人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法.方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代.取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构.结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成.细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性.细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密.结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系.     

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。     

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种良好的SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法:选用4周龄SD幼鼠的肾皮质进行细胞培养,采用机械研磨、胰酶消化、过滤,Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养及传代。制作细胞爬片,用免疫细胞化学(Cytokeratin 18表达阳性)进行鉴定。结果:肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周生长,4~5 d后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强。结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肾小管上皮细胞。结论:采用此方法分离培养的肾小管上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性操作良好。     

人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 :建立人肾小管上皮细胞原代培养、传代、冻存及鉴定方法。方法 :采用肾小管节段贴块培养法 (A法 )与消化培养法 (B法 )对比原代培养 ,并以 0 .2 5 %胰蛋白酶消化、传代 ,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类 ,常规冻存和复苏。结果 :A法成功培养、传代、冻存、复苏并鉴定了人肾小管上皮细胞 ,B法失败。结论 :肾小管节段贴块培养法用于人肾小管上皮细胞原代培养是可行的     

高糖诱导大鼠近端肾小管上皮细胞肥大

目的 观察高糖培养对大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响.方法 SD大鼠,麻醉下,无菌分离单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞.不同浓度糖(10 mM,20 mM,30mM)培养肾小管上皮细胞,72小时后检测细胞体积、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量,以观察细胞肥大情况.结果 高糖(20 mM,30mM)培养72小时,导致肾小管上皮细胞体积明显增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量明显增加.结论 高糖培养可诱导肾小管上皮细胞肥大.     

游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨游离脂肪酸（FFAs）对大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）的凋亡作用及凋亡机制。方法 用含有不同浓度（0、125、250、500μM）软脂酸的DMEM-F12培养肾小管上皮细胞（NRK-52E）,在24h、48h两个时段以原位末端标记（TUNEL法）检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定以上各组培养液中一氧化氮（NO）水平。在48h时段用免疫细胞化学法检测caspase-3表达水平。结果 随着软脂酸浓度的增高、作用时间的延长：①NRK-52E细胞的凋亡率逐渐增高,24h时三个软脂酸组按软脂酸浓度由低到高的凋亡率依次为（9.7±1.9）%、（14.2±4.5）%、（23.4±5.3）%,48h时为（16.2±3.7）%、（24.8±4.4）%、（35.4±5.7）%,与对照组相比均有统计学意义（P〈0.05）;②在凋亡率增高组的培养液中测得NO浓度也增加,差异均有显著性（P〈0.05）。③48h时各软脂酸干预组caspase-3阳性表达率增高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论 游离脂肪酸具有促进肾小管上皮细胞凋亡的作用,而这种作用与其自身在FFAs作用下产生过多的NO使caspase-3高表达有关。     

小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞培养方法,为有关肾损伤体外研究提供实验平台。方法 分别采用肾小管节段贴块法、胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ法消化分离肾小管节段,用含10%血清的培养基培养,然后用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,对原代和传一代肾小管上皮细胞进行鉴定。结果 三种培养方法培养细胞3 d基本贴壁,胶原酶Ⅰ法3-4 d长满瓶底,肾小管节段贴块法4-5 d长满瓶底,胰蛋白酶7 d左右。细胞均鹅卵石铺路样生长,经细胞免疫组织化学染色鉴定cytokeratin 18呈阳性。结论 肾小管节段贴块法和胶原酶Ⅰ消化都可以得到较理想的肾小管上皮细胞,后者细胞生长较快,为研究肾损伤的发生原因和机制提供实验基础。     

硫化氢对顺铂诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预研究

目的 探讨硫化氢H2S 对顺铂（DDP）诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预作用。方法 研究分为阴性对照组、DDP 组、DDP+ 硫氢化钠NaHS 组。DDP 组：DDP 浓度为0、1、2、5、10、20 和40 mg/L ;DDP+NaHS 组：NaHS 浓度分别为0、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0 和2.0 mmol/L,加DDP（20 mg/L）共同作用。噻唑蓝（MTT）实验：DDP 组、DDP+NaHS 组与人近端肾小管上皮细胞株（HK-2 细胞）共同培养,24 h 后测光密度（OD）值。NaHS（0.5 和1.0 mmol/L）加DDP（20 mg/L）与HK-2 细胞共同培养24 h。4,6- 联脒-2- 苯基吲哚（DAPI）,Annexin V-FITC/PI 染色通过显微镜观察各组细胞的形态学改变。Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 MTT 实验：0、1、2、5、10 和20 mg/L DDP 浓度的OD 值分别为（0.270±0.064）、（0.229±0.022）、（0.198±0.024）、（0.189±0.069）、（0.188±0.030） 和（0.165±0.012）,OD 值随DDP 浓度上升逐渐下降, 在20 mg/L 低于阴性对照组（P <0.05）。20 mg/L DDP 加浓度分别为0.2、0.4、0.5、0.8 和1.0 mmol/L NaHS的OD 值分别为（0.173±0.051）、（0.186±0.023）、（0.259±0.050）、（0.263±0.033） 和（0.268±0.098）, 以上与浓度为20 mg/L DDP 的OD 值（0.153±0.017）比较,差异有统计学意义（P <0.05）。DAPI、Annexin VFITC/PI 染色荧光显微镜显示,对照组HK-2 细胞平均凋亡细胞数为（4.230±1.015）,20 mg/L DDP 影响下为（35.020±6.079）,两者差异有统计学意义（P <0.05）,DDP 组高于阴性对照组。DDP+NaHS 组在0.5 和1.0 mmol/L 的平均凋亡细胞分别为（22.550±2.912） 和（9.780±2.063）,差异有统计学意义（P <0.05）,DDP+NaHS 组低于DDP 组。Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测,阴性对照组HK-2 细胞凋亡率（5.167±0.612）%,在20 mg/L DDP 影响下,为（31.598±1.014）%,细胞凋亡率增加（P <0.05）。合用NaHS 凋亡减少,在0.5 和1.0 mmol/L 的凋亡率为（18.375±2.239）% 和（11.636±1.233）%,差异有统计学意义（P <0.05）,DDP+NaHS 组低于DDP 组。结论 NaHS 对DDP 导致的近端肾小管上皮细胞的凋亡有保护作用。     

大鼠肾小管上皮细胞的分离鉴定及其增殖活力分析

目的：建立一种大鼠肾小管上皮细胞的分离鉴定方法,分析所获得细胞的增殖活力,为肾损伤等肾脏疾病的体外分析实验提供理论基础和技术支持。方法：采用Ⅱ型胶原酶消化法分离肾小管节段,并用Percoll密度梯度离心法进一步纯化肾小管,常规条件下对肾小管节段进行贴壁培养,待细胞爬出后,用免疫组织化学方法检测细胞角质素-18（CK-18）的表达情况,采用流式细胞术对第0、1和2（P0、P1、P2）代细胞的CK-18表达情况进行分析,用CCK-8方法检测各代细胞的增殖活力。结果：肾小管节段培养24 h后,可见细胞从节段内爬出;培养72 h后,细胞呈铺路石样密集生长。随着传代进行,P0、P1和P2代细胞CK-18的表达效率分别为95.9%、91.5%和76.8%,肾小管上皮细胞逐渐死亡,P2代细胞较P1代细胞增殖活力明显减弱(P<0.05),同时培养体系中杂细胞增多。结论：该方法经济可靠、简便易行,但是所分离的肾小管上皮细胞只可在体外传代2次,不能长期培养,仅P0、P1代细胞可供体外分析实验使用。     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及生物学特性

目的探讨适用于小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)分离培养及鉴定的技术方法。方法采用机械研磨肾脏组织分离肾小管节段并结合Ⅱ型胶原酶消化分离培养法进行mRTECs原代培养,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;锥虫蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法、DNA周期检测法分别测定和观察mRTECs传代成活率、生长情况及增殖特征;免疫荧光染色法鉴定细胞。结果获得的细胞3 d后从贴壁的肾小管节段边缘长出,7 d后呈铺路石样,生长迅速可传代;传代细胞成活率达96%以上;第1代(P1)、第3代(P3)细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示P1、P3细胞生长至第3～5天光密度值变化较明显;随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,光密度值无明显变化,细胞逐渐衰老;P1细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为78.9%和21.1%,P3细胞G0/G1和(S+G2)/M分别为82.1%和17.9%;P3细胞行免疫荧光染色细胞角质蛋白-18及上皮型钙黏素显示细胞质内蛋白表达阳性,细胞阳性率均达98%。结论机械研磨并结合Ⅱ型胶原酶消化培养法能成功培养mRTECs,建立稳定、高效的细胞分离和培养技术方法,为肾脏疾病与心血管功能相关性研究提供理想的细胞来源。     

创伤性急性肾衰时肾脏分离肾小管上皮细胞DNA损伤的意义

目的探讨肾小管上皮细胞DNA损伤在急性肾功能衰竭（acute renal failure,ARF）中的意义。方法Wistar大鼠108只,等分为大、小剂量及对照组,分别于后肢肌肉注射10、5ml／kg50％甘油及10ml／kg生理盐水。于1、3、6、12、24、48h测定血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（creatinine,Cr）,取肾脏分离肾小管上皮细胞,单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）技术测定DNA损伤。结果两实验组BUN、Cr分别于12、6h起较对照组显著升高（P＜0．05,P＜0．01）,两实验组间BUN和Cr分别在12h和24h起出现显著差异（P＜0．05,P＜0．01）,表明肾功能受损程度不同。肾脏分离肾小管上皮细胞DNA损伤对甘油注射呈现剂量和时间依赖性,其变化趋势与尿脱落细胞DNA损伤相似,但损伤程度较轻。结论DNA损伤、细胞脱落及凋亡等变化参与了肾小管上皮细胞的损伤,是ARF病理生理变化过程“多米诺骨牌”中的重要环节,在预防或及时阻断其发生在ARF的救治中有重要意义。     

急性肾功能衰竭中肾小管上皮细胞脱落及DNA损伤的意义

目的 探讨肾小管上皮细胞脱落及DNA损伤在急性肾功能衰竭（Acute renal faiure,ARF）中的意义。方法 分别以5、10ml/kg50％甘油注射于Wistar大鼠后肢肌肉，造成不同程度的ARF，1、3、6、12、24、48、96h测定血BUN、Cr；膀胱穿刺取尿液台盼蓝 拒染法计数脱落细胞，单细胞凝胶电泳测定DNA损伤。结果 尿中脱落肾小管上皮活细胞计数及DNA损伤变化明显早于BUN、Cr，与肾功能相关；二者变化趋势相似，有一定相关性。结论 细胞脱落、DNA损伤是ARF肾小管上皮细胞损伤“多米诺骨牌”中的重要环节，其变化与损伤程度相关，有助于早期发现ARF的发生并判断其程度。     

肾组织干细胞向肾小管上皮细胞的诱导分化

目的探讨肾组织干细胞向肾小管上皮细胞的诱导分化。方法分离肾乳头肾组织干细胞,对照组加入正常干细胞培养
基,诱导组应用含activin A、BMP-7、维甲酸3种细胞因子的诱导培养基与肾上皮细胞培养基交替诱导,同时与缺氧损伤的肾小
管上皮细胞共培养,通过细胞流式、免疫荧光、qRT-PCR的方法评估诱导效率。结果细胞流式结果提示,对照组肾组织干细胞
CK-18阳性率为6.5%,诱导组CK-18阳性率为44.2%;免疫荧光结果提示,诱导组成熟上皮细胞标记CK-18、E-cadherin、ZO-1部
分阳性表达;qRT-PCR结果提示,诱导组成熟上皮细胞标记E-cadherin、AQP-1基因表达水平较对照组显著升高（P<0.01）。结
论肾组织干细胞在体外可以诱导分化为肾小管上皮细胞。
     

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的 建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学.结果 通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段.随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5% ～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05).结论 iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础.     

大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的 探讨建立大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧损伤模型的一种新方法. 方法 本实验使用大鼠NRK-52E细胞.实验分为对照组和实验组,实验组分为缺氧2,4,6 h及缺氧后复氧1,12和24 h组.缺氧时换用缺氧液,再置入N294% O2 1% CO2 5%缺氧环境;缺氧后换用含10%胎牛血清的EMDM/F12,置入95%空气 CO2 5%有氧环境,制作缺氧/复氧模型;台盼蓝摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量. 结果 大鼠肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,与对照组相比,台盼蓝摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 采用三气孵箱法建立大鼠.肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法 操作简单、易行、可靠.     

肌醇加氧酶在糖尿病肾病发病机制中的作用

[目的]研究高糖环境下大鼠肾近曲小管上皮细胞肌醇加氧酶（myoinositol oxygenase,MIOX）的表达及糖尿病肾病大鼠体内肌醇耗竭的机制。[方法]体外培养大鼠近曲肾小管上皮细胞株（NRK-52E）,将其分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）和渗透浓度对照组（MG）,并分别于12、24、48、72h应用RT—PCR法检测MIOX的mRNA表达,免疫荧光细胞化学法检测其蛋白的表达。[结果]HG组MIOXmNA与蛋白表达水平在12h出现升高,二者分别在24h与48h达高峰。NG组的MIOXmRNA及蛋白表达水平各时间点差异无显著性意义（P〉0．05）;与NG组和MG组相比,HG组MIOX的mRNA及蛋白表达均明显升高（P〈0．01）。MG组明显高于NG组（P〈0．05）。[结论]高糖能促进大鼠肾近曲小管上皮细胞肌醇加氧酶（MIOX）的表达,并可能通过MIOX的形成增加介导肌醇的耗竭,提示MIOX参与了糖尿病肾病的发生发展。     

黄芪注射液对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

[目的] 研究黄芪注射液对高糖环境下肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响。[方法] 传代培养人近曲肾小管上皮细胞,细胞用无血清培养基同步化24 h后,将细胞分为5组:低糖对照组、高糖组、高糖+不同浓度黄芪注射液组(2、20、200 μg/mL),每组设3个复孔。将细胞置于37 ℃恒温培养箱中培养至24、48、72 h,收集细胞及细胞上清液。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。[结果] 24、48、72 h,低糖对照组细胞凋亡率明显低于高糖组(P<0.05)。细胞培养24 h,黄芪干预组200和20 μg/mL细胞凋亡率明显低于高糖组(P<0.05)。细胞培养48和72 h,黄芪注射液干预组细胞凋亡率明显低于高糖组(P<0.05)。黄芪注射液干预组各组之间凋亡率比较差异也都有显著性(P<0.05),其干预作用呈剂量依赖性。[结论] 黄芪注射液能抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞的凋亡,有助于糖尿病肾病的治疗。     

内毒素脂多糖对培养肾小管上皮细胞凋亡和增殖的影响

目的 观察肾小管上皮细胞（Tubular epithelia cell,TEC）在含内毒素脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）微环境中细胞凋亡功能改变,探讨LPS直接损害肾小管的机制。方法 在含内毒素LPS的介质中体外培养肾小管上皮细胞,检测不同时相细胞凋亡增殖能力及分泌肿瘤坏死因子-a(Tumor necrosis factor a,TNF-a）能力的变化。结果 LPS有明显的抑制TEC增殖,促进TEC分泌TNF-a,且随着LPS浓度的增大,其作用更为明显;LPS还具有明显促细胞凋亡作用,呈剂量依赖性;相关分析表明,细胞凋亡与LPS促TEC分泌TNF-a的量有明显正相关。结论 LPS可抑制TEC增殖,促进细胞凋亡,可能是通过TNF-a而起作用,这可能是LPS导致脓毒症性肾衰或急性间质性肾炎小管间质损害的机制之一。