骨形态发生蛋白12诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程肌腱

背景：以往肌腱损伤的修复方法有端端吻合、自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱移植等,但均有其各自缺点。 目的：探讨以家兔骨髓间充质干细胞为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,聚羟基乙酸复合材料作为支架材料,预构组织工程化肌腱重建家兔跟腱缺损的可能性。 方法：家兔抽取股骨近端骨髓,分离所得细胞传代至第2代,加入10 μg/L骨形态发生蛋白12诱导分化,并与Ⅰ型胶原溶液按一定比例移植于预张的聚羟基乙酸缝线上预制组织工程化肌腱备用。将家兔制备成跟腱缺损模型,分别采用不同方法修复跟腱缺损：组织工程化肌腱修复,Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线修复,丝线行端端修复。修复12周对各组肌腱行形态学、力学及组织病理学观察。 结果与结论：修复12周家兔肌腱组织病理切片：组织工程化肌腱组可见大量梭形纤维母细胞顺应力学方向排列均匀分布于胶原中,纤维细胞明显增多,胶原致密;Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线组可见部分纤维组织增生伴少许肉芽组织形成,胶原纤维呈松散网丝状,细胞排列紊乱分布不均;丝线组可见纤维组织旁见大量肉芽组织形成。修复12周家兔肌腱生物力学强度：骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度明显优于Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸组,与丝线缝合组差异无显著性意义;但骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度低于正常肌腱。提示以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,以聚羟基乙酸为支架,可望构建组织工程化肌腱。构建的组织工程肌腱具有一定的生物力学特性,能用于修复跟腱缺损。     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的：研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法：通过电穿孔法将外源基因BMF12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果：光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA的表达，而没有Collagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后细胞呈CD44^ 为98．39％，HLA-DR^-。结论：BMF12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

间充质干细胞与人发角蛋白人工腱联合培养的形态学

目的：研究培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)与人发角蛋白(HHK)人工腱的相容性以及MSCs在HHK上的生长情况。方法：人MSCs与HHK人工腱联合培养后，分别在倒置显微镜及扫描电镜和透射电镜下观察MSCs的生长状态和超微结构。结果：MSCs在光镜下呈单层或多层贴附于HHK人工腱表面，扫描电镜下呈细长梭形，有的呈扁平多角形，其生长方向与HHK人工腱长轴相一致。透射电镜下可见静息态和活动态两种不同功能状态。结论：MSCs与HHK人工腱之间有极好的粘附性和相容性，是一种理想的组织工程种子细胞。     

损伤肌腱再生修复过程中胶原纤维的形成与降解

在跟腱缺损的动物模型中植入人发角蛋白(human hair keratin，HHK)人工腱进行修复，观察HHK人工腱诱导自体腱形成过程中胶原纤维的形成与降解。实验发现：在HHK人工腱植入后1周，肌腱的断端有新生腱细胞(成腱细胞)；第3周，人发之间的组织中成腱细胞增多，顺着人发的方向生长，成行排列，且与损伤肌腱的长轴平行，有时可见细胞分裂相，     

富血小板血浆诱导骨髓间充质干细胞结合化学萃取去细胞神经修复坐骨神经缺损

背景:周围神经损伤早期许旺细胞尚未大量分裂增殖,此时由于解剖连续性的中断,通过轴浆逆向运输提供的营养因子骤减,缺乏神经营养因子支持的神经元有可能死亡,从而使周围神经不能再生或再生乏力。目的:观察植入经富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞结合去细胞神经修复坐骨神经缺损的效果。方法:取新西兰大耳白兔制备坐骨神经缺损模型,随机抽签法分成4组:去细胞神经组,移植同种异体去细胞神经;骨髓间充质干细胞组,移植同种异体骨髓间充质干细胞结合化学萃取的同种异体去细胞神经:经诱导骨髓间充质干细胞组,移植经富血小板血浆诱导的同种异体骨髓间充质干细胞结合化学萃取的同种异体去细胞神经;自体神经组,移植自体神经。术后进行形态学观察与靶肌肉肌湿质量恢复率、运动神经传导速度、轴突直径和髓鞘厚度的检测。结果与结论:经富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞结合化学萃取的去细胞神经移植修复神经的靶肌肉肌湿质量恢复率、运动神经传导速度、轴突直径和髓鞘厚度及形态学观察明显优于移植单纯化学萃取的去细胞神经与骨髓间充质干细胞结合化学萃取的去细胞神经的效果,而与移植自体神经修复结果相似。说明经诱导后的骨髓间充质干细胞在体内具有许旺细胞的部分功能,可作为组织工程化外周神经的种子细胞,用于周围神经缺损的修复。     

丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞体内构建组织工程化软骨的生物相容性

文题释义： 生物相容性：是指生命体组织对非活性材料产生的一种性能,一般是指材料与宿主之间的相容性,包括组织相容性和血液相容性。 检测相容性的方法：是将支架材料与种子细胞在体外共培养,检测支架毒性、细胞活性、细胞增殖及细胞与支架的黏附情况等指标,该方法具有客观性强、可重复性强、影响因素相对简单及敏感性高等特点。 背景：课题组前期的研究中发现,丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合诱导后骨髓间充质干细胞在兔体内能修复缺损的软骨组织,但对于该组织工程化软骨组织的生物相容性还未进一步研究。 目的：研究丝素蛋白-壳聚糖支架材料复合骨髓间充质干细胞在体内构建组织工程化软骨的生物相容性。 方法：使用丝素蛋白-壳聚糖按1∶1比例混合制备三维支架材料,提取兔骨髓间充质干细胞,将诱导后的骨髓间充质干细胞与丝素蛋白-壳聚糖支架构建修复体,再将修复体移植到兔关节软骨缺损模型中修复软骨组织。实验分为3组,实验组植入诱导后骨髓间充质干细胞+丝素蛋白-壳聚糖支架,对照组植入丝素蛋白-壳聚糖支架干预,空白组未植入修复体。 结果与结论：①实验成功制备丝素蛋白-壳聚糖三维支架材料及提取骨髓间充质干细胞,并构建软骨缺损的修复体,将修复体植入兔体内能成功修复缺损的软骨组织;②建模后2,4,8,12周,3组血常规、降钙素原、血沉、C-反应蛋白结果提示无明显的全身感染征象,3组血常规及肝肾功能各时间段比较差异无显著性意义(P > 0.05);③一般观察、苏木精-伊红染色及扫描电镜观察：建模后12周,相比其他两组,实验组软骨缺损已修复,支架材料已吸收,修复组织周围未见炎性细胞,修复组织已正常组织整合良好;④结果证实,丝素蛋白-壳聚糖支架复合骨髓间充质干细胞在体内构建的组织工程化软骨具有良好的生物相容性。 ORCID: 0000-0002-8139-1175(佘荣峰) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

Scleraxis慢病毒转染人羊膜间充质干细胞促进兔腱-骨愈合

文题释义： Scleraxis：是韧带和肌腱的特异性基因,其在韧带、肌腱的发育和分化过程中起着重要的作用,参与细胞外基质的形成。当韧带和肌腱损伤后,Scleraxis也能发挥相应的生物学效应来参与韧带和肌腱的修复,加速损伤修复的进程。 腱-骨交界区：正常的肌腱与骨之间由4层结构构成：肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织,肌腱和骨之间这一过渡结构被称为腱-骨交界面,当其受损时修复效果较差。 背景：人羊膜间充质干细胞来源广泛、免疫排斥低,具有多系分化潜能,研究证实Scleraxis基因能够诱导人羊膜间充质干细胞向韧带分化,加速腱-骨愈合进程。 目的：探讨Scleraxis诱导人羊膜间充质干细胞分化后是否能够在体内促进兔腱-骨愈合,为临床腱-骨愈合提供新的思路和方向。 方法：①经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准,术前签署知情同意书,取健康足月产妇胎盘,经过2次胰酶消化分离培养人羊膜间充质干细胞,然后倒置显微镜下观察细胞形态,传代继续培养至第3代用于后续实验;②体外将携带有Scleraxis基因的慢病毒转染至人羊膜间充质干细胞,通过实时荧光定量PCR检测韧带相关基因的表达水平,免疫荧光检测韧带相关蛋白的表达水平;③将转染Scleraxis基因的人羊膜间充质干细胞注射到兔关节外腱-骨模型中,3个月后取标本观察腱-骨愈合情况。 结果与结论：①传代至第3代的人羊膜间充质干细胞在倒置相差显微镜下呈长梭形、涡旋状贴壁生长;②第3代人羊膜间充质干细胞经过Scleraxis基因慢病毒感染24 h后表达绿色荧光,96 h荧光表达量最强且稳定;③CCK-8检测转染病毒后对细胞的生长速度无影响;④实时荧光定量 PCR 显示：慢病毒转染Scleraxis基因后,其mRNA表达量成倍的增加,并且韧带相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C的mRNA表达量也明显提高;⑤免疫荧光结果显示：慢病毒转染Scleraxis基因后其韧带相关蛋白Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、Tenascin-C的表达水平提高;⑥动物体内实验证实：慢病毒转染Scleraxis基因后能够加速兔关节外腱-骨模型的腱-骨愈合。 ORCID: 0000-0003-2163-3897(邹刚) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

大鼠骨髓间充质干细胞重建表皮细胞及皮肤附件

背景：研究报道用烧伤大鼠血清作为诱导剂可以诱导间充质干细胞分化为表皮细胞。目的：体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞,单独或与必要的诱导剂组合移植修复皮肤创面缺损与重建表皮。方法：无菌环境取大鼠骨髓,选取贴壁细胞用L-DMEM培养液培养至第4代,通过流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞。用含20%烧伤大鼠血清DMEM-F12培养液诱导骨髓间充质干细胞分化成表皮细胞,通过免疫组织化学鉴定。将Wistar大鼠制造全层皮肤缺损创面,分为3组,将BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞及含有经诱导的骨髓间充质干细胞分别单次涂布到烧伤大鼠模型创面上,以未移植骨髓间充质干细胞做对照,观察再生皮肤创面收缩率及表皮层细胞与皮肤附件再生情况。结果与结论：分离、培养的骨髓间充质干细胞24 h后少部分细胞贴壁生长,形态长梭形,类似成纤维细胞,16 d时细胞贴满瓶底,呈鱼群样或网状排列,经流式细胞仪鉴定后加入20%烧伤大鼠血清的DMEM F-12培养基继续培养,细胞形态渐变为圆形或椭圆形细胞,经免疫组织细胞化学法和流式细胞术分析细胞角蛋白表达阳性,证实已分化为表皮细胞。动物实验结果表明无论是骨髓间充质干细胞单独移植还是与必要的诱导剂组合移植其皮肤的修复与再生情况均超过大鼠皮肤自然愈合,且不仅皮肤再生快,而且皮肤附件如毛囊等的再生也比对照组明显改善。初步推断间充质干细胞参与了表皮和皮肤附件毛囊的重建,从而改善皮肤愈合方式。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞与仿生纳米壳聚糖-胶原复合物修复大鼠胫骨缺损的实验研究

目的： 4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞离体培养后与仿生纳米壳聚糖-胶原（nano chitosan-sodium collagen, nano-CS-COL）形成复合支架，植入SD大鼠胫骨缺损处, 比较修复节段性胫骨缺损的效果, 初步探讨治疗骨缺损的组织工程学方法。方法: 4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 离体培养、纯化、鉴定、扩增后在等同于细胞培养的条件下与nano-CS-COL复合培养, 制成MSCs/nano-CS-COL复合物并经电镜扫描证实复合物有细胞生长。制成同种异体SD大鼠胫骨干5mm节段性动物模型, MSCs/nano-CS-COL复合物通过手术移植入动物模型胫骨缺损处, 通过大体观察、X线放射学、组织学对比实验组与对照组、空白组骨缺损修复情况。结果: 术后6、12周实验组与实验对照组放射学检查评价新骨生成有显著差异(P<0.05) 。术后组织学检查新骨生成速度、生成量均有显著差异。实验组标本与正常组基本一致。空白对照组不能自行修复骨缺损, 最后缺损由纤维组织充填。结论: BMSCs是骨组织工程中适宜的种子细胞。Nano-CS-COL复合支架能够与SD大鼠骨髓间充质干细胞体外复合培养, 移植入异体SD大鼠后未见明显免疫排斥反应, 是可以选择的细胞载体。MSCs/nano-CS-COL复合物植入修复鼠胫骨缺损能够加速新骨形成, 修复效果明显优于单纯CS植入组。     

人胎盘来源间充质干细胞移植促进肌腱移植物在骨隧道内的愈合

背景：研究表明,人胎盘来源间充质干细胞来源广泛,增殖能力强,其移植对腱-骨愈合有明显的促进作用。 目的：进一步验证人胎盘来源间充质干细胞对骨-肌腱结合处愈合的影响。 方法：采用贴壁分离筛选法获取人胎盘来源间充质干细胞。30只雄性SD大鼠随机分为2组各15只。建立大鼠骨-肌腱损伤模型,实验组在骨-肌腱结合面注入人胎盘来源间充质干细胞,对照组只注入生理盐水。 结果与结论：实验组人胎盘间充质干细胞移植后2,4,6周显微镜观察在腱骨界面有干细胞存在并有较多血管组织再生,并且有部分纤维软骨增生。在移植后4,6周实验组最大拔出载荷显著高于对照组(P < 0.05)。说明人胎盘来源充质干细胞可以促进骨-肌腱结合部的早期愈合,提高其生物力学强度。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

Nanoparticle-mediated delivery of TGF-β1 miRNA plasmid for preventing flexor tendon adhesion formation

Treatment of the disrupted digital flexor tendon is troublesome because of the lack of sufficient healing capacity and the formation of adhesions. Sustained gene delivery may be a promising approach of modulating gene expression in enhancing tendon healing and decreasing adhesions. In this study, a microRNA-based RNAi plasmid was used to specifically silence the expression of TGF-β1 gene associated with scar and adhesion formation in the flexor tendons. The miRNA plasmids were complexed with polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticles to form nanoparticle/TGF-β1 miRNA plasmid (nanoparticle/plasmid) complexes. In vitro and in vivo transfection efficiencies experiments against tenocytes revealed that nanoparticle/plasmid complexes have significantly superior transfection efficiency over the lipofectamine/plasmid complexes. The gene and protein expression associated with adhesion of tendon treated with nanoparticle/plasmid complexes were evaluated by real-time PCR and immunoblotting. The grading of adhesions for tendons treated with nanoparticle/plasmid complexes was less severe than that treated with the nanoparticle/mock plasmid complexes. However, the ultimate strength of repaired tendons treated with nanoparticle/plasmid complexes was significantly lower than that of tendons treated with the nanoparticle/mock plasmid complexes.     

Human hamstring tenocytes survive when seeded into a decellularized porcine Achilles tendon extracellular matrix

Abstract

Tendon ruptures and defects remain major orthopaedic challenges. Tendon healing is a time-consuming process, which results in scar tissue with an altered biomechanical competence. Using a xenogeneic tendon extracellular matrix (ECM) as a natural scaffold, which can be reseeded with autologous human tenocytes, might be a promising approach to reconstruct damaged tendons. For this purpose, the porcine Achilles (AS) tendons serving as a scaffold were histologically characterized in comparison to human cell donor tendons. AS tendons were decellularized and then reseeded with primary human hamstring tenocytes using cell centrifuging, rotating culture and cell injection techniques. Vitality testing, histology and glycosaminoglycan/DNA quantifications were performed to document the success of tendon reseeding. Porcine AS tendons were characterized by a higher cell and sulfated glycosaminoglycan content than human cell donor tendons. Complete decellularization could be achieved, but led to a wash out of sulfated glycosaminoglycans. Nevertheless, porcine tendon could be recellularized with vital human tenocytes. The recellularization led to a slight increase in cell number compared to the native tendon and some glycosaminoglycan recovery. This study indicates that porcine tendon can be de- and recellularized using adult human tenocytes. Future work should optimize cell distribution within the recellularized tendon ECM and consider tendon- and donor species-dependent differences.     

多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein (BMP) can improve the osteogenesis capacity of tissue-engineered bone. However, how to prolong BMP release is a key for constructing tissue-engineered bone. OBJECTIVE: To study the repair effect of porous calcium phosphate cement (CPC) with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 gene on bone defects. METHODS: After modeling of bilateral femoral condyle bone defects, 12 model rabbits were given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 on the left (experimental group) and given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells on the right (control group). Bilateral femoral condyles were taken and analyzed histologically at 4 and 12 weeks after implantation. RESULTS AND CONCLUSION: Better osteogenesis including more newly formed bone tissues and faster scaffold absorption was observed in the experimental group compared with the control group at 4 and 12 weeks after implantation. The area of newly formed bone tissues at different time and rate of bone formation at 12 weeks were significantly higher in the experimental group than in the control group (P < 0.001, P < 0.05). These findings indicate that transfer of BMP-2 into bone marrow mesenchymal stem cells combined with porous CPC could increase repair of bone defects.     

骨形态发生蛋白2基因与重组蛋白缓释方法修复骨缺损的比较研究

为比较骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因与重组蛋白缓释方法修复节段性骨缺损的效果,于兔双侧桡骨中段造成1.5cm骨缺损,采用四种方法修复:A组植入转基因骨髓基质干细胞(MSCs)与PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架的复合物;B组植入单纯MSCs与含重组BMP-2的PLA/PCL缓释载体的复合物;C组植入单纯MSCs与PLA/PCL复合物;D组植入单纯PLA/PCL。术后4、8、12周行X线、组织学、生物力学和骨密度等检测。结果表明,A组体内植入4周后,成骨细胞和间质细胞呈BMP-2强阳性表达;其成骨速度及成骨质量均明显优于B组,12周时骨缺损完全修复。C组成骨能力较弱,而D组则无新骨形成,残留骨缺损。BMP-2基因治疗是修复节段性骨缺损的好方法。     

低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化

背景：脂肪间充质干细胞在跟腱组织工程再生领域越来越受到重视,研究其诱导分化的有利环境(氧体积分数)尤为必要。 目的：将脂肪间充质干细胞与跟腱细胞在不同氧体积分数条件下间接共培养,比较氧体积分数对脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化能力的影响。 方法：无菌条件下获取SD大鼠跟腱细胞。SD大鼠脂肪间充质干细胞直接购买,经培养传至第1代后,与跟腱细胞一起在常氧(体积分数20%)和低氧(体积分数2%)条件下经Transwell间接共培养体系共培养。在培养7,14和21 d,实时荧光定量PCR检测跟腱细胞的特异指标胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ,Tenomodulin,Thrombospondin-4,Scleraxis基因相对表达量,免疫荧光染色法检测胶原蛋白Ⅰ和Thrombospondin-4蛋白表达量。 结果与结论：脂肪间充质干细胞与跟腱细胞经间接共培养后,低氧组检测到的跟腱细胞的相关特异指标在基因和蛋白水平上表达水平均高于常氧组。提示氧体积分数可显著影响脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的潜能,低氧是脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的有利条件之一。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

伞式经跟骨缝合组合修复跟腱断裂的实验研究

目的 评价伞式经跟骨组合缝合法修复跟腱断裂的生物力学特性。方法 采用伞式经跟骨缝合法，组合应用0-薇乔线(Poliglactin-910)、腱周采用交叉缝合法修复8只家兔单侧跟腱断裂模型，术后固定3天，功能锻炼25天后行离体生物力学实验。结果术后28天组达正常组跟腱生物力学特性的90％。结论 采用伞式经跟骨组合缝合法修复跟腱允许早期康复活动，早期功能锻炼可以迅速提高跟腱的生物力学特性。     

Suspension of bone marrow-derived undifferentiated mesenchymal stromal cells for repair of superficial digital flexor tendon in race horses

It has been proven that mesenchymal stromal cells (MSCs) can differentiate into tenocytes. Attempts to repair tendon lesions have been performed, mainly using scaffold carriers in experimental settings. In this article, we describe the clinical use of undifferentiated MSCs in racehorses. Significant clinical recovery was achieved in 9 of 11 horses evaluated using ultrasound analysis and their ability to return to racing. Our results show that the suspension of a small number of undifferentiated MSCs may be sufficient to repair damaged tendons without the use of scaffold support. Ultrasound scanning showed that fibers were correctly oriented. By using undifferentiated cells, no ectopic bone deposition occurred. A sufficient number of cells was recovered for therapeutic purposes in all but 1 case. We suggest that the use of autologous MSCs is a safe therapeutic method for treating incompletely (i.e., not full-thickness) damaged tendons.