成年猪和大鼠胰岛分离纯化的实验研究

目的 选择最佳猪、鼠胰岛的制备方法。方法 采用不贩 胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 选出了制备适合猪、鼠胰岛的最佳方法。结论 由于猪、鼠胰腺结构的不同，制备胰岛细胞应采取不同的消化及纯化方法。     

成人胰岛的分离及纯化

本文作者运用自动分离方法，测定了６例健康成人非正常死亡胰岛数目，为以后的胰岛细胞培养及移植奠定基础。本研究发现成人胰腺通过胶原酶适当处理后，获得的胰岛数目多，经过Ｆｉｃｏｌｌ纯化后，胰岛纯度高，且其形态，功能保持完整，这为胰岛细胞移植提供了丰富的细胞来源。     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

连续和不连续密度梯度法纯化人胰岛的效果比较

目的 使用COBE 2991细胞处理器比较连续和不连续密度梯度纯化法纯化人胰岛的效果.方法 胰腺消化产物使用COBE 2991细胞处理器分别采用不连续和连续密度梯度法进行离心纯化,并对纯化后得到的胰岛取样检测其数量、纯度.换算为胰岛当量(IEQ),计算胰岛回收率,比较两种纯化方法的效果.结果 连续密度梯度纯化法得到的胰岛产量(55 000 IEQ vs 206 000 IEQ,P=0.000)、纯度(58.0%±8.O% vs 33.5%±10.3%,P=0.000)优于不连续密度梯度纯化法,胰岛活性没有明显差异.结论 连续密度梯度法纯化效果优于不连续密度梯度法.     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

0　引言　目前临床胰岛移植的效果仍不理想 ,提供理想的胰岛或胰岛细胞是发展胰岛移植的基础 .长期以来收获高纯度和高活力的胰岛或胰岛细胞是人们研究的目标 .本文采用胶原酶分次消化与葡聚糖间断密度梯度离心法来探讨大鼠胰腺胰岛的分离与纯化 .1　材料和方法1.1　胰岛分离　 SD大鼠 ,共 10只 ,不分雌雄 ,体质量 16 0～2 0 0 g.颈椎脱位法处死后 ,在无菌状态下迅速取出胰腺 ,置于4℃ Hanks液中 ,去除胰腺周围的结缔组织 ,冲洗后剪成 1mm3的碎块 ,加入 3m L预温的 1g· L- 1 的胶原酶 (IV型 ,Sigma)消化液中 ,置 38℃水浴箱中 10 min,…     

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

目的：采用不同的分离或消化方法，探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。方法：将25只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为5组；（1）A组：胆总管灌注胶原酶P；（2）B组：胆总管灌注Hanks液；（3）C组：胆总管不灌注液体；A，B，C＜3组胰腺直接分次消化；（4）D组：胆总管不灌注，胰腺剪碎后分次消化；（5）对照组：胆总管灌注胶原酶P，胰腺直接单次消化，将分离的且经岛沉淀物用Ficoll-400纯化并培养，再把胰细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。结果：纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组，而D组最低；A，B和D3组的纯度均高于对照组或C组；在胰岛成活率方面，A，B，C3组均高于对照组或D组，移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。结论：经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获,纯度和活性。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅺ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％—１６％—１４％—９％梯度所获得胰岛的纯度＞９０％。胰岛移植于糖尿病小鼠可使其血糖从移植前的（２６．７０±２．５３）ｍｍｏｌ／Ｌ降低至（１３．９８±３．９２）ｍｍｏｌ／Ｌ，维持２～３ｄ。结论：所改进的制备方法可获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

大鼠胰岛分离纯化和功能分析的研究

目的:探讨大鼠胰岛分离纯化的方案.方法:采用胰管内灌注胶原酶V消化、Histopaque-1077密度梯度离心分离纯化20只雄性SD大鼠胰岛.椎虫蓝染色判断胰岛存活率,双硫腙染色后计数胰岛,葡萄糖刺激胰岛素释放实验评估胰岛功能,同种异体胰岛门静脉移植治疗5只链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠,监测血糖变化.结果:分离纯化后平均胰岛得率为(646±67)个/大鼠,存活率达到90%以上.新鲜分离的胰岛呈椭圆或圆形,悬浮于培养液面,胞膜光滑完整,直径大于150μm的细胞团占95%以上.葡萄糖刺激的胰岛素释放试验结果表明:第1、3、5天胰岛的刺激指数分别为2.6倍、1.7倍和1.4倍,两组间低糖和高糖的胰岛分泌量差异均有显著性(P＜0.05).胰岛门静脉移植术后,第2天大鼠血糖降至11.1 mmol/L,8天内血糖可控制在15 mmol/L以下,随后血糖逐步升高.结论:采用胰管内灌注胶原酶V消化联合Histopaque-1077分离纯化是一种较好的大鼠胰岛分离方法,胰岛得率较高且功能良好.     

小鼠胰岛α细胞的缺失对移植胰岛功能的影响

目的　探讨胰岛α细胞的丢失对胰岛素分泌功能的影响。方法　在人胰岛分离过程中 ,经胶原酶的过度消化造成胰岛周边α细胞缺失 ,用免疫组化及胰岛素 /胰高糖素含量分析予以证实。在体外 ,检测葡萄糖刺激引起的实验性糖尿病小鼠胰岛素的分泌 ;在体内 ,评价胰岛移植后对糖尿病小鼠血糖的调节 ,并研究胰高糖素对α细胞缺失胰岛功能的影响。结果　胶原酶的过度消化引起胰岛周边的α细胞丢失 ,使分离胰岛内胰岛素 /胰高糖素比值明显升高。与正常胰岛相比 ,α细胞缺失胰岛对葡萄糖刺激产生的胰岛素明显降低 ,胰岛素释放在正常胰岛和α细胞缺失胰岛分别为2 2 2 7uU/ml± 32 1uU/ml和 12 4 6uU/ml± 12 6uU/ml(P <0 0 1)。在体内 ,移植α细胞缺失的胰岛到糖尿病的C5 7/BL小鼠后不能有效地纠正动物的高血糖 ,胰岛移植后的平均血糖浓度在正常胰岛组和α细胞缺失胰岛组分别为 :8 9mmol/L± 1 98mmol/L和 2 1 3mmol/L± 2 2mmol/L(P <0 0 1) ,而给予外源性的胰高糖素可以在体外及体内明显改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。结论　胰岛α细胞的缺失明显降低胰岛的胰岛素分泌功能 ,用外源性的胰高糖素可以改善α细胞缺失胰岛的胰岛素分泌功能。     

供体凋亡细胞输注对大鼠胰岛移植物功能的影响

目的 研究供体凋亡细胞预输注对大鼠胰岛移植后胰岛移植物功能的影响.方法 应用STZ制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡.经阴茎背静脉输注供体凋亡脾细胞,7d后于糖尿病SD大鼠双侧肾包囊进行同种异体胰岛移植,通过测定血糖变化、血清胰岛素水平以及胰岛移植物存活时间来观察胰岛移植物的功能状态.结果 预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位生存时间达31 d),并较长时间地维持受体鼠血清胰岛素处于较高水平.结论供体凋亡细胞预输注能够显著延长同种异体胰岛移植物的存活时间,能够较长时间维持胰岛移植物的正常功能状态.     

人胎胰岛细胞的分离培养及其意义

目的 初步探索人胎胰岛细胞的分离培养方法,以期深入研究胰岛细胞的凋亡机制及开展人胰岛细胞移植。方法 采用机械分离、体外胶原酶消化,并通过组织块联合培养、转皿、时间消化差法获取人胎胰岛细胞,观察胰岛细胞生长及开展人胰岛素释放情况。结果 双硫腙（Dithizone）染色显示胰岛纯度约80％～90％,细胞培养至7～9d为其对数生长期,培养至11d可测到胰岛素释放高峰,培养至15d仍具有一定的生物活性。结论 机械分离消化、转皿、时间消化差法可获得生物活性较好的胰岛细胞,为深入探讨胰岛细胞凋亡、胰岛细胞移植提供细胞基础。     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.     

胰腺干细胞与胰岛混合培养对其转化率的影响

目的  研究胰腺干细胞与胰岛混合培养对增加胎鼠胰腺干细胞向β前体细胞转化率的作用及机制。 方法  实验分为胰腺导管干细胞单独培养组（Ⅰ组）,胰岛单独培养组（Ⅱ组）及干细胞-胰岛混合培养组（Ⅲ组）。V型胶原酶消化大鼠胰腺获得胰岛后,使用Ficoll-400梯度离心法纯化胰岛;采用胶原酶消化法获得胎鼠胰腺干细胞进行培养,通过RT-PCR及免疫组织化学染色的方法,检测细胞角蛋白-19（CK 19）、巢蛋白（Nestin）、胰高血糖素和胰岛素等干细胞相关标志物。干细胞诱导培养基中加入纯化的胰岛进行混合培养,通过观察干细胞表达胰岛素的阳性率评价其诱导转化率。结果  V型胶原酶逆行胰管灌注继而Ficoll 400梯度离心可获得生物活性良好的胰岛;所培养的干细胞表达CK-19、Nestin、胰高血糖素,诱导后部分表达胰岛素。干细胞-胰岛混合培养组及干细胞单独培养组诱导后,细胞胰岛素阳性率分别为38.2%和23.9%,差异有统计学意义(P<0.05);CK-19阳性率分别为89.3%和81.6%,其差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论  胰腺导管干细胞与胰岛混合培养可提高胰腺导管干细胞向β前体细胞的转化率,其作用与CK-19的表达密切相关。     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的优化胰岛细胞分离纯化的方法,提高胰岛产量、纯度和功能。方法本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化分离成年大鼠胰岛,葡聚糖离心纯化,获得胰岛细胞,进行记数和功能鉴定。结果纯化后胰岛收获量为7021±861IEQ/胰腺(IEQ=胰岛当量,一个胰岛当量为一个150μm直径的胰岛),纯度达86%;胰岛形态结构完整,胰岛素释放试验显示胰岛细胞功能良好。结论细节优化可以显著提高胶原酶消化、葡聚糖不连续梯度离心分离胰岛的效率。     

初诊2型糖尿病患者采用短期胰岛素泵强化治疗对其胰岛功能及其氧化应激的影响

目的:探讨短期胰岛素泵强化治疗对初诊2型糖尿病患者胰岛功能及其氧化应激的影响。方法:将63例初诊2型糖尿病患者分为观察组和对照组,观察组患者应用胰岛素泵强化治疗,对照组患者选择常规皮下注射法。检查并比较两组患者治疗前后一般血清指标,胰岛细胞功能及氧化应激指标。结果:治疗后,观察组患者FPG、2hPPG、HbA1c及FCP水平改善明显优于对照组(P<0.05)。观察组患者AUG、HomaB及I30/G30水平显著升高,HomaIR水平显著降低,其改善明显优于对照组(P<0.05)。观察组患者MDA水平均显著降低,SOD水平均显著升高,其改善明显优于对照组(P<0.05)。结论:短期胰岛素泵强化治疗可以明显改善患者各项指标,改善胰岛功能,降低氧化应激水平。     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。