棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响

目的研究棘霉素对耐伊马替尼K562细胞SPK及P-gp表达的影响。方法 MTT法检测细胞存活率,同位素掺入检测SPK的活性,流式细胞术检测细胞的P-gp表达。结果棘霉素对K562和耐伊马替尼细胞的IC50分别为0.82μg/L和0.87μg/L;棘霉素对耐药细胞中的SPK和P-gp活性有抑制作用;通过抑制SPK的活性可以下调P-gp的表达。结论棘霉素对敏感及耐药K562细胞均有较强的抑制作用,抑制K562/Ima存活的机制可能与影响细胞中SPK的表达,并通过下调SPK进一步影响P-gp的表达,从而增加药物在细胞内的累积浓度有关。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.     

体外诱导K562细胞伊马替尼耐药及其机理的初步探讨

目的 体外诱导K562细胞伊马替尼(imatinib)耐药并对其耐药性进行检测.方法 以浓度递增的方法诱导K562对伊马替尼产生耐药, MTT法确定其耐药性.RT-PCR方法半定量测定耐药细胞中BCR/ABL基因水平,并进行BCR/ABL基因序列测定.流式细胞术测定P-gp表达.高效液相色谱仪(HPLC)测定耐药细胞内药物浓度.结论 ①浓度递增法成功诱导K562细胞伊马替尼耐药(K562R),K562R细胞能长期在含5.0 μmol/L的伊马替尼的培养液中生长.②细胞生长曲线显示5.0 μmol/L伊马替尼作用于K562R细胞120 h,其活细胞数量与0 h无明显差别.6个浓度梯度的伊马替尼(0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.00 μmol/L)作用于K562细胞24 h,发现所有浓度(除0 μmol/L外)伊马替尼均可抑制K562细胞的生长,24 h细胞活力几乎为零.③MTT法抑制率测定K562细胞半数抑制浓度约为0.75 μmol/L,K562R细胞约为7.5 μmol/L,耐药倍数约为10倍.④HPLC细胞内药物浓度测定显示K562R胞内伊马替尼药物浓度低于K562细胞(P＜0.01),流式细胞检测未发现P-gp表达.⑤374 bp的BCR/ABL基因序列分析未发现常规热点区域基因突变.结论 体外成功诱导出伊马替尼耐药细胞--K562R细胞.K562R耐药主要环节为胞内药物浓度降低,而胞内药物浓度降低与P-gp无关.耐药机理需要进一步研究.     

蟾蜍灵联合伊马替尼对K562细胞的凋亡诱导作用

目的:探讨蟾蜍灵对K562细胞凋亡诱导作用及对伊马替尼的增敏作用。方法:用MTT法研究蟾蜍灵及蟾蜍灵+伊马替尼不同浓度组对K562细胞凋亡诱导作用。结果:①蟾蜍灵对K562细胞有凋亡诱导作用,且为剂量依赖性;②蟾蜍灵和伊马替尼在低浓度具有协同作用,随着伊马替尼浓度增加,这种作用并不增加。结论:蟾蜍灵对K562细胞具有凋亡诱导作用,为剂量依赖性,低浓度时与伊马替尼具有协同作用。     

蛋白酶体抑制剂联合伊马替尼对K562细胞livin基因表达的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib,BOR)单独或联合伊马替尼(imatinib,IM)对慢性髓性白血病(chro-nic myelogenous leukemia,CML)急变期细胞株K562中livin mRNA表达的影响.方法 不同浓度BOR(2.5,5,10 nmol/L)和IM(0.25 μmol/L)单药或分别联合处理K562细胞,分别于药物作用12,48,72 h后采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测livin mRNA的表达.结果 BOR或IM单药组K562细胞中livin mRNA的表达下调,而且随着药物浓度的增加表达降低,且在药物作用48 h时达最高.联合作用后,livin mRNA的下降水平显著增加.结论 BOR单药或联合IM可以下调K562细胞中livin mRNA的表达,并可能通过此机制来诱导其凋亡,两药联合具有协同作用.     

子宫内膜癌鞘氨醇激酶-1与1-磷酸鞘氨醇的表达和意义

目的 探讨鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase 1,SphK1）与1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）在子宫内膜癌的表达和意义.方法 收集正常子宫内膜和子宫内膜癌患者血浆,行子宫全切手术的子宫内膜癌和子宫肌瘤旁组织,ELISA法检测血浆或组织匀浆液S1P的表达,Western blot法检测组织SphK1的表达,组织SphK1激酶活性定量检测试剂盒测定SphK1酶活性.结果 和正常对照组相比,子宫内膜癌患者血浆S1P的水平和组织S1P的表达明显增加（P＜0.01）,子宫内膜癌SphK1酶活性约是正常子宫组织的2.6倍.结论 被激活的SphKl/S1P信号通路可能参与子宫内膜癌的发生发展.     

HT-29人结肠癌细胞缺氧对鞘氨醇激酶-1表达的影响

目的：研究体外缺氧对HT-29人结肠癌细胞鞘氨醇激酶-1（SK-1）表达及细胞迁移的影响。方法：模拟体外缺氧环境,应用RT-PCR及Western blot检测缺氧对HT-29细胞SK-1表达的影响,以及观察细胞迁移能力的情况。结果：缺氧状态下HT-29细胞SK-1 mRNA及蛋白表达增强,细胞迁移能力增强;且U0126具有抑制SK-1表达增强的作用。结论：缺氧状态下HT-29细胞迁移能力和SK-1基因表达存在一定关系。     

优势表达SphK-1基因对K562细胞生物学特性的影响

目的:了解优势表达鞘氨醇激酶-1(SphK-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞生物学特性的影响。方法:使用pLXSN、pLXSN-SphK-1的重组逆转录病毒液感染K562细胞并用终浓度1 000 ng/m l的G418筛选感染pLXSN和pLXSN-SphK-1基因的K562细胞;取对数生长期的K562-pLXSN和K562-SphK细胞提取蛋白收集胞浆蛋白,应用BCA-200蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。根据蛋白定量取蛋白含量相同的蛋白提取上清行γ3-2P-ATP掺入法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞SphK-1活性;并应用MTT法检测K562-pLXSN和K562-SphK细胞的增殖情况及对不同剂量格列卫的敏感性。结果:K562细胞转染SphK-1基因比转染空载体后的细胞SphK-1酶活性显著增高;K562-pLXSN细胞和K562-SphK细胞培养24 h、48和72 h后细胞增殖无显著性差异;当格列卫浓度为0.1和0.25μmol/L时,K562-PLXSN和K562-SphK细胞培养72 h后的细胞存活率无明显差异;当格列卫浓度为0.5至10μmol/L时,K562-SphK细胞存活率显著低于K562-PLXSN细胞(P<0.05)。结论:优势表达SphK-1基因对K562细胞自然增殖无显著影响,但增加了细胞对浓度高于0.5μmol/L格列卫的敏感性。     

缺氧微环境下钙信号介导鞘氨醇激酶1促进胶质瘤细胞增殖

目的探讨缺氧微环境下鞘氨醇激酶1（SphK1）调控胶质瘤细胞增殖的分子机制。方法缺氧建立缺氧模型;RNA干扰技
术下调SphK1的表达,分别以real-time PCR及蛋白免疫印记方法检测SphK1在mRNA及蛋白水平上的表达;CCK-8检测胶质
瘤细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Fluo-3/AM孵育,激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+的动态变化。结果SphK1表达下
调可显著降低缺氧诱导的钙内流,并在缺氧条件下影响胶质瘤细胞增殖;钙通道激活剂OAG可减弱SphK1表达下调引起的细
胞增殖抑制。结论缺氧微环境下SphK1可通过对胞内钙离子的调控影响胶质瘤的增殖。
     

STAT5-ROS信号通路介导K562细胞伊马替尼耐药的机制研究

目的 探讨信号转导与转录因子5-氧化物(STAT5-ROS)细胞信号转导通路在慢性髓细胞白血病细胞(K562)伊马替尼(IM)耐药中的作用机制.方法 以浓度递增的方法诱导K562对IM产生耐药, CCK-8法检测其耐药性.RT-PCR方法定量测定K562/G细胞中STAT5A和STAT5B mRNA表达.流式细胞术测定ROS和细胞凋亡水平.Western blot法检测细胞中总STAT5和p-STAT5蛋白表达.结果 实验成功诱导K562/G耐药细胞,CCK-8法测定耐药倍数为80倍.细胞生长曲线显示20 μmol/L IM作用于K562/G细胞48 h,活细胞数量减半.0.1 μmol/L IM作用于K562细胞24 h,活细胞数量几乎为零.流式细胞检测K562/G细胞内ROS水平明显高于K562细胞(P=0.000 1),相同浓度IM作用于两株细胞相同时间,K562/G细胞凋亡比例低于K562(P<0.05).RT-PCR结果显示K562/G细胞中STAT5A和STAT5B水平均高于K562(P=0.000 1、0.017 0).Western blot结果表明K562/G细胞中STAT5蛋白水平显著升高(P=0.009 0).结论 STAT5在慢性髓细胞白血病中高表达,STAT5-ROS通路的活化与K562细胞IM耐药密切相关.     

塞来昔布对K562白血病细胞的细胞毒作用及与伊马替尼的协同效应

目的 研究塞来昔布（Celecoxib）对K562细胞增殖、早期凋亡的影响及Rb蛋白质（PRb）、P27^Kip蛋白质表达变化,观察Celecoxib和伊马替尼联用对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导是否具有协同效应.方法将K562细胞用不同浓度的Celecoxib（0、10、20、40、80及160μmol/L）作用36 h,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）测定细胞活力;磷脂结合蛋白Ⅴ分析检测K562细胞早期凋亡;Western印迹检测不同浓度Celecoxib对K562细胞PRb和P27^Kip蛋白质表达的影响;用40 μmol/L Celecoxib、0.2μmol/L伊马替尼分别或联合作用K562细胞,观察药物对细胞活力和凋亡诱导是否具有协同作用.结果Celecoxib能明显抑制细胞活力,并呈药物剂量依赖性：随着Celecoxib浓度增高,K562细胞凋亡百分率相应增高,在160μmol/L浓度,凋亡率达25.92%,蛋白质印迹结果显示,Celecoxib可使K562细胞PRb蛋白质表达呈浓度依赖性下调;P27^Kip蛋白质呈浓度依赖性上调.Celecoxib与伊马替尼联用,抑制K562细胞活力为对照组的27.68%.结论Celecoxib能以浓度依赖性方式抑制K562细胞增殖,诱导细胞凋亡;其抗增殖效应可能与PRb表达下调及P27^Kip表达上调有关.Celecoxib与伊马替尼联用,在抗白血病细胞增殖作用上具有显著的协同效应.     

慢性粒细胞白血病患者血清α1-酸性糖蛋白水平、伊马替尼谷浓度与疗效的关系分析

目的探究慢性粒细胞性白血病(CML)患者伊马替尼(IM)谷浓度、血清α1-酸性糖蛋白(AGP)与临床治疗效果的关系。方法选取2012年8月至2015年8月安阳市肿瘤医院收治的40例CML患者,设为研究组,全部使用伊马替尼进行治疗;选取同期来院献血的40例健康者,设为对照组。分别为对照组和研究组取空腹静脉血进行AGP(免疫比浊法)和IM(液相色谱质谱法)水平测定。结果研究组不同疗效患者IM谷浓度和AGP水平均高于对照组,且加速急变期>NR>复发>CHR>CCR,差异有统计学意义(P<0.05)。IM谷浓度与AGP水平呈正相关(P<0.05)。研究组患者各时间点IM谷浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CML患者血清α1-AGP水平和IM谷浓度存在正相关,使用伊马替尼治疗CML可使AGP水平下降,临床可以通过测定上述指标来判断患者CML病情程度。     

鞘氨醇激酶1在乳腺癌骨髓中的表达及临床意义*

目的 探讨鞘氨醇激酶1（SPHK1）在乳腺癌患者骨髓中的表达及临床意义。方法 选取2016年6月—2018年6月长沙市第一医院诊治的90例乳腺癌患者、52例乳腺良性肿瘤及20例健康体检者骨髓,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及Western blotting检测骨髓中SPHK1的表达。结果 90例乳腺癌患者中骨髓SPHK1阳性68例（75.6%）,高于良性乳腺肿瘤组（13.5%）及健康对照组（5.0%）（P?<0.05）;乳腺癌患者SPHK1 mRNA表达水平高于良性乳腺肿瘤患者和健康对照组（P?<0.05）;乳腺癌患者SPHK1蛋白含量为（1.657±0.198）,高于良性乳腺肿瘤组患者（0.963±0.132）和健康对照组（0.749±0.128）（P?<0.05）;以病理活检为金标准,骨髓SPHK1诊断敏感性为75.6%,特异性为86.5%。经Kappa检验κ值为0.59,具有较好的一致性。结论 乳腺癌患者骨髓中SPHK1表达升高,SPHK1的检测有助于早期检测乳腺癌患者的骨髓转移。     

4-氯苯甲酰小檗胺体内外抑制伊马替尼耐药K562细胞增殖的作用及机制

目的研究4-氯苯甲酰小檗胺(BBD9)体内外抑制伊马替尼(IM)耐药k562细胞(K562/IR)的增值作用,并探讨其机制。方法 MTT法测定BBD9和小檗胺(BBM)IC50以比较药效。0.5μg/ml BBD9或8μg/ml BBM处理体外培养K562/IR细胞48 h Western blot检测p210Bcr-Abl,IKKα,胞浆和胞核NF-κBp65表达水平。不同浓度BBD9处理体外培养的K562/IR48 h后流式测定细胞存活,凋亡,坏死比例;Western blotting检测PARP、Caspase3、Caspase9和LC3II表达水平。裸鼠移植瘤模型组1(15 mg/kg BBD9)、组2(30 mg/kg BBD9)、组3(100 mg/kg IM)和对照组(不给药)中移植瘤的瘤质量、瘤消退率和裸鼠体质量检测。结果 BBD9和BBM IC50分别为0.73μg/ml和5.43μg/ml。0.5μg/ml BBD9或8μg/ml BBM处理48 h后p210Bcr-Abl,IKKα和胞核NF-κBp65表达均下降且以BBD9更明显(P<0.05),胞浆NF-κBp65基本一致。细胞凋亡,坏死均和BBD9呈计量依赖;活化的PARP,Caspase3,Caspase9和LC3 II也随着药物浓度增加而升高(P<0.05)。裸鼠移植瘤瘤质量、瘤消退率、和体质量等指标BBD9给药组优于IM给药组(P<0.05)。结论 BBD9对K562/IR体内外均能起效,抑制p210Bcr-Abl,IKKα表达和胞浆NF-κBp65向胞核转位,并激活凋亡,坏死,自噬等多条死亡通路。     

棘霉素对KBV200细胞作用的初步研究

目的初步研究棘霉素(echinomycin)对KBV200细胞(耐长春新碱的口腔癌细胞)的作用及其作用机制。方法采用MTT法及流式细胞仪分别检测KBV200细胞的增殖和凋亡;用同位素掺入、Western blot、RT-PCR等方法分别检测鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达。结果棘霉素可诱导KBV200细胞的凋亡,流式结果出现DNA亚二倍体凋亡峰;棘霉素对鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达有不同程度的抑制作用。结论棘霉素对KBV200细胞有细胞毒作用,其作用机制与抑制鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧诱导因子的表达有关。     

伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株抗肿瘤效应的比较研究

目的 比较研究化疗药物伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株K562(髓系白血病细胞株,表达P210蛋白)和SUP-B15(急性淋巴细胞白血病细胞株,表达P190蛋白)的抗肿瘤效应.方法 采用MTT法测定不同浓度的伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用72 h后两种细胞株的增殖活性,并计算3种化疗药物对两种细胞株作用的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测不同浓度伊马替尼作用48 h后两种细胞株bcr-abl基因表达的改变.结果 ①不同浓度伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用K562和SUP-B15细胞株72h,其对细胞株的IC50值分别为(0.286±0.060)μmol/L、(0.303±0.009)μmol/L、(22.127±3.592)nmol/L和(1.387±0.180)μmol/L、(0.117±0.017)μmol/L、(12.35±0.740)nmol/L,提示伊马替尼对K562细胞敏感性明显高于SUP-B15细胞,而柔红霉素对SUP-B15更敏感,硼替佐咪对两种细胞的敏感性无差异;②伊马替尼0、0.35、1.0μmol/L作用48 h后,两株细胞bcr-abl基因表达均无明显变化.结论 伊马替尼、柔红霉素、硼替佐咪对Ph(+)细胞株K562和SUP-B15均有较好的抗肿瘤效应,伊马替尼对K562更敏感,而柔红霉素和硼替佐咪对SUP-B15均有较好的抑制作用,短时间伊马替尼作用后不影响bcr-abl基因的表达.     

桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用及机制研究

目的探讨桔梗皂甙D（platycodin,PD）与伊马替尼（imatinib,IM）联合用药抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562的作用及机制研究。方法体外培养CML细胞株K562,CCK-8测定PD和IM单药及联合用药对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测AnnexinV/PI标记的细胞凋亡率,Westernblot方法检测cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、PARP、cleavedPARP、Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR蛋白表达。结果联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡率较单独用药组效果明显,差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、cleavedPARP蛋白表达,同时下调PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达,差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）。结论PD与IM联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和PI3K/AKT/mTOR信号通路方面明显优于单独用药。