不同转移潜能的人胰腺癌JF305单克隆细胞亚系的建立

为研究胰腺癌的转移机理,在我校原建立的人胰腺癌ＪＥ３０５细胞系基础上,利用细胞克隆,细胞电泳,流式细胞依及人癌小鼠原位移植技术,建立了具有不同转移潜能的人胰腺癌ＪＦ３０５单克隆细胞亚系和具有不同转移潜能的人朱癌单克隆细胞亚系裸小鼠原位移植模型。结果表明该单克隆细胞亚系及其肿瘤移植模型的建立,为探讨胰腺癌转移机理提供了较理想的研究方法。     

不同转移潜能肝癌细胞株中自体吞噬样细胞死亡的研究

目的 探讨不同转移潜能肝癌细胞株中自噬样细胞死亡的差异。方法 观察不同转移潜能的肝癌细胞株在氨基酸缺乏情况下细胞活力变化，caspases的活化，细胞内自噬体的形成。Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果 经无氨基酸培养液EBSS处理后48h，HCCLM3、MHCC97L及SMMC-7721细胞存活率分别为78.95±3.8%、57.25±13.1%及3.4%±3.0%（F= 68.93，P〈0.01）。加入正常培养液，HCCLM3及MHCC97L细胞可以获得再增殖的能力。EBSS处理后3种细胞株中caspases并没有明显活化，6h后自噬体在SMMC-7721细胞中明显增多，分别为13.1%±3.5%、20.0%±1.1%及48.9%±4.5%（F=98.13，P〈0.01）。Western blot显示在EBSS处理后早期即有LC3-Ⅱ蛋白的明显表达。结论 氨基酸缺乏可以诱导肝癌细胞自噬样细胞死亡，高转移潜能肝癌细胞株相对比较耐受。     

不同转移潜能的人胰腺癌

为研究胰腺癌的转移机理,在我校原建立的人胰腺癌     

骨桥蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系及肝癌组织中表达意义

目的 研究不同转移潜能人肝癌细胞系及其肝癌组织中骨桥蛋白(OPN)表达情况,分析OPN表达与肝癌细胞侵袭转移潜能、肝癌术后复发转移的关系.方法 应用细胞免疫组化、半定量RT-PCR、Western Blot和ELISA检测不同转移潜能人肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC97-L和HCCLM6 OPN表达情况.应用组织芯片、免疫组化检测200例肝癌组织中OPN表达.结果 OPN表达水平随着肝癌细胞侵袭转移潜能增加逐渐升高.肝癌组织中OPN表达与病人性别、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小、有无包膜、细胞分化以及肝门淋巴结转移无明显相关性.而与肝癌TNM分期、门静脉癌栓和术后复发转移发生有明显相关(P<0.05).术后有复发转移病人的肝癌组织中66%表达OPN,而术后无复发转移病人的肝癌组织中仅37%表达OPN,两者比较差异具有显著性(P<0.05).结论 OPN表达与肝癌细胞细胞系侵袭转移潜能密切相关.肝癌组织中OPN表达可能是预测肝癌术后是否发生复发转移指标.     

高转移潜能肝癌细胞株中凋亡相关蛋白的表达及意义

目的 探讨肝癌细胞转移潜能与凋亡敏感性之间的关系.方法 观察不同转移潜能的肝癌细胞株在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及依托泊苷(Etoposide)的作用下的凋亡发生率及Caspase3的活化,Western blot检测bcl-2及IAP家族蛋白在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达.结果 TNF-α(10μg/L)作用后48 h,高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3及转移能力最弱的肝癌细胞株SMMC-7721的凋亡率分别为(91.3±6.5)%及(58.8±2.3)%,MHCC97L细胞的凋亡率则位于两者之间(P≤0.01).Etoposide(250 μmol/L)作用后48 h,HCCLM3、MHCC97L及SMMC-772的凋亡发生率分别为(27.0±4.0)%、(34.6±3.8)%及(84.5±1.1)%(P≤0.01).3种细胞株中Caspase3的活性也有明显差异.bcl-2及IAP家族蛋白表达研究中发现XIAP的表达与肝癌细胞的转移潜能成梯度相关.结论 高转移潜能肝癌细胞株耐受多种凋亡刺激,可能与XIAP的过度表达相关.     

肝癌复发转移的研究

目的：通过实验和临床研究为肝部根治性切除后复发转移提供预测指标和预防方法,方法：用组织块肝原位移植建立高转移人肝癌裸鼠模型,用该模型建立高转移潜能人肝癌细胞系,用分子生物学方法研究肝部侵袭性有关变化,并由此设计实验性干预治疗,开展预防复发转移的临床实验。结果：（1）建成在肺、肝和淋巴结高转移的人肝癌裸鼠模型LCI－D20,建成高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97。（2）初步摸清与肝癌侵袭性呈正、负相关的分子水平变化。（3）发现染色体8p缺失与肝癌转移有关。（4）验血提示血栓调节蛋白与肝内播散呈负相关,细胞间粘附分子－1、纤溶酶原激活物受体的抑制剂（PAI－1）和血内皮生长因子（VEGF）水平与肝癌侵袭转移呈正相关。（5）用LCI－D20模型,证实TNP470、苏拉明、反义VEGF、突变型flk-1相基因转染、羧基胺基咪唑,Endostain、干扰素α等抗血管生成剂有抑制肝癌生长和转移作用。反义H-ras、BB94或肝素也有类似作用。（6）根治性切除后经动脉化学药物治疗（化疗）,化学药物栓塞合并干扰素或LAK细胞治疗使3年复发率有所降低。结论：肝癌侵袭性相关的分子水平变化与其他实体瘤相仿,小肝癌的生物学特性比大肝癌略好, 这些研究为复发转移的预测和预防提供了有潜在意义的线索。     

骨桥蛋白促进人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤转移相关基因改变的研究

目的研究骨桥蛋白(OPN)促进肝癌转移的可能机制。方法经质粒转染、G418筛选获得稳定高表达OPN人肝癌细胞株SMMC-7721,以空质粒转染组为对照。比较两组细胞的肿瘤转移相关基因表达差异。选取其中3个肿瘤转移相关基因(MMP-2、MMP-9、uPA),用ELISA方法检测其细胞培养上清液的蛋白表达情况。结果经肿瘤转移基因芯片比较发现SMMC-7721高表达OPN后,有88个肿瘤转移相关基因表达上调,有6个肿瘤转移相关基因表达下调。高表达OPN SMMC- 7721上清液MMP-2、uPA水平明显高于对照组[(46．11±3．12)vs(19．66±3．69)μg/L,(5．36±0．94)vs(1．39±0．64)μg/L,而MMP-9表达水平差异无统计学意义[(7．97±2．42)vs(7．25±2．14)μg/L,]与基因芯片结果符合。结论在SMMC-7721肝癌细胞株中OPN高表达引起多个肿瘤转移相关基因改变。OPN可能通过上调MMP-2、uPA等基因表达促进肝癌转移。     

高/低转移人肝癌细胞株MHCC97-H/L中侧群细胞分析

目的观察高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L是否存在侧群（SP）细胞并鉴定其致瘤性。方法MHCC97-H／L予Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染色；流式细胞分选MHCC97．H／L中SP细胞，分选后细胞皮下接种非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，观察成瘤情况。结果Hoechst33342和CFSE染色结果显示，MHCC97-H／L中未染色细胞分别为（4．02±0．02）％／（1．02±0．01）％，流式细胞分选结果示MHCC97-H／L中sP细胞为（4．88±0．66）％／（0．88±0．36）％，比例差异有统计学意义（P〈0．05）。体内成瘤实验显示，SP细胞只需1×10。个即可在NOD／SCID小鼠皮下成瘤（5／6），而1×10^6个非SP细胞均未成瘤（0／6）。结论高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L中均存在SP细胞亚群，但前者比例显著高于后者。肝癌SP细胞具有极高的致瘤性，并可能和肝癌转移潜能相关。     

血小板对不同转移潜能人肝癌细胞株与细胞外基质蛋白粘附的影响

目的 探讨血小板在肝癌转移中的作用、地位及可能机制。方法 采用体外细胞粘附及粘附抑制实验，分别比较血小板对高、低转移潜能人肝癌细胞株MHCC97、SMMC7721与细胞外基质（ECM）蛋白粘附的影响，研究血小板粘附分子在其中的作用。结果 血小板活化与否不改变SMMC7721、MHCC97细胞与ECM的粘附；血小板不影响SMMC7721细胞与ECM的粘附，但可明显增强MHCC97细胞与ECM的粘会（P＜0．01）；血小板粘附分子P－selectin和GPⅡb-Ⅲa在活化血小板对SMMC7721细胞与ECM粘附的增强作用（P＜0．05，P＜0．01）。而SMMC7721细胞与ECM或血小板包被的ECM的粘附能力均明显低于MHCC97细胞（P＜0．05，P＜0．01）；P-selectin单抗、GPⅢa单抗作用于活化血小板包被的ECM后，其与SMMC7721细胞的粘附仍低于其与MHCC97细胞的粘附（P＜0．05），而GPⅡb单抗作用后，二者间粘附无明显差异（P＞0．05）。结论 血小板可明显增强MHCC97细胞与ECM的粘附；活化血小板包被的ECM与MHCC97细胞的粘附增强作用可能由血小板P－selectin、GPⅡb-Ⅲa所介导。     

利用噬菌体肽库筛选高转移潜能人肝癌细胞结合肽

目的筛选高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽。方法以高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3作为靶细胞，低转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L为吸附细胞对噬菌体随机7肽库进行差减筛选，采用噬菌体结合实验和抗噬菌体免疫细胞化学染色对阳性克隆的特异性进行鉴定。结果经3轮筛选，随机挑选48个噬菌体克隆进行DNA序列分析，展示AWYPLPP肽的噬菌体被高度富集77％（37／48）；噬菌体结合实验显示，与低转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L、PLC／PRE／5和无转移潜能入肝癌细胞系Hep3B以及正常入肝细胞系CCLl3相比，AWYPLPP噬菌体特异性与高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97结合（P〈0．01）；抗噬菌体免疫细胞化学染色证实AWYPLPP噬菌体特异性靶向高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97。结论从噬菌体肽库中获得与高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽，可作为肝癌转移复发靶向治疗研究的载体。     

高低不同转移特性骨肉瘤亚克隆细胞系的分离与鉴定

目的　建立高低不同转移特性人成骨肉瘤MG 63亚克隆细胞系 ,为研究成骨肉瘤转移机制提供较好的实验模型。方法　通过体外培养和裸鼠体内移植 ,初步分离并建立了 2个亚克隆细胞系A1和A2 ,并利用细胞电泳、细胞增殖、琼脂克隆形成、体外侵袭实验、裸鼠体内异位和原位移植对两者的生物学特性进行比较、分析和鉴定。结果　A1和A2的电泳率、琼脂克隆形成能力、体外侵袭能力、自发性肺转移率分别为 (1.0 8± 0 .12 ) μm ,(0 .64± 0 .13 ) μm ;2 1.0± 2 .3 ,9.5±2 .9;186.0± 16.7,84.0± 12 .6;10 0 .0 0 % ,6.67% ,A1均明显高于A2 ,两者的差异有统计学意义(P <0 .0 1)。结论　高低不同转移特性的人成骨肉瘤MG 63亚克隆细胞系的建立 ,能为成骨肉瘤转移机制的研究提供较理想的实验模型。     

肺组织粗提物促进人原发性肝癌细胞移动侵袭的研究

目的　探讨宿主微环境与原发性肝癌器官特异性转移的关系。方法　利用Boyden小室侵袭实验 ,分别比较从 5只C5 7BL/6小鼠提取肺 ,肝 ,脾 ,肾组织粗提物诱导高低转移潜能的人原发性肝癌细胞株MHCC97 H、MHCC97 L移动和侵袭能力。结果　肺、肝、脾、肾组织粗提物诱导高转移细胞株MHCC97 H细胞移动侵袭的细胞数分别是 ( 18.0± 0 .9)个、( 1.7± 0 .3)个、( 1.1± 0 .3)个、( 8.6± 0 .6 )个。与肝、脾、肾组织粗提物相比 ,肺组织粗提物具有显著诱导高转移潜能的人原发性肝癌细胞株MHCC97 H移动侵袭能力 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 0 1)。肺组织粗提物诱导人肝癌细胞株MHCC97 H、MHCC97 L移动和侵袭的细胞数分别为 ( 18.0± 0 .9)个、( 6 .0± 0 .9)个 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 0 1)。结论　肺组织粗提物中存在某种可溶性因子促进人原发性肝癌细胞的移动侵袭能力 ,宿主微环境影响原发性肝癌器官特异性转移。     

全反式维甲酸对人肝癌高转移细胞株MHCC97-H表达基质金属蛋白酶的影响

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对人肝癌高转移细胞株MHCC97-H表达基质金属蛋白酶(MMPs)的影响。方法 应用明胶酶谱法检测ATRA对体外培养MHCC97-H细胞分泌MMPs酶谱的影响；细胞免疫荧光法检测ATRA对MHCC97-H细胞表达MMP-9的影响；利用侵袭小室模型，检测ATRA对MHCC97-H细胞体外侵袭能力的影响。结果 MHCC97-H在体外培养时可分泌大量的MMPs，其中以MMP-9和其活性形式为主。ATRA在体外可显著地抑制MHCC97-H细胞MMPs的表达，降低肿瘤细胞穿透人工重组基底膜的能力，且在一定的浓度范围内，抑制作用与药物浓度呈正相关。结论 抑制肿瘤细胞分泌MMPs的能力，是ATRA抗肿瘤侵袭转移的主要作用机理之一。     

绿色荧光高/低转移人肝癌细胞株MHCC97-HG/LG的建立及鉴定

目的建立稳定自发绿色荧光的高、低转移人肝癌细胞株并明确鉴定。方法脂质体转染法将绿色荧光蛋白(GFP)基因分别转染至高、低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L内,经 G418反复筛选并单克隆化,得到两株新细胞株MHCC97-HG／LG,对新细胞株GFP表达稳定性、生物学特性、体内外侵袭转移能力及肿瘤血管生成等进行鉴定。结果 MHCC97-HG／LG在体外培养或裸鼠体内接种36 d后均能稳定表达绿色荧光。MHCC97-HG肝、肺转移率均为100％,较 MHCC97-LG及其父系体内外侵袭转移能力显著增强(P<0．01),其原位肿瘤微血管密度较 MHCC97-LG显著增加[(121．0±15．9)／HP vs(87．0±14．2)／HP,P<0．01]。体视荧光显微镜可实时观察裸鼠体内MHCC97-HG／LG种植瘤生长、转移及血管形成情况。结论 MHCC97-HG／LG及其动物模型在肝癌转移机制、肿瘤血管生成等诸多研究领域可能有较广阔的应用前景。     

舒尼替尼治疗转移性非透明细胞肾癌的疗效观察

目的 初步探讨舒尼替尼治疗转移性非透明细胞肾癌的疗效.方法 非透明细胞肾癌22例.男14例,女8例.年龄29～76岁,中位年龄46岁.根治性肾切除术后出现转移14例,初诊时诊断为肾癌伴转移行减瘤性肾切除术8例.病理证实乳头状癌12例,嫌色细胞癌1例,集合管癌3例,未分类癌6例.转移部位包括肺、淋巴结、肾上腺,骨和肝脏.舒尼替尼50mg/d,口服,每天1次,治疗4周休息2周.治疗时间4.5 ～24.0个月,中位时间11个月.随访4.5 ～25.0个月,中位时间14个月.结果 22例疾病控制率为73％ (16/22).部分缓解4例(18％),其中乳头状癌3例,嫌色细胞癌1例,转移灶位于肺或肺加腹膜后淋巴结,或腹膜后淋巴结.疾病稳定＞3个月12例(55％),用药3个疗程内疾病进展6例(27％).结论 舒尼替尼治疗转移性肾乳头状癌、嫌色细胞癌、集合管癌、未分类癌有效,对淋巴结转移及肺转移者的疗效相对较好.