高糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内胆固醇含量的影响

目的观察高糖培养对大鼠肾小球系膜细胞内胆固醇含量的影响并探讨其可能机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞, 分为高糖培养组(高糖组, 培养基糖浓度为30 mmol/L)及正常糖培养组(正常组, 培养基糖浓度为5.5 mmol/L)。分别于培养24、36、48 h时, 用油红O染色及分光光度计比色法测定细胞内脂质含量, 采用细胞内蛋白印记法检测细胞低密度脂蛋白胆固醇受体(LDLR)和三磷酸腺苷结合盒A1(ABCA1)的表达。结果油红O染色提示培养36 h时高糖组细胞内脂滴少于正常组, 培养24 h及48 h时两组无明显差别。高糖组大鼠肾小球系膜细胞在培养36 h时细胞内总胆固醇(TC)及胆固醇酯(CE)显著低于正常组(P=0.028、0.029), 而游离胆固醇(FC)差异无统计学意义(P=0.306)。培养24、48 h时, 两组间细胞内TC、CE及FC差异均无统计学意义(均P>0.05)。高糖组大鼠肾小球系膜细胞LDLR表达量在培养24、36、48 h时均显著低于正常组(P=0.043、0.004、0.028), ABCA1表达量在培养24、36、48 h时均显著高于正常组(P=...     

螺内酯对醛固酮诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激的影响

目的 观察螺内酯对醛固酮诱导的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cells,MCs)氧化应激的影响,探讨其肾脏保护机制.方法 体外培养大鼠MCs,设正常对照组、醛固酮(10-7 mol/L)刺激组、不同浓度螺内酯(10-7、10-8、10-9mol/L)干预组.以2',7'-二氯双氢荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)为细胞内H2O2的荧光探针标记细胞,采用流式细胞术检测系膜细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;采用比色法检测培养细胞上清液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性.结果 与正常对照组比较,醛固酮刺激系膜细胞48 h后,细胞内ROS水平明显增加,上清液中MDA含量增高、SOD活性下降,差异均有统计学意义(均有P＜0.05).螺内酯干预可明显抑制醛固酮刺激下的系膜细胞的上述反应,差异均有统计学意义(均有P＜0.05),且呈浓度依赖性.结论 螺内酯可呈浓度依赖性地抑制醛固酮诱导的大鼠MCs氧化应激,该作用可能是其肾脏保护机制之一.     

青蒿琥酯对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

[目的]观察青蒿琥酯（Art）对大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells,GMCs）增殖的影响并探讨其作用机制。[方法]用不同浓度的青蒿琥酯刺激大鼠肾小球系膜细胞,4-甲基偶氮四唑蓝（tetrazolium salt,MTT）法观察其增殖情况。[结果]与正常对照组相比,LPS具有明显诱导GMC增殖的作用（P﹤0.05或P﹤0.01）;青蒿琥酯作用24、48、72 h,GMC增殖水平均可受到抑制（P﹤0.05或P﹤0.01）,且随药物浓度增大、作用时间延长,抑制作用增强,高浓度组（60 mg/L）72 h抑制率可达51.18%。[结论]青蒿琥酯能够抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖。     

低分子肝素对大鼠肾小球系膜细胞增生及MCP-1表达的影响

目的　观察低分子肝素 (LMWH)对大鼠肾小球系膜细胞 (GMCs)增生及单核细胞趋化蛋白 - 1(MCP- 1)表达的作用。方法　在体外培养的大鼠GMCs株中加入脂多糖 (LPS)后 ,再分别加入不同浓度的LMWH ,设实验组 1组 :GMCs +LPS +LMWH ,设对照组 2组 :GMCs +LPS组及GMCs组 ,分别将上述 3组命名为 :LMWH组 ,LPS组及GMCs组。采用MTT掺入方法 ,于 2 4h、4 8h ,观察 3组中GMCs增生水平 ,并采用ELISA方法观察其培养的上清液中单核细胞趋化蛋白 - 1(MCP - 1)的浓度。结果　LMWH组于 4 8hGMCs增生的抑制最为显著 ,其中 :LMWH组GMCs增生水平低于LPS组 (P <0 0 5 ) ,与GMCs组无统计学差别 (P >0 0 5 ) ;LMWH组GMCs培养上清中MCP - 1浓度明显低于LPS组 (P <0 0 1) ,与GMCs组无统计学差别 (P >0 0 5 )。结论　LMWH能抑制大鼠GMCs增生 ,下调GMCs中MCP - 1的异常表达及分泌。     

醋酸铅对体外培养人肾小球系膜细胞超微结构的影响

目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞(human renal mesangial cells,HRMC)超微结构的影响。方法醋酸铅处理HRMC后,Giemsa染色法观察细胞形态学变化;透射电镜观察细胞超微结构的变化;DNA梯(DNA Ladder)实验检测醋酸铅对HRMC基因组的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 10μmol/L醋酸铅染毒HRMC 24、48h后,Giemsa染色显示出细胞成凋亡形态学改变。透射电镜观察细胞胞质内出现空泡,核固缩,核膜结构模糊,并出现凋亡小体。HRMC基因出现较为明显的DNA损伤现象。流式细胞仪检测细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。结论醋酸铅可促进HRMC凋亡,影响肾脏正常功能。     

来氟米特对转化生长因子β_1诱导的体培养的大鼠肾小球系膜细胞中Smad2表达的影响

目的观察来氟米特(leflunomide,LEF)在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β_1刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)表达Smad2过程中发挥的作用。方法建立体外培养大鼠肾小球系膜细胞模型,经鉴定造模成功后第7代用于实验。按照对模型大鼠体外培养的肾小球系膜细胞的处理方式不同,将其分为TGF-β_1组(TGF-β_1 5 ng/mL),LEF-1组(LEF 5μg/mL+TGF-β_1 5 ng/mL),LEF-2组(LEF 50μg/mL+TGF-β_1 5 ng/mL)和对照组(无血清RPMI 1640培养液+20%胎牛血清)。分别于15 min,30 min,1 h,2 h和6 h收集标本,用间接免疫荧光法检测各组磷酸化Smad2(phosphorylation-Smad2,p-Smad2)蛋白表达变化;采用荧光半定量RT-PCR法检测各组Smad2mRNA表达变化。结果对照组磷酸化Smad2蛋白少量表达,阳性细胞率为(21.40±1.51)%。TGF-β_1组阳性细胞率为(70.00±3.23)%,30 min时表达开始升高,1 h及2 h时表达明显增高,6 h表达开始下降。各时间点LEF-1组和LEF-2组磷酸化Smad2蛋白表达下降,阳性细胞率分别为(23.60±2.80)%和(25.81±1.29)%,细胞荧光强度呈减弱趋势。与TGF-β_1组相比,LEF-1组和LEF-2组磷酸化Smad2蛋白表达下降,差异有显著意义(P0.05)。但LEF-1组和LEF-2组与对照组比较,差异无显著意义(P0.05)。肾小球系膜细胞中Smad2mRNA相对表达量,TGF-β_1组显著高于对照组,2 h时达高峰。LEF-1组和LEF-2组Smad2mRNA显著低于TGF-β_1组,差异有显著意义(P0.01);但LEF-1组和LEF-2组间比较,差异无显著意义(P0.05)。LEF-1组和LEF-2组Smad2mRNA相对表达量1h时较低,之后逐渐升高,说明随时间延长,来氟米特对体外培养的肾小球系膜细胞干预作用逐渐减弱。结论经转化生长因子-β_1刺激后,体外培养的大鼠肾小球系膜细胞磷酸化Smad2蛋白和Smad2mRNA相对表达量分别增加,来氟米特可降低Smad2蛋白和Smad2mRNA表达水平,为来氟米特的肾脏保护作用提供理论依据。     

血小板源性生长因子对大鼠肾小球系膜细胞增殖及信号转导的影响

目的探讨血小板源性生长因子（PDGF）是否通过细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）途径诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖和胶原蛋白的表达。方法MTT法检测肾小球系膜细胞代谢活性,免疫细胞化学法检测胶原蛋白的表达,Western blot法检测ERK1／2及磷酸化-ERK1／2蛋白表达。结果10-100ng／ml PDGF能够促进系膜细胞增殖并诱导Ⅰ型与Ⅳ型胶原表达,表现出部分浓度相关性。PDGF作用细胞内磷酸化-ERK1／2表达灰度值增加,而ERK1／2蛋白表达不明显．结论PDGF作用系膜细胞后能够通过ERK1／2通路促进细胞增殖及胶原蛋白的表达。     

纳米硫化镉对人肾小球系膜细胞氧化损伤及NF-κB蛋白表达的影响

目的探讨纳米硫化镉(nano-CdS)对人肾小球系膜细胞(HMC)的氧化损伤及其机制。方法将对数生长期的HMC细胞分为对照组(0μg/ml)和nano-CdS组(5~80μg/ml),用MTT实验观察nano-CdS对细胞存活率的影响,采用荧光探针技术检测细胞内的活性氧(ROS),采用蛋白质印迹法观察NF-κB蛋白的表达。结果与对照组比较,nano-CdS组细胞存活率降低,ROS含量升高,NF-κB的蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 nano-CdS可导致HMC细胞氧化损伤。     

福辛普利对大鼠肾小球系膜细胞增殖及转化生长因子β1表达的影响

目的观察新型血管紧张素转化酶抑制剂（angiotension—converting enzyme inhibitor，ACED——福辛普利（fosinopril，FOS）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）增殖及转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1表达的影响。方法建立体外培养大鼠肾小球系膜细胞，鉴定后3～10代用于实验。实验分为5组：对照组（Ctrl组）、脂多糖刺激组（LPS组）、福辛普利高、中、低剂量组（分别为FOS1组、FOS2组和FOS3组），分别于24h和48h两个时间点甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法测定各组细胞增殖情况；于6h，12h，24h后酶联免疫测定（enzyme—linked immunosorbent—assay，ELISA）法测定细胞培养上清液中转化生长因子β1蛋白的表达量，荧光半定量RT～PCR法检测转化生长因子β1mRNA表达的变化。结果脂多糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖，福辛普利可抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖；正常培养的大鼠肾小球系膜细胞均有一定量的转化生长因子β1蛋白分泌和mRNA表达；LPS组在各时间点转化生长因子β1蛋白分泌和mRNA表达均高于Ctrl组（P〈0．01），而FOS1组、FOS2组、FOS3组转化生长因子β1蛋白分泌和mRNA表达均低于LPS组（P〈0．01）。结论脂多糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖。福辛普利可抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖。福辛普利能够从蛋白水平和mRNA水平抑制脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子β1的表达，为福辛普利的肾脏保护作用提供理论依据。     

脂蛋白（a）对大鼠肾小球系膜细胞细胞间黏附因子-1表达的影响

目的探讨脂蛋白（a）[Lp（a）]对大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）增生及细胞间黏附因子-1（ICAM-1）表达的影响。方法分离Lp（a），培养GMCs，在不同时间（12、24、48、60、72h），应用不同剂量（1．25μg／L、2．5μg／L、5．0μg/L、10μg／L、20μg／L）Lp（a）处理GMCs，采用MTT法测定GMCs增生率，免疫组化法检测GMCs的增生细胞核抗原（PCNA）阳性表达率，酶联免疫法检测培养液上清的ICAM-1浓度，并与脂多糖组、对照组比较。结果与LPS组、对照组比较，随着Lp（a）剂量的增加，GMCs的MTT、PC—NA阳性表达率、上清ICAM-1浓度呈增加趋势，明显高于对照组，但低于LPS组，在Lp（a）2．5μg／L、5．0μg／L其作用达到高峰，大剂量时出现下降，剂量越大，下降越明显，Lp（a）10．0μg／L低于对照组，20．0μg／L则明显低于对照组。随着处理时间的延长，GMCs的MTT、PCNA阳性表达率、上清ICAM-1浓度呈增加趋势，但随着剂量的增加，依次于72、60、48h逐渐出现下降。GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关。结论Lp（a）能明显影响GMCs的增生，作用呈剂量依赖性和时间依赖性，小剂量时刺激GMCs的增生，大剂量则表现为细胞毒作用。Lp（a）明显影响大鼠GMCs的ICAM-1表达，GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关。提示Lp（a）对GMcs的作用可能与ICAM-1有关。     

血管紧张素-(1-7)抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠系膜细胞增殖

目的 探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠系膜细胞(GMC)增殖的影响。方法 在AngⅡ诱导培养的GMC中，应用Ang-(1-7)，通过[^3H]-Thymidine及[^3H]-Leucine掺入分别测定GMC的DNA、蛋白质合成；结晶紫染色检测细胞数目，观察系膜细胞增殖情况；分别用特异性AngⅡ受体1(AT1受体)拮抗剂[Sar^1，Ⅱe^8]-AngⅡ和血管紧张素Ⅱ受体2(AT2受体)拮抗剂PD123319与Ang-(1-7)共同培养，探讨Ang-(1-7)是否通过AngⅡ受体发挥作用。结果 Ang-(1-7)呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导GMC的DNA、蛋白质合成及细胞数目增加；[Sar^1，Ⅱe^8]-AngⅡ和PD123319不影响Ang-(1-7)的上述作用。结论 Ang-(-1-7)能抑制基础和AngⅡ诱导的GMC增殖，其作用的发挥不通过AngⅡ的AT1和AT2受体介导。     

硒化合物对大鼠神经干细胞球分化成熟蛋白表达的影响

[目的]观察微量元素硒对神经干细胞分化成熟的影响。[方法]利用新生大鼠神经干细胞体外培养技术、小盖玻片培养法和免疫细胞化学方法，观察了无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(硒甲基半胱氨酸)对神经干细胞向神经元分化标记蛋白NSE、星形胶质细胞分化标记蛋白GFAP、少突胶质细胞分化标记蛋白CNPase的表达状况，同时用Westem-blot免疫印迹技术对神经元特异性烯醇化酶(neuron speeific enolase，NSE)、β-微管蛋白(β-tubulin)、星形胶质细胞-醋酸纤维蛋白(glial fibrillary acidhc protein，GFAP)、环核苷酸-3’磷酸水解酶(2’，3’-cyclic nucleotide 3’phosphohydrolase，CNPase)进行了半定量分析。[结果]适量浓度的硒对神经干细胞球的分化发育有良好的促进作用。在含硒的营养液中神经干细胞分化好、形态正常。神经干细胞向神经元、神经胶质细胞方向分化比例较高。其中胶质细胞分化方向GFAP 和CNPase 细胞计数，平均每高倍视野分别为5～6个和7～12个；并且分支多、细长，网络复杂。免疫印记结果发现有机硒能明显促进神经干细胞分化成熟蛋白NSE、β-tubulin、GFAP、CNPase的表达，化学发光显影明显高于对照组。[结论]适量的硒能促进神经干细胞的分化成熟。特别是硒甲基半胱氨酸是一个低毒和高生物效应的硒营养制剂．在神经干细胞球体外分化发育中有着重要的作用。     

硒对大鼠肝细胞DNA损伤的研究

为探讨硒的遗传毒性，应用单细胞凝胶电泳研究亚硒酸钠对离体大鼠肝细胞ＤＮＡ损伤的作用。结果表明，８．７５μｍｏｌ／Ｌ，１７．５０μｍｏｌ／Ｌ，３５．００μｍｏｌ／Ｌ的亚硒酸钠可以引起肝细胞ＤＮＡ单链断裂，出现拖尾的彗星细胞。     

Janus激酶抑制剂AG490对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察Janus激酶(JAK)抑制剂AG490对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化以及转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法体外培养人肾近曲小管上皮细胞株(HKC),分别给予高糖和高糖 AG490干预,Western印迹检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙粘素(E-Cadherin)及信号蛋白STAT1、STAT3、磷酸化STAT1(phospho-STAT1,p-STAT1)和p-STAT3的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中TGF-β1和Ⅰ型胶原的分泌。结果与低糖组比较,高糖培养的HKC中α-SMA、p-STAT1和p-STAT3表达明显上调;E-Cadherin表达明显下调;TGF-β1mRNA表达增加;细胞培养上清液中TGF-β1、Ⅰ型胶原分泌增加。AG490明显下调p-STAT1和p-STAT3表达的同时,明显抑制高糖刺激HKC中α-SMA表达的升高,减轻E-Cadherin表达下降程度;降低TGF-β1mRNA表达及TGF-β1、Ⅰ型胶原的分泌。结论JAK参与高糖诱导的HKC转分化,并刺激TGF-β1和细胞外基质的分泌,JAK抑制剂AG490能有效的拮抗其作用。     

P,P''''-DDE对睾丸支持细胞雄激素结合蛋白表达的影响

[目的]研究雄激素结合蛋白在P,P'-DDE致雄性大鼠生殖内分泌干扰过程中的作用机制。[方法]对大鼠睾丸支持细胞离体原代培养4-5 d;设溶剂(DMSO)及阴性对照,以终浓度为30、50、80、100 μmol／L的P,P'-DDE作用于支持细胞24h,计数200个细胞,计算支持细胞存活率;分别以浓度为10、30、50 μmol/LP,P’-DDE作用于支持细胞24h, 运用一步法RT-PCR检测支持细胞内雄激素结合蛋白基因mRNA水平。[结果]P,P'-DDE在50μmol／L及以下浓度作用 24 h后,支持细胞存活率>90％,而80μmol/L组仅45％;染毒24 h后,对照组及10、30、50 μmol/L的P,P’-DDE组支持细胞内雄激素结合蛋白mRNA灰度比值分别为0．3140±0．1020、0．3920±0．0949、0．5837±0．1221、0．6490±0．1718,随 p,p'-DDE所给浓度的增高而逐渐升高,且30、50 μmol/L组与对照组差异存在显著性(P<0．05),呈剂量依赖关系。[结论] p,p'-DDE作用于睾丸支持细胞后,雄激素结合蛋白基因转录水平可明显升高,从而表达增强,促进雄激素结合蛋白的生成,代偿性地维持生精过程。     

Attractin在体外培养大鼠睾丸Leydig细胞的表达

目的:探讨Attractin(Atrn)在培养大鼠睾丸leydig细胞的表达。方法:体外培养成年雄性SD大鼠睾丸leydig细胞,采用实时荧光定量RT-PCR检测Atrn mRNA表达,western blot检测Atrn蛋白的表达,同时应用化学发光法检测细胞睾酮分泌水平。结果:在体外培养大鼠睾丸leydig细胞过程中,Atrn mRNA、Atrn蛋白表达量和睾酮生成量逐渐减少。Atrn蛋白表达量与Atrn mRNA表达量(r=0.953,P<0.05)和睾酮生成量(r=0.976,P<0.01)成正相关。结论:大鼠睾丸Leydig细胞Atrn mRNA,Atrn蛋白表达量随培养天数的延长而减少,可能与睾酮的变化有关。     

壬基酚对体外培养大鼠睾丸支持细胞凋亡影响的研究

目的探讨壬基酚对大鼠睾丸支持细胞的影响及其作用机制.方法建立体外培养大鼠睾丸支持细胞以及混合培养支持细胞和生精细胞体系,以不同浓度的壬基酚(分别为0.2μg/L、1.0 μg/L、3.0 μg/L、5.0 μg/L)作用于支持细胞和混合培养的支持细胞和生精细胞,采用MTT法测定支持细胞的活性,流式细胞仪测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法测定混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量的变化.结果随着壬基酚作用剂量的增大和作用时间的延长支持细胞的活性下降,且支持细胞的凋亡率随着壬基酚浓度的增大而提高;混合培养的支持细胞和生精细胞中Fas和FasL mRNA表达量均明显提高.结论壬基酚可引起支持细胞凋亡,进而通过Fas/FasL系统启动生精细胞凋亡.     

镉对大鼠肝细胞DNA损伤作用的研究

应用单细胞凝胶电泳研究氯化镉对大鼠肝细胞ＤＮＡ的损伤作用。结果表明，８．７５μｍｏｌ／Ｌ、１７．５μｍｏｌ／Ｌ、３５μｍｏｌ／Ｌ氯化镉可以引起肝细胞ＤＮＡ单链断裂，拖尾的慧星细胞分别达到７８％、９０％、９８％，并存在着明显的剂量效应关系，相关系数０．９９３３。本研究提示，氯化镉可以引起离体肝细胞ＤＮＡ损伤。