IL-24 cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的 建立转染人白细胞介素-24(hIL-24)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-24的表达情况.方法 将携带人白细胞介素-24的质粒peDNA3.1( )-hIL-24转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Western blot和ELISA法对hIL-24的表达进行检测.结果 IL-24基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达.RT-PCR电泳结果显示hIL-24基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-24的含量为162.8±15.4 pg/mL,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-24.结论 hIL-24基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达.     

抗癌药莪棱舌草Ⅰ号诱导人肝癌细胞凋亡的研究

用流式细胞光度术检测细胞凋亡 ,运用细胞化学方法检测凋亡相关基因蛋白的表达 ,以及用Westernblot ting分析研究抗癌药莪棱舌草Ⅰ号对人肝癌细胞 (772 1细胞 )凋亡的诱导作用。结果表明药物能够诱导 772 1细胞发生凋亡 ,凋亡率可达 4 0 % ;药物作用可以使细胞中凋亡抑制基因bc1 2表达减少 ,凋亡促进基因Bax表达增加。提示诱导肿瘤细胞凋亡可能是莪棱舌草Ⅰ号抑制肝癌细胞的机制之一     

人可诱导的共刺激分子转基因细胞的构建及其对B细胞产生抗体的影响

目的构建含人可诱导共刺激分子（ICOS）基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达人ICOS基因的L929细胞株,并初步研究ICOS对B细胞产生抗体的影响。方法采用RT-PCR方法从扁桃体激活的T细胞总RNA中扩增出ICOS cDNA,双酶切装入逆转录病毒载体pGEZ-Term,与辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞72h后,经Zeocin筛选出稳定表达ICOS分子的L929细胞株;采用RT-PCR和流式细胞仪分析ICOS的分子表达,ELISA法研究ICOS信号对B细胞体外产生抗体的作用。结果成功地构建了含ICOS基因的重组逆转录病毒载体;筛选获得能稳定高表达人ICOS分子的L929转基因细胞,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长及IgG的分泌。结论 ICOS是CD28家族的新成员,在机体免疫应答过程中起着重要的作用。     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

人肺癌A549细胞产生的兔疫抑制因子对IL-l产生及作用的影响

人肺癌A549细胞产生的免疫抑制因子(TDSF)作用于巨噬细胞(Mφ)5h,即可抑制白细胞介素-1(IL-1)的产生;如持续作用24 h、48h则抑制作用更强。与对照组相比P<0.05,<0.01.当TDSF存在时,经尼龙毛处理的胸腺细胞对外源性IL-1反应显著减弱,表明TDSF能抑制IL-1作用。ConA刺激未经尼龙毛处理的胸腺细胞可产生增殖,但TDSF使其增殖抑制.表明:TDSF能抑制IL-1的产生及作用,并能干扰由IL-1介导的其他反应.TDSF可通过抑制胸腺细胞增殖从而阻止新鲜T细胞的补充。     

人DC-SIGN基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人DC-SIGN基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达DC-SIGN分子的L929基因转染细胞。方法利用RT-PCR的方法从人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC）总RNA中克隆出人DC-SIGN基因,通过双酶切（EcoRI,BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ-Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达DC-SIGN蛋白的L929细胞株。结果构建了用于表达的含DC-SIGN基因的重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,获得具有感染能力的重组DC-SIGN逆转录病毒和转染L929细胞,继而经RT-PCR、流式细胞仪表型检测,筛选出了稳定表达人DC-SIGN蛋白的L929转基因细胞。结论构建了含人DC-SIGN基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人DC-SIGN蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

联合应用反义bcl-2和反义IL-6寡核苷酸对小细胞肺癌细胞株NCI-H446的作用

目的　观察联合应用反义 bcl- 2硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (bcl- 2 AS- PS- ODN)和白细胞介素 6 (IL - 6 )AS- PS- ODN对小细胞肺癌细胞株 NCI- H4 4 6增殖和活力的影响。　方法　以 bcl- 2 AS- PS- ODN和 IL- 6 AS- PS-ODN单独及联合作用于 NCI- H4 4 6 ,经细胞克隆形成实验、细胞增殖实验观察其对细胞增殖和活力的影响 ,经细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒检测细胞凋亡的变化 ,经半定量 RT- PCR检测 IL - 6 m RNA表达水平的变化。　结果　细胞增殖曲线、细胞克隆形成实验及细胞凋亡实验显示联合用药能更强地抑制细胞活力 ,促进细胞凋亡。 bcl- 2 AS-PS- ODN单独作用时 ,IL- 6 m RNA表达上升 74 .3% ,IL- 6 AS- PS- ODN单独作用以及与 bcl- 2 AS- PS- ODN联合作用时 ,IL- 6分别下调 6 7.7%和 5 2 .4 %。　结论　联合用药较单独用药对 NCI- H4 4 6细胞株显示出更好的抑制效果     

CXCR2过表达结肠癌细胞株的建立及生物学功能的初步研究

目的 建立人SW1116结肠癌细胞中稳定过表达CXCR2稳定细胞株,分析过表达CXCR2基因对人结肠癌SW1116细胞迁移能力的影响。方法 分离健康人外周血单个核细胞,Trizol提取总RNA并反转录为cDNA,PCR扩增CXCR2的CDS序列,连接至慢病毒穿梭质粒pLVX-IRES-ZsGreen1多克隆位点,进行CXCR2基因的克隆,构建pLVX-IRES-ZsGreen1-CX-CR2重组质粒。重组质粒与包装质粒通过磷酸钙共转染法包装出慢病毒上清并对人SW1116结肠癌细胞进行感染。real-timePCR及Western blot方法分析转染pLVX-IRES-ZsGreen1-CXCR2重组质粒的人SW1116结肠癌细胞中CXCR2表达情况。Tr-answell实验分析过表达CXCR2对结肠癌细胞体外迁移的影响。结果 成功建立稳定表达CXCR2基因的SW1116结肠癌细胞株,并初步阐明CXCR2能够促进结肠癌细胞体外迁移。结论 成功建立过表达CXCR2基因的结肠癌细胞并能促进其体外迁移。     

原发性肝癌血清磷脂酶A2活性变化及临床意义

目的探讨原发性肝癌(PLC)患者血清磷脂酶A2活性的变化及临床意义.方法采用[3H]-油酸标记生物膜法检测了60例PLC患者(其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肝癌患者分别为14例、23例、23例)以及16例手术切除肿瘤后和19例肝动脉栓塞化疗后患者血清PLA2的动态变化.结果 PLC患者血清PLA2活性29.27±4.15(%)明显高于对照组8.42±2.01(%);且不同临床分期肝癌患者之间PLA2活性相差显著(P<0.05),随患者病情加重,PLA2活性呈递增趋势;PLA2活性≥30.0(%)和<30.0(%)者一年生存率分别为32.0%和75.0%;手术切除肿瘤后和化疗有效者PLA2活性较治疗前均有明显降低(P<0.05).结论 PLA2可作为PLC辅助诊断及估计病情的血清学指标之一,对了解PLC患者体内肿瘤体积大小、病程发展、疗效评价及预后估计有一定的作用.     

青蒿酯钠抗人肝癌（BEL—7402）与诱导凋亡

应用体内外抑瘤实验、细胞形态学观察、流式细胞仪、Westernblot实验进行检测和观察，探讨青蒿酯钠抗肿瘤作用及机制。结果表明，青蒿酯钠对人肝癌有体内、外抗肿瘤作用；诱导人肝癌细胞凋亡，可能是其抗肿瘤作用机制之一；诱导体外人肝癌细胞凋亡通过P53非依赖性途径。     

EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达和乙型肝炎病毒X蛋白对其表达的影响

目的：探讨肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达及乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对EpCAM和CD13表达的影响.方法：Western blot检测正常肝细胞系（LO2细胞）和肝癌细胞系（Huh7,Bel-7404,Hep3B,QSG-7701细胞）中肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13的表达情况,同时建立稳定转染HBx基因的Bel-7404 （Bel-7404/HBx）细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测转染后EpCAM和CD13表达情况.结果：EpCAM和CD13在不同的肝癌细胞系中表达水平完全不同;转染HBx基因后EpCAM的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的（2.04±0.16）和（2.03±0.25）倍;而CD13的mRNA和蛋白表达水平明显下调,分别为对照组的（69±8）％和（55±7）％.结论：肝癌干细胞可能存在多个干细胞亚群,在不同的肝癌细胞中干细胞标记物的表达水平不同,而HBX对不同亚群的影响也不同.     

不同迁移能力肝癌细胞中干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达

目的:观察Nanog、Sox2和Oct4干细胞相关基因在四株不同迁移能力肝癌细胞系中的表达.方法:常规细胞培养无迁移能力的HepG2细胞、低迁移能力的MHCC97-L细胞、中迁移能力的LM3细胞及高迁移能力的MHCC97-H细胞,采用免疫荧光组织化学方法观察四株肝癌细胞系中肝癌干细胞相关基因Nanog、Sox2和Oct4的表达.结果:干细胞相关基因Nanog、Oct4和Sox2在四株迁移能力不同的肝癌细胞系中不同程度表达,且在细胞膜、细胞核、细胞浆中的表达量亦不同;Nanog在细胞核表达,并随着细胞迁移能力增强而呈递增趋势;Sox2在不同迁移能力肿瘤细胞中表达无明显规律,而Oct4在高迁移能力肝癌细胞的细胞浆及核中高表达.结论:Nanog、Sox2和Oct4在不同迁移能力肝癌细胞系中均有表达,但无明显规律,推测肝癌干细胞与肝癌的发生可能有密切关系.     

DBC2基因诱导乳腺癌细胞周期G1期阻滞的机制

目的 研究肿瘤抑癌基因DBC2(deletion in breast cancer 2)抑制乳腺癌MDA-MB-435S细胞增殖的可能机制.方法 野生型DBC2基因的真核表达载体pEBG-DBC2瞬时转染MDA-MB-435S细胞72 h,RT-PCR方法证实DBC2基因的过表达;流式细胞术检测DBC2的瞬时过表达对MDA-MB-435S细胞周期的影响,Western blot检测DBC2的过表达对细胞周期蛋白Cyclin D1表达的作用.结果 DBC2基因在MDA-MB-435S细胞中瞬时转染72 h后,其mR-NA表达水平即可成倍增加,同时DBC2基因的过表达可诱导该乳腺癌细胞周期的G1期阻滞,并随着时间的延长出现细胞凋亡.结论 DBC2基因体外抑制乳腺癌细胞生长的功能,可能通过抑制Cyclin D1的表达并使细胞停滞于G1期,以及诱导细胞凋亡等机制实现.     

重组人IL-21基因对肝癌细胞的生长抑制作用的研究

目的 研究重组人白细胞介素21 (interleukin 21,IL-21)基因,对肝癌细胞HepG2的生长的影响.方法 采用电击转染技术将质粒pIL21转染到肝癌HepG2细胞,继续培养24 h、48 h、72 h,按四甲基偶氮唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞生长...     

转hGM－CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及其生物学特性

采用逆转录病毒载体将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因导入人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７细胞中，建立转基因细胞株ＢＩＵ／ＧＭ。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＢＩＵ／ＧＭ细胞基因组中。经流式细胞仪细胞ＤＮＡ周期分析表明，转基因前后ＢＩＵ－８７细胞增殖状态无变化。免疫荧光检测发现ＧＭ－ＣＳＦ基因导入及表达不能促进ＢＩＵ－８７细胞表面ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＤＲ、ＤＱ抗原的表达。转基因细胞经６０Ｇｙ／ｓＸ线灭活后，丧失增殖能力，但能维持一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ分泌活性达２周。本文为进行转基因瘤苗的深入研究奠定了初步基础。     

转染Smad4基因的人胰腺癌细胞PCNA-1 MMP-2及TIMP-2表达的改变

目的观察转染阳性细胞克隆基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)表达的改变,以进一步阐明Smad4在胰腺癌侵袭和转移中的作用及机制。方法经脂质体介导将含有野生型Smad4重组表达质粒转染人PCNA-1,用G418筛选及RT-PCR、Western blot法鉴定;采用RT-PCR与Western blot法检测转染阳性细胞克隆MMP-2及TIMP-2表达改变。结果成功建立稳定高表达Smad4的阳性PCNA-1克隆(F-9、F-21)。相对对照组,稳定转染野生型Smad4基因的PCNA-1细胞其MMP-2 mRNA及蛋白(约降低62%)表达明显降低,而TIMP-2 mRNA及蛋白(约增加2.1倍)的表达显著增加。结论转染Smad4基因可抑制胰腺癌细胞的运动和侵袭,在胰腺癌抗转移治疗中可能具有重要作用。     

隐丹参酮可能具有诱导人肝癌HepG2细胞铁死亡的作用

目的 观察隐丹参酮在人肝癌HepG2细胞铁死亡中的作用。方法 体外培养HepG2细胞,采用CCK-8法检测细胞活力并计算半数抑制浓度(IC₅₀),倒置相差显微镜观察细胞形态,DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)水平变化,谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒检测GSH水平变化,Western blot法检测铁死亡相关蛋白胱氨酸谷氨酸逆转运体轻链蛋白(xCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达。以铁死亡抑制剂Ferrostain-1(Fer-1)、铁螯合剂去铁胺(DFO)、ROS清除剂乙酰半胱氨酸(NAC)进行干预,同样检测细胞活力、ROS水平、GSH水平及xCT和GPX4表达。结果 隐丹参酮可显著抑制HepG2细胞活力,并引起HepG2细胞形态学变化和死亡,IC₅₀为93.73 μmol/L。隐丹参酮可显著诱导HepG2细胞ROS累积,降低GSH水平,并下调xCT和GPX4表达。Fer-1、DFO、NAC均可不同程度恢复隐丹参酮引起的HepG2细胞活力下降。Fer-1可抑制隐丹参酮诱导的ROS累积,并恢复GSH水平及xCT和GPX4表达。 结论 隐丹参酮可能通过抑制GPX4和xCT表达使HepG2细胞中ROS累积,导致细胞发生铁死亡。     

树突状细胞浸润对原发性肝癌生物学行为和预后的影响

目的:研究原发性肝癌组织中树突状细胞(DC)浸润与肝癌临床病理特征、生物学行为、预后之间的关系,明确DC浸润对肝癌发生发展及预后的影响。方法:用免疫组化(即用型两步法SuperveisionTM)法检测60例原发性肝癌术后组织标本中DC标志蛋白S-100和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;以原位末端标记技术(TUNEL)检测肝癌细胞凋亡比例。结果:高分化肝癌组织中DC浸润数量高于低分化肝癌(P<0.05);在无门静脉侵犯或淋巴结转移的肝癌组织中DC浸润数量显著高于有门静脉侵犯或淋巴结转移的肝癌组织(P<0.05);DC高浸润组的晚期肝癌比例低于DC低浸润组(P<0.05);DC高浸润组预后好于DC低浸润组(P<0.05)。DC浸润与增殖细胞核抗原标记指数(PCNA-LI)呈负线性相关(r=-0.337,P<0.01),与凋亡细胞指数(AI)呈正线性相关(r=0.435,P<0.01)。结论:DC浸润与肝癌的生物学行为密切相关,DC在肝癌的发生发展和预后中有重要作用,抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡是其可能的作用机制之一。     

人CD48基因转染细胞株的构建

目的克隆人CD48基因,构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR克隆获得人CD48基因,将人CD48基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体,进而感染L929细胞,构建稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。结果成功克隆人CD48基因和构建PGEZ/CD48逆转录病毒表达载体,进而成功获得稳定表达人CD48的基因转染细胞株L/CD48。结论成功克隆了人CD48基因及其逆转录表达载体,并构建了稳定表达CD48分子的基因转染细胞株,为探讨CD48生物学功能的研究奠定了物质基础。     

转染自杀基因pCEAcd-tk的SPC-A-1细胞的死亡机制

【目的】探讨自杀基因 pCEAcd tk/前体药物体系旁观者效应的细胞死亡机制。【方法】提取质粒pCEAcd tk ,转染到肺癌细胞株SPC A 1中 ,与未转染的细胞按 2∶8的比例混合后加到 96孔培养板中 (每孔 3× 10 3 ) ,加前体药物 5 FC(5 μmol/L)和GCV(10 μmol/L)孵育 5d后 ,MTT法测定细胞存活率而估计旁观者效应。取处理后的细胞 ,提取DNA ,琼脂糖凝胶电泳 ;Hoechst染色后荧光显微镜观察及碘化丙啶 (PI)染色 ,流式细胞仪分析细胞周期。【结果】①SPC A 1细胞株在转染了pCEAcd tk体系后加前体药物存在明显的旁观者效应 ;②处理细胞的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳呈涂布状 ;③处理细胞用荧光显微镜观察到形状变大 ,无凋亡小体形成 ;④流式细胞仪分析到细胞周期发生改变。【结论】SPC A 1细胞在转染了pCEAcd tk后存在旁观者效应 ,这种旁观者效应引起的细胞死亡是一种坏死。