p15INK4B基因转染联合亚砷酸对人食管鳞癌的协同抑制作用

目的探讨p15^INK4B（p15）基因转染与亚砷酸（As2O3）联合应用对人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖和凋亡的影响。方法脂质体介导将pcDNA3．1（＋）-p15转染EC109细胞，稳定筛选后加入2μmol／LAs2O3。PCR检测外源p15基因cDNA，Western印迹法检测转染细胞P15蛋白的表达。用MTT、集落形成实验和透射电镜检测p15基因转染联合As2O3对EC109细胞增殖和凋亡的影响，流式细胞仪检测EC109细胞周期分布和凋亡率。结果与二者单独应用相比，联合应用可明显抑制EC109细胞体外生长速度，集落形成率明显降低（P〈0．01），联合作用3d后发生更为明显的G1／S阻滞，G1期比例显著升高（P〈0．05），S期比例明显降低（P〈0．05），凋亡率明显升高（P〈0．01）。透射电镜发现二者联合应用诱导EC109发生更明显的细胞凋亡。结论p15基因转染与As2O3联合应用可以进一步增强对人食管鳞癌EC109细胞的抑制作用和诱导凋亡作用。     

p21WAF1基因对人食管鳞癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨p21WAF1( p21)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组.p21转染组:用脂质体Lipofectamine2000介导将pCDNA3.1(+)- p21质粒转染入EC109细胞; 空载体转染组:同样方法将pCDNA3.1(+)-neo质粒转染入EC109细胞; 未转染组:未转染的EC109细胞.应用RTPCR、Western blot分别检测p21基因mRNA、P21蛋白变化; 流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p21基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p21转染细胞中p21 mRNA和P21蛋白高表达; p21转染组EC109细胞生长速度低于空载体组和未转染组; 流式细胞仪观察到P21蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(63.120%±2.893% vs 41.380%±6.536%,42.173%±5.301%,均P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(18.923%±3.084%vs 22.573%±5.463%,26.867%±2.922%,均P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p21转染组发生细胞凋亡.结论:p21基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.     

p21WAF1基因对人胰腺癌细胞系BxPC-3增殖的抑制作用

目的: 探讨p21WAF1( p21)基因转染对人胰腺癌细胞系BxPC-3细胞增殖的影响.方法: 根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组, p21转染组、空载体转染组和未转染组. 应用RT-PCR和Western blot方法检测转染细胞的p21基因表达变化; 流式细胞仪分析细胞周期变化, 用MTT、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p21基因对BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响.结果: p21转染组细胞存在p21 mRNA高表达和P21蛋白高表达; p21转染组细胞生长速度低于对照空载体转染组和未转染组; 流式细胞仪观察到P21蛋白高表达使BxPC-3细胞发生G1/S阻滞, G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(59.887%±3.700% vs 47.443%±6.354%, 49.223%±2.226%, P<0.05), S期显著低于空载体组和未转染组(21.277%±2.080%v s 35.247%±3.966%, 36.013%±1.540%,P<0.01), 并出现亚G1峰(凋亡峰). 透射电镜亦发现p21转染组发生细胞凋亡.结论: p21基因转染可以抑制人胰腺癌细胞系BxPC-3细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.     

p16INK4α重表达对人食管癌细胞系EC109生长的抑制作用

目的探讨用腺病毒介导野生型的p16基因在食管癌细胞系表达,研究重表达野生型p16基因对食管癌细胞系EC109生长的抑制作用,为寻找食管癌致癌机制的研究及其基因治疗提供理论基础.方法用基因重组技术,将pcDNA3-p16中的野生型p16基因用Kpn I/BamH I进行双酶切,克隆入腺病毒表达载体pAdCMV中,将重组质粒pad-CMV-p16与腺病毒质粒JM17用Lipofectamime 2000共转染293细胞,产生重组腺病毒.用重组腺病毒感染人食管癌细胞系EC109,在感染后的不同时段,用免疫荧光、打点杂交方法检测p16基因在细胞中的表达用MTT法及流式细胞仪观察p16基因的表达对食管癌细胞株生长的影响.结果经酶切鉴定野生型p16基因克隆入腺病毒表达载体中,与JM17共转染293细胞后,可产生具有感染活性的重组腺病毒,用重组腺病毒感染食管癌细胞株EC109细胞后,可抑制食管癌细胞的生长,同对照组相比其最大抑制率可达52.7%.Multipcycle分析软件分析对细胞周期影响表明,处于G0～G1期的细胞为41%～63%感染后的细胞经Dot blot和Westernblot杂交证实,有外源的p16mRNA及蛋白的表达.结论重组腺病毒可将野生型p16基因导入人食管癌细胞系EC109中,野生型p16基因在p16基因功能缺失的细胞中重表达能抑制癌细胞恶性生长.p16基因功能缺失是食管癌致癌因素之一     

亚砷酸诱导人食管癌细胞株EC109细胞p15INK4B基因的表达

目的：研究亚砷酸(As_2O_3)对人食管癌EC109细胞株细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p15~(INK4B)(p15)基因表达的影响．方法：终浓度2μmol/L的As_2O_3加入食管癌EC109细胞系,采用甲基化特异PCR(MSP)检测食管癌EC109细胞系中p15基因甲基化,采用RT-PCR和Western blot方法检测As_2O_3处理前后p15的mRNA和蛋白质水平的表达情况．用Scion Image软件测量条带灰度值,P15蛋白与ACTB条带的灰度比进行半定量分析．结果：EC109细胞p15基因发生高甲基化,p15基因不表达．As_2O_3作用后p15基因甲基化程度明显下降,As_2O_3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(37．11±3．62,50．92±5．47,72．07±7．53 vs 97．23±9．80,P＜0．05)．As_2O_3作用24 h后出现p15 mRNA表达,随As_2O_3作用时间延p15 mRNA表达逐渐增强,各个时间组之间比较,除了未加药组和加药24 h组之间及加药24 h组和加药48 h组之间差异无统计学意义外,其余各个时间组之间差异有统计学意义(0．72±0．07 vs 0．58±0．06 vs 0．48±0．07 vs 0．41±0．08,P＜0．05)．As_2O_3作用24 h后P15蛋白出现表达,2μmol/L作用24-72 h中P15蛋白条带灰度逐渐增强,As_2O_3作用72,48,24 h组和未加药组之间差异均有统计学意义(0．51±0．02 vs 0．21±0．01 vs 0．16±0．02 vs 0．06±0．01,P＜0．05),说明其表达随As_2O_3作用时间延长而逐渐增强．结论：As_2O_3可使食管癌EC109细胞p15基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制细胞周期进程．     

p27kip1基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响

背景：p27kipl是一种抑癌基因，早期研究显示p27kipl基因转染能明显抑制胃癌、食管癌细胞生长．表明该基因疗法可能是治疗胃癌、食管癌的新途径，深入阐明p27kipl的抑癌机制，可为p27kipl基因治疗胃癌、食管癌提供可靠的理论基础。目的：研究p27kipl基因转染联合化疗对胃癌细胞生长的影响。方法：将p27kipl重组腺病毒（Ad-p27kipl）转染胃癌细胞SGC-7901，免疫细胞化学法检测p27kipl的表达。加入5-氟尿嘧啶（5-FU）和顺铂（DDP）后．甲基噻唑基四唑（MrIT）法测定细胞生长抑制率,^3H-胸腺嘧啶核苷（^3H-TdR）掺入试验测定DNA的合成。结果：Ad-p27kipl转染胃癌细胞后，p27kipl表达明显增强。加入5-FU和DDP后，细胞生长抑制率显著增高．^3H-TdR掺人量显著降低（P〈0．01）。结论：p27kipl基因转染联合化疗能明显抑制胃癌细胞的生长。     

食管鳞癌细胞系EC-109中缺氧诱导因子-1α的表达意义

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在食管鳞癌细胞系EC-109中的表达及其意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测HIF-1αmRNA和蛋白在常氧及缺氧状态下在食管鳞癌EC-109细胞中的表达.结果:HIF-1αmRNA在缺氧食管鳞癌EC-109细胞中过表达(P<0.05),在缺氧24h时HIF-1αmRNA表达最高,其后随时间延长表达下降;HIF-1α蛋白水平在缺氧食管鳞癌EC-109细胞中无明显上调(P>0.05).结论:低氧可诱导食管鳞癌EC-109细胞中HIF-1αmRNA的过度表达,缺氧状态下HIF-1α蛋白水平较常氧时无明显增加.     

TGF-β1反义寡核苷酸对食管鳞癌细胞EC9706增殖及凋亡的影响

目的:探讨转染TGF-β1反义寡核苷酸(TGFβ1-ASODN) 对食管鳞癌细胞EC9706 增殖及凋亡的影响. 方法:将化学合成的TGF-β1-ASODN 转染食管鳞癌细胞EC9706,采用RT-PCR 和流式细胞术检测转染效率;观察TGF-β1-ASODN 转染后细胞形态学的改变;采用MTT 和流式细胞术检测TGF-β1-ASODN 转染后对细胞增殖及凋亡的影响. 结果:转染TGF -β1-ASODN 可有效抑制EC9706 细胞中TGF-β1的活性,其mRNA 及蛋白的表达均明显低于转染前的水平(0.25 ±0.07 vs 0.43±0.09;35.35% vs 41.38%,均P<0.05);TGF-β1-ASODN 可明显促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,转染后细胞生长拥挤失去正常形态,细胞存活率高于转染前(109.4% vs 100.0%,P <0.05),G1期、S期细胞百分比低于转染前,G2期细胞百分比则高于转染前,细胞凋亡率低于转染前(62.9% vs 66.5%;21.3% vs 23.7%;14.8% vs 9.8%;0.69% vs 0.96%,均P<0.05). 结论:TGF -β1-ASODN 可高效特异地将TGF-β1基因沉默,并解除其抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡的作用.     

曲古菌素A对食管癌EC1细胞增殖和细胞周期的影响及其分子机制

目的:探讨不同浓度曲古菌素A对食管癌细胞系EC1 细胞增殖、细胞周期的影响及其对细胞周期调控基因p21 WAF1/CIP1 表达的影响. 方法:用0.3,0.5,1.0 μmol/L 的TSA 处理EC1 细胞,MTT 检测TSA 作用24 、48 h 对EC1 细胞的抑制作用,流式细胞仪检测0.3,0.5,1.0 μmol/L 的TSA 作用24 h 后EC1 细胞周期的改变,Western blot 法检测p21 WAF1/CIP1 变化. 结果:TSA 在0.5 μmol/L 以上时对EC1 细胞有抑制作用;0.3 μmol/L TSA 处理细胞后细胞周期与对照组相比,无明显变化;0.5 μmol/L TSA 处理EC1 细胞后,G0/G1期细胞较对照组明显增加,S 期细胞较对照组明显减少(74.56% ±1.34% vs 62.12%±0.52%;14.52%±1.81% vs 27.50%±0.66%,均P <0.05);0.5,1.0 μmol/L TSA 处理细胞后p21 WAF1/CIP1 表达明显增加(均P<0.05). 结论:一定浓度的TSA 对人食管癌细胞EC 具有的增殖抑制作用,引起EC1 细胞发生G0/G1 期阻滞,其部分机制与p21 WAF1/CIP1 上调有关.     

p16INK4/p15INK4B gene inactivation is a frequent event in malignant T-cell lines

Abstract: The cell cycle regulators p16^INK4 and p15^INK4B have been mapped to the minimal region of overlap for chromosome 9p21 deletions, observed in a number of malignancies, suggesting that they could be tumor suppressor genes (TSGs). In the case of pl6^INK4 this has been further substantiated by the finding of small intragenic mutations. In this study we have investigated the p16^INK4 and p15^INK4B genes in 16 malignant T-cell lines by means of Southern blot, PCR and sequence analysis. p16^INK4 allelic deletions occurred in 15 of 16 cell lines; 12 of which were homozygous and 3 hemizygous. In 1 cell line (DND 41) the remaining p16^INK4 allele carried a microdeletion of 29 bp of exon 2, supporting the concept that p16^INK4 is a target TSG for deletions on 9p21. Most p16^INK4 deletions also included the p15^INK4B gene. However, 4 of the cell lines deleted for p16^INK4 showed no evidence of p15^INK4B loss, indicating that p15^INK4B is not the target in these cell lines.     

HnRNP A2/B1及p21WAF1蛋白在非小细胞肺癌中表达及意义

目的探讨核内不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1）和p21WAF1蛋白在人非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达,并进行相关性分析。方法采用免疫组化S-P法检测53例NSCLC组织、40例癌旁组织、7例肺良性病变组织中hnRNPA2/B1和p21WAF1表达。结果 NSCLC组织中hnRNP A2/B1和p21WAF12种蛋白的阳性表达率分别为66.0%和45.2%,显著高于癌旁肺组织和肺良性病变肺组织,差异有统计学意义（P〈0.05）。它们均与分化程度、淋巴结转移有关（P〈0.05）,与组织类型、临床分期无关（P〉0.05）。两种蛋白在NSCLC表达呈显著负相关（P=0.001）。结论 hnRNP A2/B1可能通过下调p21WAF1的表达而缩短细胞周期,促进NSCLC的癌细胞增殖。     

Expression and prognostic relevance of p21WAF1 in stage III esophageal squamous cell carcinoma

The prognostic effect of p21^WAF1 expression on esophageal squamous cell carcinoma patients is controversial. Further clarifying the effect of this protein is beneficial for optimizing the patient outcomes. In the current study, we investigated the expression of p21^WAF1 protein in 189 specimens of stage III ESCC by immunohistochemistry. As shown by the Kaplan–Meier curve, the overall survival rate of the positive‐expression group was significantly higher than that of the negative‐expression group (P < 0.05). No significant correlation was observed between p21^WAF1 expression and clinicopathological parameters in terms of gender, age, tumor location, tumor grade, pathological stage, and number of regional lymph node metastases (P > 0.05). We concluded that p21^WAF1 played an intricate role in the tumorigenesis and development of ESCC. p21^WAF1 could serve as a positive prognostic predictor for stage III ESCC patients.     

结直肠癌中CDX2、p21~(H-ras)、p21~(WAF1)表达的临床意义

背景:CDX2与肠源性肿瘤的发生密切相关,而p21表达减低或缺失可能是结直肠癌发生、发展中的一个普遍事件。目的:探讨结直肠癌中CDX2、p21~(H-ras)、p21~(WAF1)表达的相关性和临床病理意义。方法:收集45例临床病理资料完整的结直肠癌手术切除标本,以免疫组化方法检测癌组织和相应癌旁组织中的CDX2、p21~(H-ras)、p21~(WAF1)蛋白表达。结果:结直肠癌组织中CDX2、p21~(H-ras)、p21~(WAF1)阳性率分别为86.7%、68.9%和35.6%,相应癌旁组织中阳性率分别为100.0%、37.8%和51.1%,CDX2和p21~(H-ras)在癌组织和癌旁组织中的阳性率差异有统计学意义(P=0.026和P=0.006);半定量分析结果显示CDX2和p21~(WAF1)在癌组织和癌旁组织中的表达水平差异有统计学意义(P=0.007和P=0.005)。癌组织中CDX2与p21~(H-ras)的表达存在相关性(r_s=0.501,P=0.000)。Dukes A、B期患者癌组织p21~(WAF1)阳性率显著高于C、D期患者(P=0.016),有淋巴结转移者p21~(WAF1)阳性率显著低于无淋巴结转移者(P=0.048),CDX2、p21~(H-ras)的表达与结直肠癌各临床病理特征均无相关性。结论:CDX2、p21~(H-ras)、p21~(WAF1)表达改变可能与结直肠癌的发生、发展相关。