重组腺病毒介导mIL-12 基因转染的 EL-4细胞生物学特性的研究

目的：观察 ｍ Ｉ Ｌ１２ 基因转染的小鼠 Ｅ Ｌ４ 细胞（ Ｃ５７ Ｂ Ｌ／６ 小鼠 Ｔ 淋巴瘤细胞株）体外生物学特性的改变。方法：阳离子脂质体协同 Ｉ Ｌ１２ 重组腺病毒感染 Ｅ Ｌ４ 细胞。结果及结论：基因转染的 Ｅ Ｌ４ 细胞有 ｍ Ｉ Ｌ１２ 的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达,培养上清中可以检测到 ｍ Ｉ Ｌ１２ 的生物学活性。与野生型 Ｅ Ｌ４ 细胞相比,ｍ Ｉ Ｌ１２ 重组腺病毒感染的 Ｅ Ｌ４ 细胞形态及体外增殖能力无明显改变, 转染细胞的成瘤性降低。此外,研究结果还表明,阳离子脂质体能显著提高腺病毒的感染效率。     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

目的：构建神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因转染的施万细胞。方法：NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(Schwann cell,SCs)。用免疫组化和ELISA方法,分别检测NT-3基因转染SCs的NT-3表达及培养液中NT-3的含量。结果：实验中获得得AdvNT-3中外源基因序列与大鼠NT-3的DNA序列完全一致,与未基因转染SCs相比,NT-3基因转染SCs的NT-3阳性增强,培养液中NT-3含量增高。     

腺病毒介导p53基因转染增加人胃癌细胞的放射敏感性

目的评价腺病毒介导p53基因(Adp53)转染对人胃癌细胞的凋亡效应和放射增敏作用。方法以重组腺病毒介导p53基因感染4种不同p53状况的人胃癌细胞，用免疫组织化学法和Western blot法检测P53蛋白在胃癌细胞中的表达；用细胞集落形成法检测细胞存活率；用TUNEL法检测细胞凋亡。胃癌细胞感染Adp53后照射4Gy，用流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡；胃癌细胞种植肿瘤内注射Adp53后照射6Gy，以肿瘤相对体积增长曲线观察肿瘤抑制情况。结果1：100效靶比(MOI)Adp53产生细胞高转染率，以及p53基因在4种胃癌细胞中均高表达，并产生G2/M期阻滞、凋亡增加和细胞增殖抑制。如果以凋亡评价放射效应，Adp53转染对4Gy照射4种细胞的凋亡率比值为：W细胞3．0，M细胞3．6，neo细胞2．2，823细胞2．5。体内实验结果显示，Adp53对w细胞肿瘤6Gy照射的抑瘤率比值为1．41，而对M细胞肿瘤为1．91。结论腺病毒介导p53基因转染产生细胞凋亡并提高人胃癌细胞的放射敏感性，这种作用不依赖于细胞内在的p53状况。     

0.075Gy射线诱导EL—4细胞凋及细胞周期的适应性反应

目的 观察低剂量Ｘ射线照射能否诱导ＥＬ－４细胞凋亡及细胞周期的适应性反应。方法 采用流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞凋恨及细胞周期。结果 单纯２ＧｙＸ射线照射后１２小时ＥＬ－４细胞凋亡显著增多，并伴有明显Ｇ１阻滞；０．０７５Ｇｙ预照射可明显减轻间隔６小时后２Ｇｙ攻击剂量照射所致的细胞凋亡和Ｇ１阻滞。结论０．０７５Ｇｙ射线离照射可诱导ＥＬ－４细胞凋亡及Ｇ１阻滞的适应性反应。     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,增强VSMC中gax基因的表达。方法　采用位置特异性重组方法构建携带大鼠 gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体(AdCMV gax) ,经 2 93细胞扩增 ,纯化制备高滴度病毒转染液 ;以病毒转染液常规转染VSMC后 ,应用RT PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中 gaxmRNA和蛋白质的表达。 结果　流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV gax转染VSMC后 ,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高 ,转染后 2 4小时即可达 80 %左右 ,高水平的表达可维持 5天以上 ;AdCMV gax转染前 ,PDGF BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用 ,AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中 gax基因的表达均比转染前显著增高。 结论　腺病毒载体可有效地介导 gax基因转染VSMC ,并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究 gax基因对VSMC生物学行为的影响     

腺病毒载体介导bcl-2基因转染对周围神经再生修复的影响

目的　探讨腺病毒载体中介bcl- 2基因转染对周围神经再生修复的影响。　方法选用SD大鼠坐骨神经切断损伤模型 ,神经外膜端端对线缝合后 ,于神经缝合处远端 0 .5cm处分别注射Ad s-bcl- 2、Ad as -bcl- 2、Ad lacZ和等渗盐水。术后 4 8h、7,15和 30d常规 4 0g L多聚甲醛灌注固定 ,取脊髓L4～ 6 节段冰冻切片 ,行x -gal染色、bcl- 2免疫组化和原位杂交染色、GAP - 4 3组化染色 ;并动态观察坐骨神经功能指数 (SFI)以了解后肢恢复情况。　结果　Ad s-bcl - 2组脊髓前角运动神经元中GAP - 4 3表达均较其他组高 (P <0 .0 5 ) ,SFI恢复最好 ;Ad as -bcl- 2组神经元中GAP - 4 3的表达较其他组低 (P <0 .0 5 ) ,SFI恢复最差 ;Ad LacZ组与等渗盐水组比较 ,差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。　结论　腺病毒载体中介bcl- 2基因转染能促进坐骨神经损伤后再生和功能恢复。     

转染野生型p53基因介导的HL—60细胞凋亡与p21蛋白表达的关系

目的：探讨野生型p53基因对HL－60细胞的作用机制,并检测p21的表达,探讨二者在白血病中的关系。方法：用脂质体介导的方法将野生型p53基因导入p53基因严重缺失的人髓细胞白血病细胞系HL－60中,用形态学,电镜,流式细胞仪,间接免疫荧光等方法检测p53对HL－60细胞的促凋亡作用及对p21表达的调节作用。结果：野生型p53基因能促进HL－60细胞凋亡及上调p21表达。结论：p21可能在p53促HL－60细胞凋亡中起协同作用。     

BALB/c小鼠sIL-4受体基因克隆及腺病毒载体的构建

目的：克隆小鼠sIL-4R基因并构建sIL-4R基因腺病毒穿梭质粒，将之包装至重组腺病毒颗粒。方法：从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA，应用巢式PCR的方法克隆sIL-4R基因。目的基因经限制性内切酶酶切，定向克隆至腺病毒穿梭载体。利用脂质体将含目的基因的穿梭质粒与腺病毒包装质粒pJM17共同转染腺病毒包装细胞293细胞，PCR方法鉴定重组腺病毒阳性克隆。结果：BALB／c小鼠的sIL-4RcDNA序列与文献报道的小鼠sIL-4RcDNA序列同源性达98％，有9个碱基不匹配，与小鼠IL-4R的同种异型体的膜外区100％同源。293细胞出现特征性细胞病变。PCR鉴定获得重组病毒颗粒。结论：获得了小鼠sIL-4R基因和含sIL-4R基因的腺病毒颗粒，为探讨应用腺病毒介导sIL-4R蛋白治疗过敏性疾病打下了实验基础。     

经肝动脉插管注射重组腺病毒的体内基因转染效率及“靶向性 …

目的　将动脉插管方法应用于重组腺病毒 (Ad .LacZ)介导的标记基因体内导入 ,观察标记基因在大鼠内脏中的转染效率和维持时间。方法　 9组大鼠 ,7组于胃十二指肠动脉分别注入Ad .LacZ[2× 10 9pfu/ml(空斑形成单位 /ml) ]各 1ml,2组注入单纯培养液各 1ml,7组实验组分别于 12h、18h、72h、7d、14d、2 1d、2 8d取动物的肝、脾、肺和肾脏 ,2组对照组于 7d取上述脏器 ,采用 β 半乳糖苷酶 (X Gal)染色方法检测LacZ基因在各个脏器的表达。结果　实验组于 12h取材 ,经染色LacZ基因在肝脏中即有表达 ,而此时脾、肺、肾等内脏器官尚未见表达 ;此后 ,18h、72h、7d、14d直至 2 1d该基因在肝脏仍有表达 ,而在其他脏器如脾、肺及肾表达仅维持 14d。对照组动物各个脏器皆无染色。结论　经动脉途径注入重组腺病毒 ,其体内的表达具有器官靶向性。如经此途径注入治疗性的目的基因重组腺病毒 ,其于肝脏表达产物出现时间早 ,并且持续时间较长。本实验结果为将来应用插管方法进行肝病基因治疗奠定了理论基础     

腺病毒载体介导mIL-12基因治疗联合放射治疗小鼠肝癌的研究

目的：观察腺病毒介导白介素－12基因治疗联合放射治疗协同抗小鼠肝癌作用。方法：荷肝癌动物模型,肿瘤局部γ射线照射后,瘤内注射AdmIL-12腺病毒,取组织标本进行ELISA及CTL活性检测,免疫组化染色等分析。结果：联合治疗小鼠肿瘤生长受到抑制,体积明显缩小,并可使50％的小鼠肿瘤完全染色等分析。结果：联合治疗小鼠肿瘤生长受到抑制,体积明显缩小,并可使50％的小鼠肿瘤完全消退,疗效显著优于单纯照射组和瘤内注射AdmIL-12及其其他对照组（P＜0．01）。而单纯瘤内注射AdmIL-12组的疗效并不优于单纯照射组（P＞0．05）。联合治疗组小鼠血清和脾细胞的培养上清中可见INF-γ水平的显著提高,并诱导产生特异性的CTL活性。免疫组化结果显示,联合治疗组肿瘤组织中见有大量CD4^ 、CD8^ 阳性淋巴细胞的浸润。结论：腺病毒介绍导白介素12基因治疗与放射治疗的联合具有协同抗肿瘤作用,并诱导产生特异性抗肿瘤免疫反应。     

稳定转染小鼠IL-17全长基因的乳腺癌细胞株的建立及基因转染对4T1细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠乳腺癌4T1细胞株,并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pcDNA3．1转染小鼠乳腺癌细胞4T1,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株;镜下观察细胞形态,RT-PCR法、Western印迹和激光共聚焦法检测目的基因和蛋白的表达;收集转染和未转染IL．17的4T1细胞的培养上清,分别与巨噬细胞RAW264．7共培养,ELISA法检测RAw264．7细胞培养上清中IL-6水平;MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期、凋亡以及细胞表面MHCI、MHC11、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）等分子表达。结果获得1株稳定表达IL-17的4T1细胞,而且其培养上清可刺激小鼠巨噬细胞RAW264．7产生IL-6,证明该细胞可表达功能性IL-17。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠乳腺癌细胞株。     

腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究

目的：评价携带HGF基因的腺病毒栽体转染鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的效率，以及转染HGF基因对MSC增殖与分化的影响。方法：采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效果和转染率；采用ELISA方法检测转染后HGF的表达情况；细胞增殖分析采用MTT法；MSC向成骨细胞分化采用碱性磷酸酶染色法。结果：转染效率与病毒滴度(MOI)具有量效关系，随着MOI的增加，转染率明显增高，当MOI=400时，转染率可达99．99％。转染HGF后，MSC表达HGF明显增高，48h可达128ng/ml，随后逐渐下降并维持2周以上；转染HGF对MSC的增殖以及向成骨分化没有影响。结论：MSC是一种理想的基因载体细胞，可用于HGF的基因治疗。     

重组腺病毒介导反义c-myc诱导HL-60细胞粒系分化的作用

目的：研究重组反义c-myc腺病毒（Ad-AS-c-myc）诱导人急性早幼粒HL-60细胞系粒系分化及作用分子机制。方法：采用重组腺病毒Lac-Z（Ad-LacZ）及Ad-As-c-myc联合硫酸鱼精蛋白转染HL-60细胞，X-gal染色判断转染效率。采用形态学、RT-PCR、流式细胞仪、四唑氮蓝（NBT）还原试验、非特异酯酶染色等方法进行研究。结果：Ad-AS-c-myc能抑制HL-60细胞C-myc基因在转录水平的表达。被转染HL-60细胞在形态上趋向成熟粒细胞，Ad-AS-c-myc使HL-60细胞周期G0／G1阻滞，过氧化物酶、非特异性酯酶活性增强。结论：Ad-AS-c-myc对HL-60细胞具有诱导粒系分化作用。其生物学作用与HL-60细胞c-myc的表达受抑、HL-60细胞出现一些成熟粒细胞的生理功能有关。     

Ad5CMV—Lacz在体转染效率的研究

目的：检测腺病毒载体在血管壁中的转基因效率。方法：实验分两组：正常动脉组和损伤动脉组,应用携带Lacz基因的重组腺(Ad5CMV-Lacz)转染正常和损伤后大鼠颈动脉壁细胞,并检测了损伤动脉Ad5CMV-Lacz的转染效率。Ad5CMV-Lacz孵育时间为45min。结果：未损伤动脉的Lacz( )细胞仅限于内皮细胞,而损伤动脉的新生内膜细胞,中膜细胞和部分外膜细胞可被转染,其中新生内膜细胞的转染阳性率最高,为8．9％－38．5％（总效率24．7％）。结论：重组腺病毒载体可以实效转染血管平滑肌细胞。     

转染P21WAF1基因对BT—325细胞端粒酶表达的影响

目的：观察外源性p231WAF1基因对BT－325细胞的作用,探讨p21WAF1表达水平的改变对细胞端粒酶活性的影响。方法：经脂质体介导的方法将PCEP－WAF1质粒导入BT－325细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用TRAP－PCR－ELISA、TUNEL和电镜等技术检测外源性p21WAF1基因对BT－325细胞端粒活性和细胞凋亡的作用。结果：较对照组相比,转染外源性p21WAF1基因的BT－325细胞端粒酶表达水平显著下降,伴有显著细胞凋亡现象。结论：外源性p21WAF1基因的表达可促进BT－325细胞端粒酶活性降低,诱导细胞显著凋亡,提示端粒酶的活性表达可能与细胞周期调控存在密切联系。     

电离辐射对EL-4细胞凋亡与坏死的影响

目的 研究不同剂量电离辐射对EL－4细胞凋亡和细胞坏死的影响。方法 采用PI和Hoechst 33342双染、流式细胞术检测。结果 实验结果表明：给予50－200mGy低剂量照射后6h,EL－4细胞凋亡和坏死较对照组没有升高,而给予1．0－8．0Gy大剂量X射线照射后6h,细胞凋亡较对照组有明显升高,4．0Gy以上剂量,细胞坏死显著升高。结论 一定剂量的电离辐射不仅可以诱导凋亡的产生,而且可直接导致细胞坏死,即细胞的死亡模式与受照剂量有关。     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

重组腺病毒介导PUMA基因对胰腺癌细胞的放射增敏作用

目的 探讨重组腺病毒(Ad)介导PUMA基因联合γ线对人胰腺癌的作用。方法 以不同感染复数(MOI)的Ad-PUMA(10、50、100)转染胰腺癌PANC-1细胞,RT-PCR和Western blot检测转染前后细胞内PUMA表达。PANC-1细胞分为4组:对照组、转染组、照射组、转染联合照射组。MTT比色法和流式细胞术检测各组细胞存活率和凋亡率。人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型分为4组:对照组、转染组、照射组、转染联合照射组,在不同时间测量肿瘤生长速率和凋亡指数。结果 PUMA表达随病毒MOI增加而进行性增加(MOI=10、mRNA=0.46±0.02、蛋白=0.75±0.09;MOI=50、mRNA=1.12±0.09、蛋白=1.01±0.18;MOI=100、mRNA=1.50±0.08、蛋白=1.80±0.15;P<0.05),细胞增殖随病毒MOI增加逐渐受抑制(r=-0.986?55),经γ线照射后增殖抑制更加明显(r=-0.971?26,P<0.05),而凋亡率上升(照射前=45.4%±5.26%,照射后=73.2%±6.62%,P<0.05)。Ad-PUMA转染和γ线联合照射后7~35d,裸鼠肿瘤生长速率明显低于单纯照射组、单纯转染组和对照组[第35天肿瘤体积分别为(19.82±6.45)、(39.5±9.23)、(33.6±10.3)、(52.0±11.43)mm³,P<0.05],凋亡指数升高(AI分别为0.43±0.05、0.29±0.10、0.24±0.05、0.00±0.00,P<0.05)。结论 PUMA基因转染联合γ线照射可增强对胰腺癌细胞杀灭作用,联合治疗明显优于单纯照射和单纯基因治疗。     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。