3种胃癌细胞株中GSTP1基因表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的研究候选基因GSTP1在胃癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨胃癌细胞株GSTP1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot技术分别检测GSTP1在人胃癌细胞株MGC803、BGC823和SGC7901中的mRNA和蛋白表达水平。甲基化特异性PCR(MSP)法检测启动子区域甲基化状态。分别用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂胞苷处理GSTP1基因启动子区高甲基化状态细胞后,再检测GSTP1基因蛋白表达水平。结果人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中GSTP1 mRNA和蛋白呈阳性表达,MGC803中mRNA和蛋白呈阴性表达;BGC823和SGC7901细胞GSTP1基因启动子区域未发生甲基化,而MGC803细胞启动子区呈高甲基化状态;经5-氮杂胞苷药物干预后,MGC803细胞的GSTP1蛋白表达明显增强。结论胃癌MGC803细胞株中GSTP1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。     

Src在胃癌腹腔转移多细胞团簇抗失巢凋亡中的作用

目的 探讨Src蛋白对体外三维培养的胃癌多细胞团簇(multicellular aggregates,MCAs)增殖及凋亡的影响.方法 体外三维培养人胃腺癌细胞BGC823和MKN45成MCAs,Western blot检测MCAs和单层贴壁培养的胃癌细胞中Src蛋白表达情况.siRNA法干扰Src表达,转染胃癌细胞后检测其对胃癌细胞BGC823和MKN45 MCAs形态学的影响.分别采用CCK-8和流式细胞术检测干扰Src表达对胃癌BGC823和MKN45 MCAs细胞活力和细胞凋亡率的影响.结果 利用BGC823和MKN5成功建立胃癌MCAs体外三维培养模型,Westem blot检测结果表明,与对照组比较,MCAs中Src的表达水平明显高于单层贴壁培养的胃癌细胞[BGC823:(0.615 ±0.068)vs(0.219 ±0.017),P＜0.01;MKN45:(0.657 ±0.087) vs (0.420 ±0.015),P＜0.05].干扰胃癌细胞BGC823和MKN45 Src表达,可以显著降低MCAs形成能力,并明显影响MCAs活力.流式细胞术检测结果表明,干扰Src表达可以显著诱导MCAs发生凋亡[BGC823:(9.456±0.209)vs(3.026±0.201),P＜0.01;MKN45:(9.356 ±0.416) vs(2.541 ±0.251),P＜0.05].结论 Src是胃癌MCAs抗失巢凋亡的关键分子,抑制Src表达可以显著抑制胃癌BGC823 MCAs和MKN45 MCAs形成,影响胃癌MCAs增殖,并诱导胃癌MCAs凋亡.     

SP-141抑制胃癌细胞增殖、迁移并促进凋亡

目的：探讨MDM2的新型小分子抑制剂SP-141对胃癌细胞株MGC803和BGC823增殖、凋亡以及迁移的影响。方法：胃癌细胞经SP-141处理后,采用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、Hoechst染色法和划痕实验分别检测细胞存活率、细胞增殖、周期分布、凋亡以及迁移能力改变。Western blot检测相关分子蛋白质表达水平。结果：TCGA数据库中32对胃癌组织中的MDM2 mRNA表达水平高于癌旁组织（P<0.01）;5种胃癌细胞株均检出MDM2,表达水平差异不大;SP-141抑制MGC803和BGC823的细胞存活率以及克隆形成,诱导其细胞周期阻滞在G2/M期;SP-141增加细胞凋亡发生率,并下调Bcl-2同时上调Bax、Caspase-3剪切体、PARP剪切体的蛋白表达;SP-141抑制细胞迁移并伴有FAK蛋白表达量的下降。结论：MDM2的新型小分子抑制剂SP-141可有效抑制胃癌细胞增殖、迁移并促进细胞凋亡。     

DADS下调Cathepsin D抑制人胃癌MGC803细胞侵袭转移

目的研究二烯丙基二硫（ DADS ）是否通过下调组织蛋白酶D （ Cathepsin D ）的表达抑制人胃癌MGC803细胞侵袭转移。方法 RT-PCR和Western blot检测DADS及干扰Cath-D对人胃癌MGC803细胞Cath-D mRNA与蛋白表达变化;细胞划痕实验和Transwell实验分别检测DADS及干扰Cath-D对人胃癌MGC803细胞侵袭转移能力的变化。结果 DADS作用人胃癌MGC803细胞24 h后,Cath-D mRNA与蛋白表达水平明显下降（ P〈0.05）,划痕距离明显增宽（P〈0.05）,穿膜细胞数明显减少（P〈0.05）;siRNA干扰Cath-D后,Cath-D mRNA与蛋白的表达水平明显下降（P〈0.05）,划痕距离明显增宽（P〈0.05）,穿膜细胞数明显减少（P〈0.05）。结论DADS能抑制人胃癌MGC803细胞的侵袭转移能力,其机制可能与下调Cath-D 的表达有关。     

TRAF1基因干扰质粒的构建及其对胃癌细胞生物学功能的影响

目的:构建T F1基因干扰重组质粒及建立T F1基因干扰瞬时转染胃癌细胞模型,然后通过干扰目标胃癌细胞中的T F1基因来检测T F1对胃癌细胞的生物学功能的影响。方法:首先通过real-time PCR和Western印迹验证T F1在胃癌细胞系BGC823,SGC7901,MGC803中的表达,筛选出T F1表达量最高的一株细胞作为干扰转染的目标细胞;设计及构建3个T F1的shRNA表达载体pLVX-shRNA-T F1-shRNA1~3,将其分别转染至目标胃癌细胞系中,应用real-time PCR和Western印迹筛选出干扰效率最强的shRNA,最后通过M及流式细胞术检测T F1对胃癌细胞凋亡能力的影响,通过Transwell小室迁移实验来检测对其迁移功能的影响。结果:与GES-1比较,T F1基因在BGC823,SGC7901,MGC803中的表达均有上调(P<0.05),其中以BGC823表达最高;3个T F1shRNA对T F1基因均有抑制作用,以pLVX-shRNA-T F1-shRNA2干扰效果最强;干扰胃癌细胞BGC823中的T F1可使细胞生长活力减弱,凋亡明显增加,但对其迁移功能无明显影响。结论:T F1基因在胃癌细胞系BGC823中上调最明显;pLVX-shRNA-T F1-shRNA2可成功干扰BGC823中T F1的表达;T F1可抑制BGC823细胞的凋亡。     

胃癌细胞对三氧化二砷的敏感性与活性氧产生的关系

 目的探讨胃癌细胞对三氧化二砷（As2O3）的敏感性与细胞活性氧（ROS）产生的关系。方法应用MTT法检测As2O3对
胃癌MGC803、BGC823 和SGC7901 细胞的细胞毒作用;应用流式细胞仪检测未用药及As2O3作用后3 种细胞系的ROS 水平。
结果不同浓度的As2O3呈时间、浓度±赖性抑制胃癌MGC803、BGC823 和SGC7901细胞的增殖;72 h 抑制细胞增殖的IC50
分别为2.8、3.1 和10.2 μmol/L,胃癌MGC803 和BGC823细胞的IC50均显著低于SGC7901 细胞（ P 均< 0.01）。未用药MGC803、
BGC823 和SGC7901 细胞系ROS 峰值水平分别为20.3±2.0、64.2±3.3 和57.7±2.0;5 μmol/L As2O3 作用24 h后,MGC803 和
BGC823 细胞的ROS 峰值水平分别为100.8±3.8 和103.5±2.3,与用药前比较均显著升高（ P < 0.001,P < 0.01）,而相对不敏感的
SGC7901 细胞用药后ROS 峰值水平为56.5±2.4,未见升高（ P > 0.05）。结论胃癌细胞对As2O3的敏感性与As2O3作用后细胞
内ROS 水平的升高有关。     

三氧化二砷对人胃癌MGC803细胞FOX03a和VEGF表达的影响

目的观察FOXO3a基因沉默后,三氧二砷（As2O3）对人胃癌MGC803细胞FOX03a和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用脂质体转染小干扰RNA（siRNA）方法降低胃癌MGC803细胞FOX03a的表达。采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测FOX03a和VEGF mRNA的表达;采用Western blot法检测FOX03a和VEGF蛋白的表达。结果与对照组相比,As2O3促进胃癌MGC803细胞内FOX03a蛋白和mRNA的表达,并抑制VEGF蛋白和mRNA的表达,FOXO3 asiRNA处理后明显抑制FOX03a蛋白与mRNA表达且增加VEGF蛋白和mRNA表达。结论As2O3可能是通过促进MGC803细胞中FOXO3a的表达引起VEGF表达的降低。     

DNMT1与UHRF1基因在胃癌细胞系中的表达特点及其与癌细胞DNA甲基化的关系

[目的]探讨DNMT1和UHRF1在胃癌的形成和转化中的表达特点和可能的生物学作用。[方法]提取CIMP型H（High）的胃癌细胞系HGC-27和CIMP型为L（10w）的胃癌细胞系MGC803,BGC823及AGS的核酸样品进行UHRF1和DNMT1表达的分析。[结果]DNMT1在MGC823和HGC-27表达水平明显高于其他胃癌细胞系（P〈0．01）;UHRF1在HGC-27中有表达水平高于其他3个胃癌细胞系（P〈0．01）。[结论]胃癌细胞DNA的甲基化不但和DNMT1有关而且和UHRF1也有着密切关系。     

抑制组织蛋白酶B表达对胃癌BGC-823细胞黏附、增殖和侵袭的影响

目的 探讨抑制组织蛋白酶B表达对胃癌BGC-823细胞黏附、增殖和侵袭的影响.方法 构建针对CB的siRNA表达载体,脂质体LipofectAmineTM2000转染胃癌细胞株BGC-823.荧光定量RT-PCR和免疫印迹检测CB在各组胃癌细胞中的表达水平;细胞黏附实验检测各组胃癌细胞的黏附能力;细胞侵袭性实验检测各组胃癌细胞的侵袭能力;细胞增殖实验检测各组胃癌细胞的增殖能力.结果 与空白对照组和无关siRNA对照组相比,沉默1组和沉默2组细胞中,CB mRNA的相对表达量显著降低(P ＜0.01);CB蛋白表达被显著抑制;纤维粘连蛋白和基质胶黏附的胃癌细胞数目以及穿透基质胶的胃癌细胞数显著降低(P＜0.05);并且在2d、3d、4d及5d细胞孔内的吸光度值亦显著减少,差异有显著性(P＜0.05).而在无关siRNA对照组和空白对照组之间,CB mRNA的相对表达量、两组的黏附细胞数目以及两组穿透基质胶的细胞数都无显著性差异(P＞0.05).结论 设计针对CB基因的siRNA片段构建的siRNA载体能够有效干扰胃癌BGC-823细胞中CB mRNA和蛋白的表达.抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低胃癌细胞的生长速度、降低胃癌细胞与基质黏附能力、降低胃癌细胞侵袭和转移的能力.     

KLF2过表达及敲减胃癌稳转细胞株的建立

目的 构建KLF2过表达BGC823和KLF2敲减MGC803胃癌稳转细胞株。方法克隆人源KLF2基因,连接到AgeI/AgeI酶切后GV358载体上,构建GV358-KLF2重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;构建KLF2shRNA,连接到BamHI和EcoRI双酶切后的PHBLV-U6-ZSGreen-Puro载体上,经鉴定后转染293T细胞。采用RT-PCR及Western印迹法检测稳转细胞株中KLF2的表达。结果利用慢病毒介导,重组质粒GV358-KLF2和KLF2-shRNA转导入BGC823细胞、MGC803细胞并稳定表达。RT-PCR和Western印迹法结果均显示过表达稳转株KLF2表达量明显升高（P＜0.05）,敲减稳转株KLF2表达量明显下降（P＜0.05）。结论成功构建了KLF2过表达BGC823细胞株和KLF2敲减MGC803细胞株,为后续KLF2功能实验奠定了基础。     

雪灵芝水提取物对人胃腺癌MGC-803细胞Bcl-2，Bax基因表达的影响

目的研究雪灵芝水提取物对人胃腺癌MGC-803细胞Bcl-2和Bax基因表达的影响。方法不同浓度的雪灵芝水提取物处理体外培养的MGC-803细胞,采用四甲基偶氮噻唑蓝（MYr）法检测细胞存活水平;应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡水平;采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法（Western Blot）测定人胃腺癌MGC-803细胞的Bcl-2和Bax基因表达情况。结果雪灵芝水提取物作用于人胃腺癌MGC～803细胞后,0．1～0．8mg／mL浓度组细胞存活水平随药物浓度的增大而减小（P〈0．05）;0．8mg／mL浓度组MGC-803细胞G．期比例为（61．23±6．45）％、S期细胞比例为（26．86±3．38）％、细胞凋亡率为（0．07±0,01）％,与对照组相比,P〈0．05;与对照组相比,0．8mg／mL浓度组Bcl-2 mRNA表达降低、Bax mRNA表达增加（P〈0．05）;0．2～0．8mg／mL浓度组Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达增加。结论雪灵芝水提取物在一定浓度范围内可降低MGC-803细胞的存活水平,使细胞发生凋亡,其机制可能为通过下调Bcl-2基因、上调Bax基因表达,促进细胞凋亡发生。     

光辉霉素A对人胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其机制

目的观察光辉霉素A（MIT）对人低分化胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、迁移的作用,以及对转录因子Sp1和乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）表达的影响,并探讨其可能的机制。方法采用不同浓度的MIT作用于胃癌BGC823细胞,以Cell Counting Kit-8（CCK8）法测定对细胞增殖的影响;以流式细胞仪测定对细胞凋亡的影响;以细胞划痕法观察对细胞迁移能力的影响;以实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）法定量测定细胞内Sp1和Hpa mRNA表达的变化。结果 MIT抑制胃癌BGC823细胞增殖的效应呈浓度和时间依赖性（P均〈0.05）;不同浓度（0、0.15、0.30、0.60μmol/L）的MIT作用于胃癌BGC823细胞24 h后,细胞的凋亡率随药物浓度的增加而增加,分别为（2.100±0.985）、（13.533±0.777）、（21.533±0.874）、（27.500±0.964）%,即MIT促进胃癌BGC823细胞的凋亡呈浓度依赖性（P〈0.05）;MIT对胃癌BGC823细胞迁移的抑制作用具有量效和时效性;胃癌BGC823细胞Sp1和Hpa mRNA表达量随MIT浓度的增加而降低（P均〈0.05）。结论 MIT对胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、迁移影响可能通过抑制Sp1、Hpa的表达而实现。     

胃癌细胞系的细胞遗传学与分子细胞遗传学研究

对胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３、ＭＧＣ－８０３、ＳＧＣ－７９０１进行体外传代２，收获分裂中期细胞、计算染色体众数，进行Ｇ显带核分析，并以１６号染色体着丝粒探针和３号染色体长臂涂染探针分别对ＢＧＣ－８２３和ＭＧＣ－８０３两个细胞系进行染荧光原位杂交。结果发现，在３个细胞系中存在大量的染色体数目与结构异常。其中１６号染色体和１染色体的增加涉及３号染色体的易位，以及多拷贝的５号染色体短臂等臂染色体的出现是这     

沉默circPVT1对5-氟尿嘧啶耐药胃癌细胞化疗增敏作用及机制研究

目的:研究circPVT1对胃癌细胞5-氟尿嘧啶（FU）敏感性的作用及分子机制。方法:采用RT-PCR检测胃癌组织、胃癌细胞BGC823和5-FU抵抗胃癌细胞 BGC823/5-FU 中circPVT1的相对表达水平。沉默circPVT1,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性,观察其对细胞活性的影响。采用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。采用TUNEL试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用RT-PCR和Western 印迹检测Bcl-2、Bax 和caspase-3基因mRNA和蛋白的表达水平。沉默circPVT1观察裸鼠皮下移植瘤生长。结果:在5-FU抵抗患者胃癌组织中circPVT1的表达水平明显高于5-FU敏感患者（P＜0.01）。与BGC823细胞相比,circPVT1在BGC823/5-FU细胞中的表达水平明显升高（P＜0.001）。下调circPVT1表达可增强5-FU的细胞毒性（P＜0.05）。与5-FU+si-NC组相比,5-FU+si-circPVT1组BGC823/5-FU细胞的克隆形成能力明显降低（P＜0.05）。5-FU+si-circPVT1组BGC823/5-FU细胞的凋亡数目明显高于5-FU+si-NC组（P＜0.01）。沉默circPVT1,与5-FU+si-NC组相比,5-FU+si-circPVT1组BGC823/5-FU细胞中Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平明显降低,Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。裸鼠移植瘤实验结果显示,5-FU+si-circPVT1组移植瘤体积和重量明显低于5-FU+si-NC组（P＜0.05）。结论:沉默circPVT1可以通过调控Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,增强BGC823/5-FU细胞对5-FU的敏感性。