大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的 建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性.方法 采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞.免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MIT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性.结果 获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desmin呈强阳性表达.体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2 d的潜伏期,5～6 d进入平台期.细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞.结论 酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法.骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞.     

兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

目的建立高纯度、高丰度的兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养方法,并对培养的肌卫星细胞体外增殖和成肌特性进行观察。方法采用改良I型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法结合差速贴壁培养以分离、纯化1周龄幼兔小腿三头肌来源的骨骼肌卫星细胞。镜下观察肌卫星细胞生长形态,结蛋白(Desmin)免疫组化染色鉴定体外培养的肌卫星细胞,MTT法绘制细胞生长曲线,并对分离培养的肌卫星细胞成肌特性进行诱导培养观察。结果差速贴壁后的悬浮肌卫星细胞折光性强,呈透亮球形,数量较多,贴壁生长后逐渐变为长梭形;免疫组化染色检测分离培养的细胞高表达Desmin,证明为肌卫星细胞,纯度高达95%;传代培养的肌卫星细胞24 h后开始增殖,第3~7天处于对数生长期,第8天后进入平台期;不经诱导分化培养基培养的肌卫星细胞也可融合形成肌管,但形成肌管速度不及诱导分化培养组快速。结论成功建立了具有操作简便、不易污染和纯度高的兔骨骼肌卫星细胞分离、培养方法,为采用肌卫星细胞为种子细胞的再生医学研究奠定实验基础。     

咀嚼肌卫星细胞的体外培养及生物学特性的研究

目的:探讨咀嚼肌卫星细胞的体外培养方法并研究其生物学特性。方法:取新生绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠面部咀嚼肌,采用酶消化法分离出咀嚼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养。采用倒置显微镜及荧光显微镜观察、测定生长曲线等指标,研究咀嚼肌肌卫星细胞的增殖与分化能力,采用骨骼肌肌动蛋白(-αsarcometric actin)单抗免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:酶消化法适于咀嚼肌卫星细胞的分离,体外培养的咀嚼肌卫星细胞增殖速度快。免疫化学染色显示,体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。结论:体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞有强的增殖分化能力,能用于颌面部组织工程种子细胞库的构建。     

骨骼肌卫星细胞的纯化、培养、鉴定及生物学特性的研究

目的 研究骨骼肌卫星细胞体外纯化、培养、鉴定的方法及其生物学特性。方法 采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法纯化出大鼠骨骼肌卫星细胞（SC）,进行体外原代和传代培养,借此观察SC的增殖、分化特点并进行免疫细胞化学染色鉴定。结果 两步消化法是获取SC可靠的方法。生长培养基促使细胞的增殖;延迟分瓶或分化培养基促使细胞分化形成肌管。骨骼肌肌球蛋白（myosin）单克隆抗体免疫细胞化学染色SC呈弱阳性,而肌管呈强阳性。结论 体外培养的大鼠SC在合适的培养条件和传代比例下能够增殖与分化并保持其生物学特性,为其在组织工程和基因治疗中的应用奠定了基础。     

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定

目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的高浓度培养方法。方法以成年同种系Wistar大鼠为研究对象,采用两步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外培养,对获得的细胞进行形态学研究,以免疫组织化学方法进行鉴定。结果细胞增殖旺盛,分化良好,可融合成肌管。免疫细胞化学染色显示,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性,肌管呈强阳性。结论两步消化法体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌成肌细胞,操作简单、污染少。     

成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定

目的：探讨骨骼肌卫星细胞体外培养，鉴定的方法。方法：采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞，经差速贴壁法纯化后，在培养液中进行培养，观察不同血清浓度下，卫星细胞生长融合的情况，倒置显微镜观察细胞形态，利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞。结果：细胞经过两步消化和差速贴壁后，纯度在90%以上，在生长培基中，细胞分裂增生；在融合培基中，细胞发生融合，形成肌管。结论：成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化，结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞。     

大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定

目的采用组织块培养技术探索大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养方法。方法以成年SPF级Sprague-Dawley大鼠为研究对象,采用组织块培养法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,并与C2C12成肌细胞进行比较,对两种细胞进行形态学研究及采用免疫荧光和免疫组织化学法测定两种细胞α-actin蛋白和Desmin蛋白的表达及分布,从而对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果通过组织块培养法获取的细胞增殖旺盛,分化良好。免疫细胞荧光和免疫组织化学实验结果显示,α-actin蛋白和Desmin蛋白在两种细胞胞浆中均有分布。结论用组织块培养法获取的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞。     

骨骼肌卫星细胞的分离、培养及鉴定

目的 探讨骨骼肌卫星细胞的分离、培养及鉴定方法。方法 从外科手术中获取患者骨胳肌3—5g,采用胶原酶和透明质酸酶消化的方法获取骨骼肌卫星细胞,进行体外培养、扩增,并观察所培养细胞的形态;降低培养液中胎牛血清浓度,观察肌管形成;免疫组化方法检测Desmin的表达;RT—PCR法检测肝细胞生长因子受体c—met的表达。结果 卫星细胞在体外生长、增殖良好,刚分离出的卫星细胞呈球形,折光性强,12小时后开始贴壁,仍为圆形,48小时后贴壁完全,细胞呈梭形,生长缓慢。随时间延长,细胞增殖、迁移,逐渐有规律地平行排列。降低细胞培养液中胎牛血清浓度至2％,卫星细胞可融合成肌管,免疫组化显示培养的细胞Desmin阳性,这些细咆表达c—met。结论 酶消化法适用于卫星细胞的培养。     

新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法.方法 采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞,经差速贴壁法纯化后,培养液中培养.倒置显微镜观察细胞形态,生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞.结果 经过两步消化和差速贴壁后, 成功培养出高纯度的肌源性干细胞,细胞免疫荧光结果为desmin( ).结论 通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定,为组织工程的临床应用提供种子细胞.     

新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43表达的变化

目的探讨新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43 mRNA和蛋白含量的变化。方法对照组(C组):新生猪6头,未吸入低氧;缺氧组(H组):新生猪6头,吸入低氧(FiO2=0.1)维持1 h。于缺氧结束后5 h,免疫荧光染色检测心肌组织细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达,实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织Cx43 mRNA的表达。结果H组心肌组织Cx43蛋白的表达显著低于C组(P<0.01),但两组心肌组织Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧可导致心肌Cx43蛋白的表达或分布发生变化。     

免膀胱平滑肌细胞的分离培养与鉴定

目的 建立分离、培养高纯度兔膀胱平滑肌细胞的方法,并进行细胞学鉴定与分析。方法 正常成年新西兰白兔共6只,运用显微手术器械在肉眼下仔细剔除膀胱黏膜层及浆膜层后,完整分离膀胱平滑肌层。然后以酶分离法获取兔膀胱平滑肌细胞,体外原代和传代培养分离细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,同时进行细胞爬片H-E染色和透射电镜等形态学观察分析,并应用免疫荧光染色平滑肌特有的α-肌动蛋白进行细胞学鉴定分析。最后根据细胞计数绘制细胞生长曲线和增殖曲线。结果 24 h可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长,7 d可进行传代,传至第10代时细胞仍迅速生长,倒置显微镜下观察细胞相互交叉、重叠生长形成多层,高低起伏呈“谷和峰”样结构,至第12代时,细胞开始变形,至第15代时细胞已失去平滑肌细胞的典型形态特点,细胞生长杂乱且不规则,至第20代时细胞已死亡。以第4代细胞进行形态学细胞爬片H-E染色和透射电镜观察分析,以及平滑肌特有的α-肌动蛋白免疫荧光染色分析均证实,该分离培养的细胞为膀胱平滑肌细胞,且纯度高达100%。结论 酶分离法在短时间内成功培养大量高纯度的膀胱平滑肌细胞,为深入研究膀胱平滑肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响

目的体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究玻璃粘连蛋白(VN)在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法贴壁分离培养法分离纯化rMSC,观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VN包被的培养板培养,每4d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形,第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构;细胞表达CD44、CD90,而不表达CD34。用以VN包被的培养板培养12d,碱性磷酸酶染色呈阳性,硝酸银染色显示有钙结节形成。结论VN有诱导rMSC向成骨方向分化的作用。     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.     

小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的 体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞，观察细胞内β肌动蛋白（β-actin）的表达情况。方法 采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌（快肌）和比目鱼肌（慢肌）卫星细胞，免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA，以GAPDH作为内参行RT-PCR，半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果 体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性，细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论 小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌，提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。     

小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞,观察细胞内β肌动蛋白(β-actin)的表达情况。方法采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌(快肌)和比目鱼肌(慢肌)卫星细胞,免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA,以GAPDH作为内参行RT-PCR,半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性,细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌,提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。     

bFGF、TGF-β联合使用对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响

目的:探讨bFGF和TGF-β联合使用对体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响。方法:采用组织学方法观察bFGF组、TGF-β组、bFGF+TGF-β组及对照组中体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞形态变化及细胞增殖状况。结果:bFGF和TGF-β单独作用对体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞增殖作用较弱;两者联合作用,促增殖作用显著增强。结论:bFGF和TGF-β联合作用对体外培养骨骼肌卫星细胞的增殖起了重要作用。     

人妊娠子宫平滑肌细胞培养消化法与组织块法效果比较

目的寻求简单有效的人妊娠子宫平滑肌细胞原代培养方法,建立稳定、高纯度、高产量的子宫平滑肌细胞原代培养体外模型。方法利用20例妊娠子宫组织,分别使用组织块法和胶原酶消化法分离及纯化人子宫平滑肌细胞,通过免疫荧光方法检测平滑肌细胞的肌动蛋白(α-SMA)及钙调节蛋白(calponin)的表达。结果组织块法和胶原酶消化法培养的平滑肌细胞均呈梭型,峰谷样生长,α-SMA及calponin的免疫荧光化学检测结果为阳性,胶原酶消化法较组织块培养法稳定且缩短原代培养时间。结论胶原酶法简便,快速,稳定,可建立稳定、高纯度的子宫平滑肌细胞体外培养体系。