脐血单个核细胞体外向神经干细胞的诱导及Foxg1基因的表达

目的探讨人脐血单个核细胞（UBC-MNCs）体外向神经干细胞（NSCs）的诱导分化机制及NSCs中Foxg1基因表达的意义。方法从脐血中分离出UBC—MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasa1培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察NSCs形态学及增殖分化特点;免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP的表达情况,BrdU标记靶细胞;RT-PCR法检测分离后、培养3、6、9、12d细胞中Foxg1基因的表达。结果UBC—MNCs可定向诱导分化为神经元样细胞,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原。Foxg1 mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高（P〈0．05）,6d达高峰,之后逐渐下降（P〈0．05）。结论体外定向诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,Foxg1基因是NSCs增殖分化关键调控因子,脐血可成为NSCs的新来源。     

人脑胶质瘤干细胞的培养及分离方法

目的探讨人脑胶质瘤干细胞的培养和分离方法。方法取脑胶质瘤手术标本,制成单细胞悬液用无血清培养基培养,加入表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行诱导分化;用免疫组化法检测巢蛋白（Nestin）和胶质原性纤维酸蛋白（GFAP）;用免疫磁珠分选系统进行细胞分离,流式细胞仪检测分化前后CD133阳性细胞的比率。结果培养出悬浮生长的人脑胶质瘤干细胞球,Nestin表达呈阳性,分化后GFAP表达呈阳性;分离前CDm阳性细胞百分比为4．66％±0．55％,分离后为87．21％±6．17％,P〈0．05。结论无血清培养法、免疫磁珠分选系统可成功培养和分离人脑胶质瘤干细胞。     

ATRA诱导鼠胚神经干细胞向神经元分化过程中Notch1的表达变化及意义

目的观察全反式维甲酸（ATRA）体外诱导鼠胚神经于细胞（NSCs）分化为神经元过程中Notch1的表达变化,并探讨其机制。方法将NSCs分为两组,观察组加入终浓度为1．0μmol／L的ATRA,对照组不加ATRA。采用免疫细胞化学法检测NSCs地Notch1蛋白,采用实时荧光定量PCR法检测NSCs Notch1 mRNA。结果观察组NSCs经ATRA诱导3、5、7、9d,Notch1蛋白积分光密度值分别为539．43±13．46、488．67±13．12、437．54±13．10、434．32±13．04,Notch1 mRNA相对表达量分别为0．4122±0．0802、0．2164±0．1252、0．0221±0．1355、0．0177±0．0061;对照组分别为591．35±15．61、0．6243±0．2745,与对照组相比,P均〈0．05。结论在ATRA体外促鼠胚NSCs分化为神经元过程中,Notch1表达减少;ATRA诱导NSCs向神经元的分化与抑制Notch信号途径有关。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化的特点。方法使用稀释浓度为200mg／ml的黄芪注射液诱导BMSCs，分别在1、3、6d倒置显微镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法观察巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。结果诱导后可见细胞形态发生改变，自胞体长出突起，随诱导时间延长，长出突起的细胞数量增多，突起进一步伸长，部分突起末端呈分叉状，可见网络状连接。免疫细胞化学示：nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞在诱导第3天较多，MAP-2阳性细胞在第6天较多。结论黄芪首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并促进已分化的细胞进一步成熟、老化。     

脑缺血再灌注恢复期大鼠梗死周围组织GFAP、NSE、SYN、Nogo—A表达与神经功能转归的相关性

目的探讨脑缺血再灌注恢复期大鼠梗死周围组织胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、神经元特异性烯醇化酶（neuron—specific enolase,NSE）、突触素（synaptophysin,SYN）、神经突生长抑制因子-A（neurite outgrowth inhibitor—A,Nogo—A）表达与神经功能转归的相关性。方法线栓法制作大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）2h再灌注模型,模型制作后28、35、42和49d改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score,mNSS）,并采用免疫组化方法检测脑梗死周围组织GFAP、NSE、SYN、Nogo—A表达。结果大鼠脑缺血再灌注后随着时间推移,mNSS评分逐渐下降,除第35天（5．11±0．737）与第42天（4．54±0．519）、第42天与第49天（4．29±0．488）无显著差异外,其余各时间点均有显著差异（P均〈0．05）。GFAP阳性细胞数量从第28天至第49天逐渐减少,其中第42天（51．00±13．59）和第49天（44．38±11．94）显著少于第28天（69．00±15．10）（P〈0．05）。NSE表达的累积光密度（integrated optical density,IOD）逐渐增高,第28天（6218．57±1864．25）与第42（9414．00±2491．12）和第49天（12522．50±3106．99）,第35天（7343．40±1533．35）与第49天差异显著（P均〈0．05）,其余各时间点无显著差异。SYN表达IOD逐渐增高,第49天（66503．00±12834．61）显著高于第28天（43905．14±13208．59）（P〈0．05）。Nogo-A阳性细胞数量逐渐减少,第49天（42．13±14．45）显著少于第28天（59．57±15．25）（P〈0．05）。GFAP表达与mNSS评分呈正相关（r=0．993,P=0．007）,NSE（r=～0．954,P=0．044）、SYN（r=-0．992,P=0．008）表达与mNSS评分呈负相关。结论大鼠脑缺血再灌注后恢复期神经功能转归与GFAP表达下调、NSE和SYN表达上调相关。     

刺参黏多糖对Hela细胞PCNA表达及细胞周期的影响

目的研究刺参黏多糖（SJAMP）对体外培养的Hela细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达及细胞周期的影响。方法用免疫组织化学法测定SJAMP对体外培养的Hela细胞作用后的PCNA表达水平，用流式细胞术测定细胞周期变化，并与甲氨蝶呤（MTX）比较。结果SJAMP、MTX均可使体外培养的Hela细胞PCNA表达水平明显降低，还可以使细胞周期发生明显的变化，干预组Hela细胞停留在G．期的比例要比未干预组明显增加（P〈0．05），而S、G2期的细胞比例比未干预组则明显减少（P〈0．05）。结论SJAMP有下调Hela细胞PCNA表达水平，阻滞细胞周期的作用。     

三种方法体外同步分离培养大鼠肝枯否细胞和星状细胞的比较

目的比较淋巴细胞分离液（LS）、Percoll液（PS）和Nycodenz液（NS）同步分离培养大鼠肝枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）的优缺点。方法①采用链酶蛋白酶E、胶原酶Ⅳ联合原位灌流消化，分别以LS、PS和NS的非连续密度梯度离心法同步分离培养大鼠KC和HSC。②碳素墨汁吞噬试验鉴定KC；α-SMA免疫细胞化学染色法鉴定HSC。③倒置相差显微镜下观测细胞形态，台盼蓝染色显示细胞活性，计数后计算细胞的得率、存活率和纯度。结果体外成功地同步分离培养了KC和HSC；培养的KC吞噬功能明显，而传代HSCα—SMA免疫细胞化学染色阳性者几乎达100％；采用PS或NS体外同步分离KC的细胞得率和纯度均显著高于采用LS分离细胞所得（P〈0．01），而采用NS体外同步分离肝KC的细胞存活率显著高于PS或LS分离细胞的存活率（P〈0．05）；分别采用LS、PS和NS同步分离HSC，三者的细胞存活率逐次升高（P〈0．05或P〈0．01），而使用LS同步分离的细胞虽然细胞得率比较高（P〈0．05），但其细胞纯度较使用PS和NS明显降低（P〈0．05），PS和NS分离获得的HSC得率和纯度均无明显统计学差异。结论采用Percoll液和Nycodenz液体外同步分离培养大鼠肝KC和HSC效果好，且后者的细胞存活率最高。     

胎鼠胰腺干细胞体外对胰岛的保护作用观察

目的观察胎鼠胰腺干细胞体外对胰岛功能的保护作用。方法将孕16d的sD大鼠胎鼠胰腺干细胞分离、纯化、培养传代,免疫细胞化学法及流式细胞术鉴定;分离纯化sD大鼠胰岛,双硫腙鉴定后分为A组和B组,分别行单纯胰岛培养及胰岛与胰腺干细胞联合培养14d,期间观察胰岛形态变化、检测胰岛存活率及细胞凋亡率,ELISA法检测胰岛素分泌量、计算刺激指数。取两组培养7d后悬浮生长的胰岛移植入糖尿病大鼠左肾包膜下,术后每天尾静脉采血以快速血糖测试仪检测血糖。结果胎鼠胰腺干细胞培养传代3代后免疫细胞化学可见巢蛋白（Nestin）阳性细胞,流式细胞术测定其含量占74．1％;培养第7、14天时B组胰岛存活率显著高于A组（P均〈0．01）,培养第7天时B组胰岛细胞凋亡率显著低于A组（P〈0．05）;培养第7、14天时B组高糖刺激后胰岛素分泌量及刺激指数均显著高于A组（P均〈0．01）;B组移植后大鼠血糖第5天降至正常。结论胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合培养可明显延长胰岛体外存活时间并使其保持良好的活性。     

改良型生物硅胶膜对大鼠神经干细胞增殖与分化的影响

目的观察改良型生物硅胶膜对神经干细胞（NSCs）增殖与分化的影响,为选择NSCs培养载体提供依据。方法选取孕16d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,建立胚胎NSCs的体外培养体系并随机分为观察组和对照组,其中观察组接种于改良型生物硅胶膜上、对照组接种于普通培养皿中。普通倒置显微镜及电镜下观察细胞生长发育形态学变化,免疫荧光染色技术对NSCs及诱导分化细胞进行鉴定,四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测细胞增殖情况。结果培养2d后,显微镜下两组均可见神经细胞球生成,贴壁良好,细胞球边缘有突起呈辐射状向外发出,神经球NSCs特异标志物神经巢蛋白均呈阳性;培养7d后,观察组和对照组贴壁分化的神经元烯醇化酶阳性细胞率分别为25．14％±1．98％、24．67％±2．05％,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞率分别为59．48％±2．07％．60．87％±1．08％,组间比较,P均〉0．05;两组生长曲线亦无显著差异（P〉0．05）。结论改良型生物硅胶膜对NSCs的生长、增殖及诱导分化无明显影响,但能促进细胞之间突起的增长,可作为培养载体用于研究力学因素对NSCs增殖、诱导分化的影响。     

脑组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

目的模拟体内微环境,研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在脑组织匀浆诱导下向神经样细胞的分化程度。方法体外分离、培养、扩增hUCMSCs,流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD44、CD45、CD105、CD34、HLA-DR;制备大鼠脑组织匀浆与hUCMSCs共培养,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,并应用免疫细胞化学技术检测共培养3 d后细胞内神经干细胞表面标志物巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果脑组织匀浆培养hUCMSCs后,细胞表达nestin、NSE及GFAP,而正常培养的hUCMSCs不表达。结论脑组织匀浆可以诱导hUCMSCs向神经样细胞分化。     

丹参酮ⅡA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化能力的影响。方法扩增传代至第3代的SD大鼠BMSCs向成骨诱导分化培养,分为实验组和对照组,采用MTT比色法检测细胞的增殖能力;采用RT—PCR方法检测成骨相关细胞因子mRNA的表达;通过钙结节染色对比观察细胞形态情况。结果实验组各浓度TanⅡA较对照组BMSCs增殖速度提高（P〈0．05）,细胞增殖速率随TanⅡA浓度的增高而加快（P〈0．05）;实验组各浓度TanⅡA成骨相关细胞因子mRNA的表达较对照组提高（P〈0．05）;钙结节染色观察TanⅡA各浓度组均阳性显色,对照组显色不明显。结论TanⅡA能够提高体外培养的BMSCs增殖速率,对BMSCs向成骨细胞分化有明确的诱导作用,缩短骨细胞的成熟时间。     

刺槐素对小鼠Th17细胞的分化功能的影响及其机制的初步探讨

目的建立小鼠Thl7细胞的体外诱导及培养方法并探索刺槐素（Acacetin）对Th17细胞的分化、功能的影响及其机制的初步探索。方法分离、纯化BABL／c小鼠脾脏%细胞,用转化生长因子8、IL-6、IL-23等促进%细胞向Thl7细胞分化。培养的Th17细胞分为五组：正常组、模型对照组、Acacetin1μM组、Acacetin10μM组、Acacetin30pM组。流式细胞术检测Thl7细胞的比例,酶联免疫吸附试验检测IL-17A的表达,实时荧光定量聚合酶链反应检测IL-17AtuRNA及ROR-γtmRNA的表达。结果该培养方法可使Th17细胞的比例明显升高（P〈0．01）。与模型对照组相比,AcacetinlμM组、Acacetin10μM组、Acacetin30肛M组的Thl7细胞的比例呈剂量依赖性降低（P值均〈0．05）。IL-17A蛋白的表达也呈剂量依赖性降低（P值均〈0．05）,IL-17AmRNA和ROR-γtmRNA的表达与模型对照组比较明显降低（P〈0．05）,以Acacetin（30uM）组最明显（P〈0．01）。结论Acacetin在体外可以抑制小鼠脾脏%细胞向Thl7细胞的分化,并抑制IL-17AmRNA和IL-17A蛋白的表达,其机制可能与抑制细胞内孤儿受体ROR-γt的表达有关。     

大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究

目的：比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞（MSC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同。方法：采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血骨髓的单个核细胞（MNC），收获MSC传代培养，流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化，免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异。定向诱导后，2种细胞均表达Nestin、NSE，但GFAP阴性。结论：大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者诱导分化为神经元碰细胞的能力无显著差异。胎血应是MSC的又一来源。     

银杏叶提取物对大鼠神经干细胞分化为神经元样细胞的影响

目的 观察银杏叶提取物(EGB)对大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖及分化为神经元样细胞的影响.方法 取新生24 h内的Wistar大鼠海马组织细胞进行体外培养,1 w后将其接种在培养板中,在不同时间点观察不同浓度EGB 对细胞生长的作用,并检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果 各实验组NSCs生长明显好于对照组,免疫细胞化学显示:在同一时间内,不同浓度EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分率随着EGB浓度升高呈上升趋势;随着细胞培养时间的延长,相同浓度EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分率有下降趋势.结论 EGB能促进NSCs的存活、增殖并在一定时期内可促进NSCs向神经元样细胞的方向分化.     

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的：研究5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导体外骨髓间充质干细胞（marrow measenchymal stem cells，MSCs）向心肌细胞发展的作用及其机制。方法：从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs，培养传代后用不同浓度的5-aza诱导，倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期改变；MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响；免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达；RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果：5-aza对MSCs有抑制增殖的作用（P〈0．05）；在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化；免疫细胞化学检测结果表明，MSCs的经5-aza诱导14d，肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高（P〈0．01）；PT—PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显，而对照组未见表达。结论：MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞，这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。     

T-2毒素对体外培养大鼠软骨细胞中基质金属蛋白酶13表达的影响

目的观察T-2毒素对体外培养Wistar大鼠软骨细胞中基质金属蛋白酶13（MMP13）表达的影响。方法培养新生Wistar大鼠关节软骨细胞，按不同质量浓度T-2毒素（0．4、0．8、1．6、3．2μg／L）将实验组分为4组，同时设立对照组（不加T-2毒素）。运用免疫细胞化学方法和免疫印迹方法观察软骨细胞中MMP13的表达水平。结果无论是免疫细胞化学法还是免疫印迹法，各实验组的MMP13表达水平均高于对照组（P〈0．01），且随着T-2毒素剂量的逐渐增加，MMP13的表达量也相应增加，各组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论T-2毒素可增加体外培养软骨细胞中MMP13的表达水平，且呈现剂量依赖关系。这可能是T-2毒素致关节软骨损伤的重要机制之-。     

JNK抑制剂SP600125对游离脂肪酸诱导β细胞凋亡的影响

目的探讨c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP60012,5在游离脂肪酸（FFA）诱导的胰岛G细胞凋亡中的作用。方法采用MTT法观察FFA对小鼠13Tc3细胞生长的抑制作用,流式细胞术观察细胞凋亡率,免疫细胞化学和Westernblot法检测β—JNK、p-c-Jun在FFA作用下及SP600125阻断JNK信号通路情况下的表达。结果FFA可诱导体外生长的βTc3细胞凋亡,与对照组比较明显增加（P〈0．05）。FFA诱导βTc3细胞凋亡过程中,β—JNK和p-c-Jun蛋白显著增加（P〈0．05）;用SP60012s预处理βTc3细胞后,β—JNK和p-c-Jun蛋白含量较未处理组明显减少（P〈0．05）。结论FFA可诱导小鼠βTc3细胞凋亡,凋亡过程通过JNK途径实现。     

体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞（MSCs）的生长特点及在体外诱导条件下分化为神经元样细胞的能力，并寻找最佳诱导时间。方法无菌条件下，收集大鼠股骨骨髓，分离出MSCs进行培养、扩增、纯化。用神经妥乐平（NT）进行诱导。在不同时间用巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色鉴定阳性细胞。结果MSCs经诱导后呈神经元样形态。免疫组化鉴定显示Nestin阳性细胞表达在诱导第3天时最多，为48．20％±5．61％，NSE阳性细胞表达在第5天时最多，为31．50％±7．32％。结论MSCs在体外诱导条件下可经神经前体细胞转化为神经元样细胞，且第5天为最佳诱导时间。     

IGF-1对MC3T3-E1细胞凋亡及凋亡调控蛋白Bax、Bcl-2表达的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞凋亡基因相关蛋白Bax／Bcl-2表达的影响。方法 MC3T3-E1细胞分组培养，应用4个浓度的IGF-1（1ng／mL、10ng／mL、30ng／mL、50ng／mL）干预24h。观察MC3T3-E1细胞动态生长状况：流式细胞技术检测细胞凋亡率；免疫组织化学法检测凋亡蛋白Pax／Bcl-2的表达水平。结果 与正常血清对照组相比，无血清对照组MC3T3-E1细胞凋亡率增加（P〈0．05）；与无血清组相比，IGF-1组MC3T3-E1细胞凋亡率降低（P〈0．05），Bax表达减弱（P〈0．05），Bcl-2表达增强（P〈0．05）；各浓度组间比较，（1～50）ng／mL浓度范围内MC3T3-E1细胞凋亡率随IGF-1浓度加大而逐渐降低（P〈0．05），Bax表达逐渐减弱（P〈0．05），50ng／mL浓度组Bcl-2表达明显增强（P〈0．01），Bcl-2／Bax灰度比与细胞凋亡率呈显著正相关（r=0.917，P〈0．01）。结论 一定浓度的IGF-1同时调节Bax和Bcl-2表达，抑制无血清培养诱导的细胞凋亡。并存在剂量依赖性效应。     

转染Noggin基因的骨髓基质干细胞体外分化为神经元样细胞的研究

目的 构建Noggin基因的表达载体,分离骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转染Noggin基因的BMSCs在体外分化为神经元样细胞的情况.方法 应用RT-PCR技术扩增Noggin基因,利用基因工程技术构建载体pCS2+[Tα1]-Noggin,分离、培养大鼠BMSCs,借助脂质体将Noggin基因转入BMSCs.观察诱导后细胞形态变化,利用免疫细胞化学方法 鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP).利用RT-PCR方法 检测神经细胞标记物mRNA的表达.结果 成功构建Noggin基因的真核表达载体并分离培养BMSCs.转染Noggin基因表达载体后, 分化的BMSCs形态似神经细胞;免疫化学检测到NSE、MAP-2特异性标志物表达,未检测到GFAP表达;RT-PCR测得神经细胞标记物GAP43、NCAM、SYN1表达.结论 从形态、蛋白、基因水平证实转染Noggin基因的BMSCs在体外可以分化为具有部分功能的神经细胞.