清除细胞培养物中支原体的一个改良方法

支原体污染是人和动物细胞系体外培养中常见的问题，污染细胞系与未污染细胞系的形态学，酶细胞化学和免疫细胞化学分析等表型均无差异。支原体在细胞融合中却能严重地减少杂交细胞的产生，因而急需建立一个可靠的去除支原体的方法以排除它们对融合率的破坏作用．     

应用单克隆抗体检查淋巴母细胞系的支原体污染

免疫学研究中应用的淋巴母细胞系存在着严重的支原体污染问题.这些支原体耗竭HAT选择培养基中的胸腺嘧啶核苷.对杂交细胞产生毒性,从而严重阻碍了细胞融合的成功.本文作者在用人B淋巴母细胞(Swei)作免疫原制备抗人Ia抗原的单克隆抗体时,意外地获得了两株针对支原体的杂交瘤细胞     

检测支原体污染的一种敏感的微量定量试验IL-2依赖性细胞系增殖的抑制试验

本文报告检测细胞培养中支原体的一种简易、快速及敏感的微量分析法。该法是基于污染细胞的培养上清液能抑制[~3H]胸腺嘧啶核苷结合一种白细胞介素—2(IL—2)依赖性小鼠细胞毒性T细胞系(CTLL)。     

用一种单克隆抗体快速简易地检出细胞培养中的支原体(文摘)

检测支原体污染是细胞培养中有待解决的一个问题。作者应用常见几种污染细胞培养的支原体(口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体,莱氏无胆甾原体及唾液支原体,几种支原体占污染细胞培养支原体的96％)。为抗原,免疫了雌性BALB/c小鼠。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Xg3Ag 865融合成杂交瘤细胞,建立了30种抗支原体单克隆抗体杂交瘤细胞等。应用ELISA,     

几种防治组织培养中支原体污染方法的探索

本文报告了对几种防治组织培养中的支原体污染的方法的研究结果。试用各种滤器过滤血清和56℃灭活方法,以去除小牛血清中污染的支原体。采用半固体培基方法鉴定支原体结果证明,0.22u微孔滤膜和EKS蔡氏滤板可以去除小牛血清中污染的支原体。但G6玻璃滤器和0.3μ微孔滤膜过滤不能清除血清中的支原体,56℃加热30分钟,重复三次不能使血清中的支原体灭活。对于已经污染有支原体的传代细胞株,使用各种抗生素或在培养物中加入小鼠腹腔饲养细胞都不能去除支原体。但是将污染细胞接种于小鼠腹腔,经过一定时间再取腹水或实体瘤细胞培养,鉴定结果表明,通过小鼠腹腔内培养的NS-1细胞,不仅清除了污染的支原体,用于融合也获得满意效果。     

清除杂交瘤细胞支原体污染几种方法的比较

实验室细胞培养中，支原体污染是一个普遍存在的问题，据文献报道污染率高达90％’‘’。由于受污染的支原体可干扰细胞的DNA，RNA和蛋白质的合成，消耗培养液中的氨基酸，从而影响细胞的正常生长，严重者可导致细胞死亡，因此，清除污染的支原体，具有重要的意义。检测支原体的方法有多种，但基于本实验室条件，我们采用了培养法和DNA荧光染色法检测杂交瘤细胞株污染的支原体。由于要彻底清除污染的支原体相当困难，实际工作中应预防为主，一旦发现有支原体污染就应废弃。而对某些建株困难的重要细胞株，则须设法清除污染的支原体。目…     

支原体污染经p38 MAPK途径降低人类细胞株28S和18S RNC-rRNA

目的:研究支原体感染对人类细胞株的核糖体新生肽链复合体(RNC)中rRNA组成的影响及其相关机制。方法:分别提取支原体阳性与阴性RNC-RNA进行琼脂糖凝胶电泳,分析RNC-rRNA组成改变情况;在支原体污染环境中培养人正常肺上皮(HBE)细胞,比较培养前后RNC-rRNA的变化;对RNC-RNA条带异常细胞进行抗支原体治疗,比较治疗前后RNC-rRNA的变化。利用免疫印迹分析支原体污染对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径的影响。结果:不同组织来源的多株细胞中,支原体阴性和阳性细胞RNCRNA的琼脂糖电泳显示细胞中RNC-rRNA组成发生异常改变,主要体现为28S和18S真核rRNA的降低,以及16S和未知原核rRNA的增加。在污染环境中培养HBE细胞,其RNC-rRNA组成可由支原体阴性转变为阳性谱型。以环丙沙星抗支原体治疗可逆转上述RNC-rRNA谱型的改变。总蛋白和磷酸化蛋白的免疫印记结果表明,支原体污染显著抑制A549细胞的p38 MAPK途径的活化,而对该细胞的ERK1/2途径无显著改变。结论:支原体感染可通过抑制p38 MAPK活化严重改变人类细胞株中RNC-rRNA的组成,从而影响宿主细胞的翻译行为。     

国内建立的人肿瘤细胞系的身份认证问题及对策

目的 为国内建立的人肿瘤细胞系进行身份认证，确认这些细胞系使用的可靠性。 方法 收集、整理国内实验室建立的人肿瘤来源细胞系，提取细胞的基因组DNA，PCR扩增其中的多个短串联重复序列（STRs）位点后进行毛细管电泳，分析获得细胞的STR图谱作为细胞系的DNA指纹，然后与原始组织或国际数据库中已有细胞的STR谱进行比对，通过匹配度的高低判断该细胞是否被其他细胞交叉污染。对怀疑HeLa细胞污染的肿瘤细胞，检测其基因组中是否有人乳头瘤病毒18型（HPV-18）病毒插入片段。对怀疑T细胞白血病细胞污染的，则检测T细胞的各种特性（表面标志），根据表面标志表达情况判断是否为错误细胞。 结果 本研究共收集了37种国内建立的肿瘤细胞系46个样品。本中心建立的6株细胞系均STR正确。其他单位建立的细胞系中有8株系正确，有23（62.2%）株系认定为错误细胞，人宫颈癌细胞HeLa是主要污染源；另外发现有些国内自建的细胞系被人结直肠癌细胞HCT-8、宫颈鳞癌细胞SiHa、T细胞白血病细胞CCRF-CEM及大鼠细胞污染。 结论 国内建立的肿瘤细胞很高比例地发生了细胞间的交叉污染，科研人员在实验前一定要首先进行细胞身份认定，或者从国家实验细胞资源共享服务平台选择细胞。另外，建立细胞系时保留原始组织用于后续细胞系的身份认证。     

用滚环扩增技术检测污染细胞的5种支原体

目的 建立滚环扩增技术检测5种常见的细胞污染支原体(猪鼻支原体、发酵支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体)的方法.方法 使用细胞污染支原体16S-23SrRNA间隔区公共引物(SPS1,SPA2)扩增间隔区靶基因.设计每一种支原体特异性锁式探针,锁式探针与扩增的靶基因杂交结合形成环化单链分子,加入特异性引物在Corbett RotorGeneTM 6000扩增仪滚动扩增环化单链分子,观察结果.结果 滚环扩增技术能敏感和特异的检测上述5种支原体标准株,并能敏感的检测10个拷贝的靶基因.在62个细胞培养物样本的检测中,37个样本检测出一种支原体,14个样本检测出两种支原体,11个样本为支原体阴性.滚环扩增方法检测结果与支原体种特异性PCR检测结果一致.结论 滚环扩增作为一种新的扩增技术能敏感和特异的检测细胞污染支原体.     

通过小鼠腔腹消除杂交瘤培养物中的支原体、细菌、真菌的污染

支原体、细菌及真菌经常会污涂细胞培养物,它们对细胞可产生诸如形态学改变、代谢、生长、生活力的变化。在杂文瘤技术中,这些病理学效应是由于细胞感染造成良好收获和杂交瘤细胞系保存的一种限制因子。 当前,所用消除支原体、细菌、真菌污涂的方法,例如使用抗生素和抗真菌药物,     

160例非人源细胞系的种间交叉污染情况分析

目的分析常见的非人源细胞系种间交叉污染情况。方法收集160例常见的非人源细胞系,提取基因组DNA,通过PCR法鉴定其来源种属,判断是否存在种属间的交叉污染。对可疑细胞进一步通过染色体分析确认其来源种属。结果 160例非人源细胞中,有6个细胞系的种属鉴定结果与预期种属不符,其中1例大鼠来源细胞混入了人来源细胞,其余5例种属不正确,认定为错误细胞。结论细胞系的种属鉴定是细胞质量控制的不可或缺的环节,只有经过完整质控的细胞才能作为实验材料,用于科学研究和应用。     

培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用

在生物制剂的生产和研发领域,细胞培养扮演着极其重要的角色：用原代细胞或传代细胞制造疫苗;杂交瘤细胞制造单克隆抗体;基因工程或细胞生物学的研究等。然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客,严重影响着细胞及生物制剂的质量。污染细胞最常见的支原体包括：     

4种抗支原体单克隆抗体免疫学特性的研究

为了有效地控制细胞质量、我们从1987年开始、相继建立了抗口腔支原体(M.orale),精氨酸支原体(M.arginini),猪鼻支原体(M.hyorhinis).和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)的杂交瘤细胞系共20株。并用IFA法、BA法或APAAP法对单克隆抗体进行了检测和鉴定。单克隆抗体(McAb)亚类鉴定结果:8株为IgG1,2株为IgG2b,其余10株为IgM。抗体效价测定大多数在4000～8 000之间。利用支原体纯培养的菌落进行了IFA染色试验,封闭试验,生长抑制试验和免疫电镜检查,均证实了它们的特异性,并获得2株对同属支原体有抗原交叉的McAb(3D1和3A11)。利用上述McAb检测实验室常用细胞的支原体污染,较常规法和DNA荧光染色法简便,快速,特异性较高。     

逆转录病毒作为基因治疗载体的生物安全检测

目的在以逆转录病毒为载体的抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）细胞内免疫基因治疗研究过程中,建立较完整的生物安全检测系统,为临床应用奠定基础。方法包括无菌,支原体和可复制性逆转录病毒的检测。支原体检测采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法,可复制性逆转录病毒的检测应用Ｓ＋／Ｌ－试验,ＮＩＨ３Ｔ３细胞扩增试验和ｎｅｏ基因补救分析。结果在所建立的靶基因包装细胞系中,无菌试验均为阴性,一株包装细胞支原体呈阳性,全部包装细胞系未测到可复制性逆转录病毒。结论本研究采用的生物安全检测系统具有稳定性好,敏感染性高的优点,对基因治疗临床试验的生物安全检测具有重要的应用价值。     

细胞培养实验中细胞系鉴定及质量控制重要性探讨

目的 以脑胶质瘤细胞系(U87)为例,探讨对在细胞培养实验中所使用的细胞系进行鉴定和质量控制的重要性.方法 对三株不同来源的U87细胞系进行STR分型检测,并结合显微镜下形态学特征,判断所测细胞系是否为真正的U87细胞系及是否发生交叉污染.结果 通过细胞STR分型结果与ATCC、DSMZ中STR数据库对比,得出U87-1细胞分型与ATCC中U-87 MG Glioblastoma-Astrocytoma Humanl00％匹配;U87-2细胞分型与DSMZ数据库中U-87MG100％匹配;U87-3未得到扩增产物,不能进行分型,原因是该细胞株为非人源细胞.结论 细胞培养实验中所使用细胞系的鉴定对于后续研究具有重要意义,可使用STR分型检测技术在细胞系培养过程中进行质量控制,对其进行准确鉴定,并排查是否存在细胞交叉污染.     

细胞培养中支原体污染的去除

在运用细胞培养手段的生物学研究和生物工程产品中，支原体污染仍是一个颇为棘手的问题。１１株人的细胞ＳＰＣ－Ａ１、Ｋ５６２、ＨＵＴ－１０２、ＢＴ－３２５、６Ｔ－ＣＥＭ、ＮＫＭ－４５、ＣＮＥ、ＨＬ－６０、ＱＧＹ－７７０１、ＱＺＧ、人羊膜细胞；３株小鼠细胞Ｐ３８８－１、ＹＡＣ－１、Ｐ８１５；１株绒猴细胞Ｂ９５－８；和一株杂交瘤ＱＫＴ３等，已污染了支原体的细胞经ＭＣ－２１０ １μｇ／ｍｌ处理７天，支原体污染     

细胞培养的支原体污染和分型

细胞培养的支原体污染和分型首都儿科研究所北京１０００２０任桂珍，曹玉璞，张佳杰近年来收到送检支原体污染的标本２８３份。标本包括各种肿瘤原代细胞，传代细胞、牛血清、细胞培养液及实验人员的咽拭子。送检标本用含１０％酵母浸液，２０％马血清的普通半固体及液体...     

细胞培养中细菌类微生物污染的快速检测

目的 检测细胞培养中细菌类(包括支原体)微生物的污染情况。方法 用细胞培养中常见的培养物人为污染He-La细胞，设计细菌类微生物16S rRNA基因序列通用引物，PCR扩增16SrRNA基因序列片断，建立PCR检测培养细胞污染的方法，并用该方法检测本室保存的细胞株的污染情况。结果 人为污染绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌和支原体M.fernentans的Hela细胞的培养上清中均扩增出大小的片段，与目的片段相符。本室所收藏的15个细胞株有3株的培养上清中扩增出大小的片段。结论 本实验建立了：16SrRNA基因序列通用引物PCR法，可用于快速检测培养细胞中细菌类微生物的污染。     

建立不同民族永生细胞株质量控制方法的探讨

目的以建立普米族、独龙族和怒族永生细胞为基础,探讨EB病毒转化细胞、细胞培养、冻存、复苏以及支原体检测等建立永生细胞株的技术要点及质量检测方法.方法采用EB病毒转化技术建立3个民族永生细胞株;培养法和PCR法对细胞株进行支原体污染检测;染色体G显带及核型分析细胞株的遗传稳定性.结果成功建立了3个民族B淋巴细胞永生细胞株,转化率分别为98%、86%和76%.对已建株保存的3个民族的永生细胞进行复苏培养,复苏成活率为100%.支原体污染检测均为阴性.染色体计数和G带分析显示,细胞株经早期传代培养后,仍然保持二倍体特征,未发现染色体结构畸变.结论本研究中传代培养、细胞冻存、细胞复苏和支原体污染防范等一整套技术过程是满足建库要求的.同时为大规模永生细胞库的建立和进行相应的质量监测提供了科学的依据.另外,本研究还对一些影响转化的因素和可能的机理进行了探讨.     

兔VX2肿瘤细胞系的建立及其生物学特性的观察

目的建立兔VX2肿瘤细胞系,观察其生物学特性。方法采用小块法对兔VX2肿瘤进行原代培养,体外传代观察,传代40次以上对培养细胞进行形态学观察、组织化学染色、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植。结果新建立的兔VX2肿瘤细胞,呈多角形、短梭形,电镜下细胞内可见张力纤维、细胞间可见桥粒,细胞角蛋白阳性,体外连续培养10个月,传代70次以上,细胞倍增时间为34．5h,细胞周期测定G,期为69．3％,G：期为5．6％,S期为25．1％。染色体为亚三倍体核型,众数为58～62条。同种移植成瘤率100％,裸鼠移植成瘤率100％,无支原体污染。结论兔VX2肿瘤细胞系来源于兔鳞状细胞癌,可用于兔（较大动物）的肿瘤实验研究。