细胞中表达后定位在细胞的内膜系统并能和I-Ad分子形成聚集体。     

含五聚结构域的重组人β2m-GFP蛋白的构建

本研究的目的是为得到表达人MHCⅠ类分子轻链蛋白β2m、β2m的C-末端与一段五聚体(penta)序列相连、且共价结合一段荧光索编码序列(GFP)的五聚重组人β2m-GFP蛋白.采用PCR扩增GFP基因及β2m基因片段,将其克隆到原核表达载体,并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达融合蛋白.提纯重组蛋白,并用SDS...     

CD1:第三类抗原递呈分子

CD1分子是不同于MHCⅠ类和Ⅱ类分子的第三类抗原递呈分子,它能将脂类抗原递呈给某些亚群的T细胞,这些受CD1分子限制的T细胞虽然数量不多,但却在T细胞发育、免疫调节、粘膜免疫以及自身免疫等过程中具有重要作用。     

鸡B-FA 分子中结合Ii 链功能片段特性的研究

目的:研究鸡Ii 链结合的B-FA 分子的功能片段及其特征。方法:将克隆的B-FA 基因片段( 1 2、s 1 2 和3TC)分别插入原核或真核表达质粒,然后分别转染或与Ii 共转染工程菌E.oli(BL-1)或293T 细胞,经过诱导表达、亲和层析纯化和SDS鄄PAGE 鉴定后,分别用Pull-own 法观察B-A 片段与Ii 结合与在细胞内的共定位特征。结果:首先,构建了3 个重组原核表达质粒和4 个重组真核表达质粒。原核表达的B-A 片段经亲和层析纯化可获得单一蛋白分子。其次,用Pull-down 从共转染工程菌表达的蛋白分子中分别检测到Ii/ B-A和Ii/ B-A ,而未能检测到Ii 与 TC 的结合物,而免疫印结果也表明该两片段是结合Ii 链形成复合物的功能片段。最后,在真核表达的293T 中,B-A 2 具有同B-A 相同的细胞定位特性。结论:鸡B-A 12 片段是结合Ii 的功能片段,并保持了B-A 的细胞定位的作用。本研究结果首次提供了B-A 分子与Ii 的互相作用的实验依据。     

树突状细胞交叉递呈外源抗原的机制研究进展

树突状细胞(DC)是目前已知功能最强的专职抗原递呈细胞。外源抗原在进入DC的内体后,常规情况下会进入经典的MHCⅡ递呈途径。而经一些受体介导内吞的抗原会从内体释放进入胞质,经免疫蛋白酶体降解成肽段进入MHCⅠ类分子递呈途径,或在内体中被降解成抗原肽后与MHCⅠ类分子结合,直接转运到DC表面,这一递呈途径被称为交叉递呈。外源抗原交叉递呈对有效激活细胞毒性T细胞从而引发抗肿瘤、抗病毒免疫反应有着重要意义。本文对参与交叉递呈的DC表面内吞受体、交叉递呈途径及机制方面的研究进展进行简要总结。     

两种基于恒定链活性片段载体在增强抗体分泌中作用的比较

目的:比较基于恒定链片段的两种载体的免疫效果和作用机理。方法:分别构建了含新城疫病毒抗原表位F306和Ii不同片段的三个嵌合体(Ii-key/F306、Ii-key/F306/ND(两个氨基酸残基)和用抗原表位取代Ii-CLIP的Ii/F306),经纯化后的融合蛋白免疫小鼠,并用ELISA检测其抗体效价。同时嵌合体与Mhc共转染COS7细胞,观察两者的细胞定位与结合。结果:Ii-key/F306免疫组比单独F306抗原肽免疫组的抗体效价提高2倍,Ii-key/F306/ND免疫组增至4倍,而Ii-F306免疫组只增强2.5倍。在与Mhc共转染的COS7细胞和免疫共沉淀中,Ii-key/F306和Ii-key/F306/ND既没有与MHCⅡ分子的膜共定位作用,也不能与后者结合;而Ii-F306却能与MHCⅡ分子在浆膜共定位,并与后者结合。结论:这些结果表明,嵌合体都具有增强免疫效果的作用,并提示Ii片段促进了抗原肽与MHCⅡ分子结合。     

多态性BoLA Ⅰ α1α2与恒定链结合及在真核细胞共定位

目的：探明牛主要组织相容性复合体（BoLA）Ⅰ类分子α链的多态性和结合恒定链（Ii）的结构域。方法：从3头淮北黄牛获得75条BoLAⅠα基因序列,应用分子生物学软件进行比对分析;克隆典型BoLAⅠα结构域和Ii基因插入原核表达质粒,诱导蛋白表达后进行纯化鉴定,用拉下法和免疫印迹检测BoLA Iα链与Ii结合的结构域。构建相应真核重组质粒,应用激光共聚焦显微镜观察其BoLAⅠα片段与Ii在细胞内共定位。结果：首先,所克隆的BoLAⅠα基因序列存在至少5种基因型,呈现高度多态性,分布于该分子的抗原肽结合区域（α1α2）和胞浆区。其次,构建的含BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2和BoLAⅠα3基因的原核重组质粒经诱导表达和蛋白纯化,其中,BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2具有结合Ii的活性功能。最后,在293T细胞内BoLAⅠα1α2α3和BoLAⅠα1α2与Ii共定位,而单一BoLAⅠα3却不能。结论：BoLAⅠα基因具有高度多态性,BoLAⅠα1α2是与Ii结合和胞内共定位的功能片段。     

sOVA-linker-β2m融合蛋白构建表位特异的靶结构

目的　构建融合基因sOVA linker β2m ,探讨通过内源性途径递呈的肽在细胞表面形成MHCⅠ类分子复合物的情况。方法　构建了真核表达载体pcDNA3/sOVA linker β2m及不含有 β2m基因的对照载体 ,以研究 β2m是否能在此过程中起到辅助的作用。结果　RT PCR与原位杂交结果显示在各转导细胞中均有融合基因的正确表达 ,且二者的表达水平差异无显著性 (P >0 .0 5 )。进一步对细胞内、细胞表面H 2Kb OVA复合物的分布进行分析 ,表明各转导细胞中均有正确的蛋白质分子翻译合成 ,并能表达在细胞表面 ,但融合有 β2m基因的EL4 /eb2m细胞的表达量远远高于没有融合 β2m基因的转导细胞EL4 /OVA。结论　β2m基因与特异性抗原肽的融合 ,易于形成稳定的MHCⅠ类分子复合物 ,提高抗原呈递效率。     

用抗受体抗体导向T细胞

<正> T细胞对特异性抗原的识别受自身MHC的约束,T杀伤细胞(CTL)主要识别Ⅰ类分子,T辅助细胞(T_H)识别Ⅱ类分子。T细胞对抗原及MHC的特异识别与其表面的α和β链组成的受体有关。此受体与T_3多肽(所有类型T细胞均相同)形成复合体。T细胞表面的T_4分子及T_8分子分别与Ⅱ类和Ⅰ类分子相连。     

β_2-微球蛋白能促进功能性肽类结合纯化可溶性Ⅰ类MHC分子

表达αβ受体的T 细胞识别抗原肽段时必须同时结合位于其他细胞表面膜上的Ⅰ或Ⅱ类MHC。为了阐明游离β_2-微球蛋白(β_2m)在形成有功能的Ⅰ类三聚体(肽类/Ⅰ类MHC/β_m)的作用,进行无细胞系统的实验,先将可溶性H-D~d 包被塑料板孔内,然后再加入肽类(p18—相当于HIV-1gp 160的     

恒河猴(Macaca mulatta)主要组织相容性复合体及其与SIV/SAIDS疾病进程关系的研究进展

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）是脊椎动物染色体上一组紧密连锁的基因群，人MHC位于6p21．3上，恒河猴MHC定位在6q24上。MHC可分为三大基因群，分别称为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。MHC编码的糖蛋白称MHC分子，典型的MHCI类分子几乎表达于所有类型的细胞，主要与内源性抗原肽结合并递呈给CD8^＋杀伤性T细胞，导致靶细胞死亡；MHCⅡ类分子主要表达于免疫系统细胞，能够结合外源抗原肽并呈递给CD4^＋辅助性T细胞。它们在针对病原生物的免疫应答中发挥着重要的作用。     

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.     

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.     

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.     

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.     

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.     

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.     

Rab4蛋白的细胞内定位及其活性改变对DC内源抗原递呈的影响

目的观察Rab4突变体在树突状细胞(DC)内的定位,研究其对DC内源抗原递呈的影响。方法构建Rab4突变体的慢病毒表达质粒,以DNA-磷酸钙共沉淀法制备慢病毒,病毒感染DC-OVA细胞并使用流式细胞术检测感染效率,激光共聚焦显微镜观察DC-OVA细胞中Rab4突变体的表达与定位,最后用识别MHC I类分子-OVA肽复合物的T细胞杂交瘤B3Z细胞检测DC-OVA细胞内源抗原递呈的变化。结果慢病毒可高效感染DC-OVA细胞,感染后Rab4突变体可在DC-OVA中稳定表达,主要分布在细胞膜周围的囊泡结构中。抗原递呈检测结果显示Rab4对DC内源性抗原递呈具有正相关性影响。结论成功观察到不同Rab4突变体在DC内的表达与分布,初步证实Rab4蛋白可通过其活性的改变参与调节DC的内源性抗原递呈。