肠道病毒71型的分子流行病学研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)自1974年首次报道以来[1],全世界很多国家和地区,如保加利亚、日本、韩国、新加坡、法国、澳大利亚、马来西亚均报告了EV71的流行[2-9].近年来,有研究表明EV71在亚太地区的流行呈上升趋势,已引起人们的广泛关注.在我国,2007年的山东及2008年的安徽、广东的EV71大规模流行,上万名婴幼儿感染,几十名婴幼儿死亡.现在,EV71已取代脊髓灰质炎病毒成为最主要的婴幼儿中枢神经病毒病原.本文主要就EV71分子流行病学特征方面作一综述,以探索基因变化对EV71流行、致病的影响.     

肠道病毒71型实验室诊断研究进展

人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,最早是于1969 -1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到[1],之后世界上许多国家相继报道了EV71感染的流行,HFMD与EV71感染的关系也受到了广泛的重视.EV71与柯萨奇病毒(coxsackievirus)引起的手足口病不同,其感染性强、致病率高,是目前除脊髓灰质炎病毒以外导致婴幼儿神经系统疾病感染最重要的病原体,感染后可导致手足口病、无菌性脑膜炎、肺炎、疱疹性咽峡炎等,以上症状在患者中所占的比例分别为83％、11.1％、0.6％和1.2％[2].     

人类肠道病毒71型的研究进展

肠道病毒71型是引起手足口病的主要病原体之一,其感染还可导致多种与神经系统相关的疾病,致残率及病死率较高.近年来,EV71感染在全球范围呈现上升趋势,2008年我国也有较大规模流行.本文对EV71的病原学特征、流行病学特征以及相关最新研究进展等方面作一综述.     

抗肠道病毒71型感染药物的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)的主要病原体,临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症[1].5岁以下的儿童感染后易发生严重的并发症,如无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等,这些并发症可导致死亡或永久性麻痹[2].至今,在全球许多国家发生了EV71感染的暴发,造成病例大量死亡[3-4].目前对于EV71感染既无有效的疫苗,也无明确有效的抗病毒药物[5-6].该病毒的复制周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配与释放,这些过程都可能成为抗病毒药物设计的靶点,按照作用的靶点不同将目前研究的抗EV71药物分为以下几个方面进行综述.     

2016年我院儿童病院肠道病毒71型感染情况调查

目的 分析我院儿童病院肠道病毒71型的感染现状,了解手足口病的流行病学特征。方法 2016年我院采集儿童病院抗EV-71抗体血样共1645 例。运用描述流行病学的方法和Excel软件对上述数据进行回顾性调查分析。结果 2016年儿童病院1645 名研究人群中,抗EV71 IgM的阳性率为 12.52%。其中4岁组抗EV71 IgM的阳性率（3.34%）最高;高发月份为6月份,发病率23.83%。阳性病例男性（51.94%）多于女性（48.06%）。结论 手足口病发病有明显时间、人群分布特点,需重点加强校医及园医培训,提高综合素质和识病、防病能力。     

深圳市肠道病毒71型血清流行病学初步调查

目的探讨深圳市不同人群肠道病毒71型血清流行病学规律。方法收集1999—2003年深圳地区正常人血清584份，按年龄0-岁、1-岁、2-岁、5-岁、15-岁和〉30岁分成6个组，用ELISA方法对其肠道病毒71型抗体进行检测。结果1999—2003年深圳地区正常人血清中肠道病毒71型抗体阳性率最高的年龄组为5-岁组，阳性率超过50％；15-岁和〉30岁组血清阳性率分别为47．7％和39．8％；2．岁血清阳性率约为30％，其中0-岁和1-岁两个低年龄组的血清阳性率最低。不超过20％。结论5岁以下低年龄儿童是肠道病毒71型的易感人群。     

肠道病毒71型预防性疫苗的研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是手足口病的主要病原体,感染后主要发病人群是5岁以下的学龄前儿童.EV71最初于1969年由Schmidt等从美国加利福尼亚州1名9个月的脑炎患儿的粪便中分离出,并于1974年首次报道[1]之后在世界范围内多次出现EV71感染的周期性暴发和流行.近年来,EV71的流行在亚洲地区呈上升趋势,人们开始越来越关注EV71的流行和预防.但是对于手足口病,目前尚无有效的抗病毒治疗策略,发展EV71疫苗是控制手足口病流行的首选措施.本文就目前的EV71疫苗的研究发展做一个简要综述.     

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的 自1例死亡患儿的标本中分离EV71,并分析其全基因组序列特点,研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关.方法 咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿,在人横纹肌瘤细胞(RD)上分离EV71,分段扩增获得EV71的全序列,用BLAST、Bioedit和MEGA 4进行序列分析.结果 获得1株EV71分离株SDLY107,基因组全长7405 bp,全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang.Anhui.P.R.C/17.08/2同源性最高,为98.6%,与原型株BrCr/70的同源性为80.0%,与神经毒型株MS/87的同源性为86.5%.系统进化分析表明,SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近,按照传统的VP1基因分型方法,可归为C4亚型,是近年来我国大陆流行的主要基因亚型.氨基酸序列分析发现,SDLY107与其他毒株相比,有2个特有的突变(E947D,K1873R).结论 SDLY107分离株属于C4亚型,氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关.

Abstract：

Objective To isolate enterovirus 71 from a death children,and analyze whether the neurovirulence was related to the variation of nucleotide and amino acid. Methods Enterovirus 71 was isolated from throat swabs which were colleted from Shandong Linyi People's Hospital. The full length genome was sequenced by amplification with RT-PCR and sequencing of 9 overlapped gene fragments covering full length of the genomes. The nucleotide and amino acid sequenced was aligned by BLAST, Bioedit and MEGA 4. Results A strain of enterovirus 71 was isolated and named as SDLY107. The full length was 7405 bp. The results of homology analysis of overall nucleotide sequence showed that strain Fuyang. Anhui. P. R. C/17.08/2 had highest homology (98.6%)with strain SDLY107, and the homology was 80.0% between strain SDLY107 with prototype strain BrCr/70,and 86. 5% between strain SDLY107 with nerve strain MS/87. Phylogenetic analysis showed that the phylogeny was close between SDLY107 with some isolated strains from Chinese Mainland, such as Beijing, Henan, Guangxi, Sbenzhen, Lanzhou, Fuyang, Chongqing and Zhejiang strains, which was clustered for C4 subtype. The results of amino acid sequence analysis showed that there were 2 mutations, E947D and K1873R, for strain SDLY107. Conclusion SDLY107 belonged to C4 subtype, amino acid mutations E947D and K1873R of which may be relevant to the pathogenicity of EV71.     

重症71型肠道病毒感染手足口病的临床表现特点及综合护理探讨

目的 分析重症71型肠道病毒感染手足口病的临床表现特点及综合护理措施.方法 收集我院2013年5月-2014年5月期间诊治的重症71型肠道病毒感染手足口病患者58例作为研究对象,采用回顾性方法分析患者的临床资料,总结临床表现特点和综合护理措施.结果 研究结果显示,病毒71型手足口病患儿主要分布于1～3岁的婴幼儿群体,临床表现主要为皮疹和发热,大部分患儿合并有肢体抖动及易惊.通过对患儿实施隔离观察、生命体征监测、口腔护理、并发症预防等综合性护理干预后取得了良好的临床效果,患儿的发热、皮疹等临床症状得到明显的缓解,白细胞、血糖水平均恢复正常,护理前后比较差异具有统计学差异(P＜0.05).结论 重症71型肠道病毒感染手足口病主要发生于婴幼儿群体,患儿的临床表现主要为皮疹、发热,通过对患儿实施隔离观察、生命体征监测、口腔护理、并发症预防等综合性护理干预可获得良好的临床效果.     

抗肠道病毒71型特异性卵黄抗体的制备及鉴定

目的:制备特异性抗肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的卵黄抗体并检测其生物学性能,这对EV71感染手足口病的预防和治疗具有重大的意义。方法:用纯化并灭活后EV71作为抗原免疫健康产蛋鸡。采用本实验室水提综合聚乙二醇法提取纯化鸡卵黄抗体;用Bradford法测定卵黄抗体提取液的蛋白含量;还原性SDS-PAGE凝胶电泳分析测定提取蛋白的纯度及相对分子质量;分别用ELISA、双向免疫琼脂扩散检测纯化特异性卵黄抗体抗EV71效价;Western blot分析特异性卵黄抗体的免疫反应性。结果:卵黄中卵黄抗体含量达7.76 mg/ml,卵黄抗体的纯度为94.86%。初免10天后蛋黄中可检测到特异性抗EV71卵黄抗体,初免40天后ELISA检测抗体效价高达1∶20 480,双向琼脂扩散检测效价达1∶16。提取的卵黄抗体具有良好的免疫反应性,能与EV71特异性结合。结论:水提综合聚乙二醇法提取纯化得到的抗EV71卵黄抗体产量和纯度高、效价好且具有良好的免疫反应性。     

2008年广东省肠道病毒71型分离株全基因组核苷酸序列分析

目的 了解2008年广东省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征.方法 选择2008年广东省分离的1株EV71毒株(GDFS-3),进行全基因组序列测定和基因进化特性的分析.结果 GDFS-3株与其他EV71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5'UTR和3'UTR的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与中国台湾流行株(TW984)的同源性最高(为96.0%),与新加坡流行株SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81.0%左右.氨基酸同源性比较结果 表明,GDFS-3株与TW984同源件最高(99.0%).根据VP1基因序列构建亲缘性关系树,GDFS-3株与C4亚型(subgenogroup)聚为一簇,与C4亚型代表株的核苷酸序列同源性为91.0%～95.0%.结论 遗传进化分析表明,GDFS-3株和中国台湾2004年流行的EV71毒株的亲缘关系最为密切,属于C4亚型,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.5'UTR的突变对于EV71毒力增强可能有重要作用.上述结果 有助于EV71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体水平调查

目的调查广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体IgG（EV71-IgG）的水平,分析与EV71所致手足口病（HFMD）发病的关系。方法以来源于广州市妇女儿童医疗中心（我院）中心实验室分离到的EV71 C4亚型标本,制备EV71诊断抗原,建立EV71-IgG抗体诊断试剂盒方法,并进行实验室评价。收集2010年1~3月在我院儿保科抽血进行常规保健检测的标本,筛选出无发热、无HFMD症状的健康儿童血清标本,检测EV71-IgG抗体。选取我院2010年全年门诊及住院HFMD患儿的咽拭子标本进行EV71特异性核酸检测。结果①本研究建立的试剂盒EV71-IgG抗体检测临界值为0.148;与细胞中和实验方法阳性符合率为100%,阴性符合率为92%,与柯萨奇A16病毒抗体无交叉反应。②819名健康儿童血清标本中,男481名,女338名。〈1岁组（60%,60/100名）和~2岁组（39.3%,72/183名）EV71-IgG抗体阳性率显著高于其他各年龄组[~3岁、~4岁、~5岁和~14岁组分别为12.9%（15/116名）、27.1%（38/140名）、14.2%（16/113名）和22.8%（38/167名）]。EV71-IgG抗体阳性率无显著性别差异。③4 780例EV71阳性HFMD患儿中,男3 070例,女1 718例。〈1岁310例（6.5%）,~2岁1 157例（24.2%）,~3岁1 337例（28.0%）,~4岁1 094例（22.9%）,~5岁450例（9.4%）,~14岁432例（9.0%）。④各年龄组EV71-IgG抗体阳性率与EV71阳性年龄构成比呈相反趋势,〈1岁组EV71-IgG抗体阳性率最高,EV71阳性年龄构成比最低;~3岁组EV71-IgG抗体阳性率最低,EV71阳性年龄构成比最高。结论 〈1岁健康儿童EV71-IgG阳性率最高,EV71阳性年龄构成比与EV71-IgG阳性率呈相关现象。     

菏泽市手足口病儿童病例肠道病毒71型抗体水平分析

目的分析手足口病低龄儿童病例的肠道病毒71型（EV71）感染状况。方法采集手足口病（HFMD）病例的血样,通过ELISA间接法检测EV71 IgG和IgM抗体并分析年龄、性别分布情况。结果收集到159例HFMD儿童病例的血样和资料,年龄为1—5周岁,平均EV71 IgG抗体阳性率为63．5％,无性别差异,平均IgM抗体阳性率为12．0％;EV71 IgG阳性率随着年龄增长而呈降低趋势,男童的IgM阳性率显著高于女童。结论本次HFMD疫情的病原体是EV71,男性儿童的EV71感染发病率高于女性儿童,结果可为HFMD防治提供参考依据。     

青海省分离到肠道病毒71型及其VP1区基因特征分析

目的 研究2008年青海省手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）的致病病原体中肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,HEV71）的VP1区基因特征.方法 采集青海省HFMD患者的粪便、疱疹液和咽拭子标本共335份,并进行病毒分离,然后对阳性分离株病毒进行肠道病毒血清型别的分子定型.对分离到的HEV71阳性分离株进行VP1编码区基因扩增,核苷酸序列测定和同源进化分析.结果 在335份临床标本中,共分离到45株阳性病毒分离物,其中30株鉴定为HEV71（占66.7%）,是主要病原体.对30株HEV71进行VP1区核苷酸序列测定后,分析发现它们在VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上有一定差异,同源性分别在95.2%～100.0%和96.6%～100%之间.它们与1998年以来在我国分离的HEV71在核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高.与其他35株各基因型和基因亚型的HEV71代表株构建的亲缘进化树中显示,青海省HEY71分离株与C4亚型代表株聚为一簇,属于C4基因亚型C4a进化分支.结论 青海省从HFMD病例中分离到HEV71,也确认了青海省HFMD的病原体HEV71流行株的基因型为C4基因型中的C4a进化分支,并且存在多个传播链.     

肠道病毒EV71感染重症儿童的病理学特点

2008年3月底至4月初,安徽阜阳地区出现以"重症肺炎"为主要临床表现的患儿,并出现连续死亡病例,引起当地医务界及社会和各级政府部门的广泛关注.卫生部、中国CDC等部门积极组织各领域专家查找病因,研究防治对策.经检测发现本次疾病流行是以肠道病毒71 (enterovirus 71,EV71)感染为主的手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD).政府相关部门很快制定一系列防控措施,临床及时调整治疗方案,此后,尽管仍有EV71流行,仍有重症患儿出现,但死亡病例明显减少至无.在此期间,我们进行了部分EV71感染死亡患儿的尸体解剖,并及时与临床医生交流,为双方更好地认识疾病提供了一定的病理依据.本文拟结合尸体解剖病理改变对EV71重症病例进行分析和介绍.     

2008至2009年北京地区分离的肠道病毒71型全基因组序列分析

目的了解2008至2009年从北京地区手足口病（HFMD）患儿分离到的肠道病毒71型（EV71）全基因组序列特点（未包括多聚腺苷尾）,以探讨基因序列的改变是否与病毒的致病性有关。方法选取首都儿科研究所病毒研究室2008年分离到的5株EV71毒株和2009年分离到的4株EV71毒株,其中4株来源于重症HFMD患儿（伴高热、持续抽搐及意识丧失等中枢神经系统症状）,5株来源于轻症HFMD患儿。设计覆盖病毒全基因组的10对特异性引物,对9株EV71毒株进行RT-PCR扩增、全基因组序列测定和分析。结果 9株EV71毒株的全基因组长度为7406bp或7405bp,部分毒株在5′UTR存在1处1个碱基的缺失。9株EV71毒株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为96.3%～99.4%和98.2%～99.6%,在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为96.9%～99.9%和98.3%～100.0%。重症HFMD来源的4株毒株中有3株在VP2蛋白第144位及3D聚合酶（3Dpol）第140和263位同时出现相同的氨基酸变异（T144S、R140K和I263V）,并且在5′UTR区第208和254位同时出现相同的碱基变异（G208A和A254G）。9株EV71毒株的全基因组与C4亚型毒株具有最高的核苷酸同源性,在VP1区为94.3%～95.5%;在3D及3′UTR区与CV-A16/G10的同源性（84.3%～85.0%和89.0%～91.5%）高于与EV71-B型、A型及C型（C1～3、C5）的同源性。VP1和3D基因的遗传进化分析显示,9株EV71毒株与C4亚型毒株属同一分支。结论 VP2蛋白第144位氨基酸突变（T→S）、3Dpol第140和263位氨基酸突变（R→K和I→V）及5′UTR区第254位碱基突变（A→G）可能与EV71感染后引起的不同临床症状有关。根据VP1核苷酸序列,2008至2009年北京地区流行的EV71属于C4亚型;非结构蛋白基因在EV71进化中可能有一定的作用。     

肠道病毒71型的生物学特征与实验室诊断

肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)感染可以导致手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)、无菌性脑膜炎(asepicmeningitis)、脑炎(encephalitis)和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病(poliomyeli-tis-like paralysis)等多种神经系统疾病.早期、快速、准确的诊断对EV71的预防和隔离至关重要.随着分子生物学技术的发展,基因芯片技术因具有高通量性、快速、准确性强等特点,成为新兴的病毒检测技术.     

济南市手足口病患者肠道病毒71型的分离与鉴定

目的 从13例2008年、2009年济南市HFMD患者的粪便标本中分离获得EV71病毒并对其基因型进行鉴定.方法 按照中国疾病控制预防中心<手足口病标本采集及检测技术方案>的规定对标本中的病毒进行分离和鉴定,对VP1编码基因的部分核苷酸序列进行测序分析.结果 分离到6株EV71病毒,均与EV1 C4亚型处于同一进化树分支上,与C4亚型的核酸同源率均大于96%.结论 济南地区流行的EV71主要为C4亚型,与2008年中国流行的C4亚型EV71相比并未出现明显突变,引起重症的毒株与未引起重症的毒株相比,在VP1蛋白部分片段上没有发现明显的氨基酸差异.