不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜回植动物的比较

目的 以不同支架材料聚羟基乙酸(PGA)和脱细胞真皮基质材料(Alloderm)构建组织工程化口腔黏膜后回植裸鼠,观察其存活及生长情况.方法 人口腔黏膜成纤维细胞(OFC)接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC和Alloderm复合,液面下培养4 ～ 7 d后,进行气-液界面培养7 d,然后回植裸鼠背部皮下.回植后7、14 d分别取材观察.结果 以PGA和Alloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜均可在裸鼠体内至少存活2周,并与裸鼠自身组织融合生长;在观察的第2周,以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜出现血管化,以Alloderm为支架构建的组织工程化口腔黏膜上皮分化较为明显.结论 PGA孔隙有利于细胞和血管的生长,但其强度随降解而降低;以Alloderm为支架的构建物显示出较清晰的组织学结构.     

不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜的比较

目的比较3种不同支架材料———聚羟基乙酸(PGA)、胶原膜和脱细胞真皮基质材料(A lloderm)在构建组织工程化口腔黏膜方面的特点。方法体外培养、扩增人口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞(OFC)。呈对数生长期的OFC接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC、胶原膜和A lloderm复合,液面下培养47~d后,进行气-液界面培养7 d。光镜、电镜下进行组织形态学及超微结构观察。结果以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜,含类似上皮层和固有层,但细胞层次不清;胶原膜上可见口腔黏膜上皮细胞黏附生长,并形成复层上皮样组织,但无成熟的桥粒及基底膜样结构;以A llo-derm作为支架材料的构建物,出现正常上皮形态,含半桥粒及细胞指状突起等超微结构。结论PGA、胶原膜和A lloderm支架材料都能构建出含上皮层和固有层的口腔黏膜样组织;胶原膜由于降解速度和不易操作等特点,而不适宜作为组织工程化口腔黏膜支架材料;A lloderm作为支架的构建物更接近于人类正常口腔黏膜。     

不同支架材料构建组织工程化口腔黏膜的比较

目的 比较3种不同支架材料--聚羟基乙酸(PGA)、胶原膜和脱细胞真皮基质材料(Alloderm)在构建组织工程化口腔黏膜方面的特点.方法 体外培养、扩增人口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞(OFC).呈对数生长期的OFC接种至PGA支架上培养7 d后,将口腔黏膜上皮细胞分别与PGA-OFC、胶原膜和Alloderm复合,液面下培养4 ～ 7 d后,进行气-液界面培养7 d.光镜、电镜下进行组织形态学及超微结构观察.结果 以PGA为支架构建的组织工程化口腔黏膜,含类似上皮层和固有层,但细胞层次不清;胶原膜上可见口腔黏膜上皮细胞黏附生长,并形成复层上皮样组织,但无成熟的桥粒及基底膜样结构;以Alloderm作为支架材料的构建物,出现正常上皮形态,含半桥粒及细胞指状突起等超微结构.结论 PGA、胶原膜和Alloderm支架材料都能构建出含上皮层和固有层的口腔黏膜样组织;胶原膜由于降解速度和不易操作等特点,而不适宜作为组织工程化口腔黏膜支架材料;Alloderm作为支架的构建物更接近于人类正常口腔黏膜.     

组织工程化尿路上皮结构体内外构建研究

目的探讨工程化尿路上皮结构的构建方法。方法机械分离获取膀胱黏膜层,胰蛋白酶消化法获取膀胱移行上皮细胞,用DKSFM培养基体外培养扩增。以自制的猪小肠黏膜下层(SIS)为支架材料,将培养的膀胱移行上皮细胞接种到支架材料表面,观察细胞在支架材料表面的生长增殖情况;并将体外构建的细胞-支架材料复合物植入裸鼠背部皮下,不同时间点取材进行组织学和免疫组织化学检测。结果膀胱移行上皮细胞在SIS表面能够黏附、生长和增殖。体外复合培养9d后,膀胱移行上皮细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。裸鼠体内植入4周和8周后,SIS上种植的膀胱移行上皮细胞形成多层结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色,细胞胞浆成棕黄色阳性反应。结论采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮结构,为进一步组织工程泌尿道修复重建实验奠定了基础。     

组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的 用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性.方法 应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周.未复合细胞的单纯材料作为空白对照.将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程.结果 体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限.单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞.结论 小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料.     

4种支架构建复合式口腔黏膜的组织学特点

目的利用4种不同支架材料构建复合式口腔黏膜,并比较其组织结构特点。方法体外培养人口腔黏膜的成纤维细胞和角质形成细胞,在4种支架材料中加入成纤维细胞,培养7d后,在支架表面加入角质形成细胞,培养4d后,移至气-液界面继续培养7d。苏木精-伊红染色镜下观察构建的复合式口腔黏膜的组织形态学特点。结果 4种支架均可构建形成复层上皮。其中,上皮层与脱细胞真皮基质材料(de-epidermised dermis,DED)结合紧密,形成的人工黏膜有明显的上皮钉突。不同于以往报道,上皮层与Alloderm结合并不十分紧密。以胶原凝胶为基质形成的人工口腔黏膜最厚,有明显分层。以胶原海绵-胶原凝胶为基质形成的复层上皮在部分区域长入至胶原海绵的空隙中。结论以DED和胶原凝胶为支架构建的口腔黏膜更接近于天然结构,而后者脆性较大,限制了其临床应用的可能。     

组织工程骨膜成骨的构建及血管化超微结构的观察

目的用组织工程方法构建组织工程骨,从超微结构观察成骨过程中成骨细胞、血管再生的变化,探讨小肠黏膜下层作为组织工程骨支架材料促进组织工程骨血管化的优越性。方法应用密度梯度离心法体外分离、培养骨髓基质干细胞,并将成骨诱导骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层复合培养2周。未复合细胞的单纯材料作为空白对照。将复合培养细胞与单纯材料分别植入无胸腺裸鼠皮下,扫描和透射电镜观察植入前和植入后4、8、12周成骨细胞、血管生成的变化过程。结果体外复合培养见细胞在材料上生长、分化、增殖良好,细胞分泌大量的细胞外基质,置入体内后成骨良好,形成大量的血管;12周后材料被吸收,与周围组织无明显界限。单纯材料中央部位有大量小血管及血管内皮细胞增生,其周围多为成纤维细胞,无成骨细胞。结论小肠黏膜下层作为以骨髓基质干细胞为种子细胞的支架材料,有利于骨的再生和血管化形成,是一种良好的骨组织工程支架材料。     

人工生物可降解支架聚乳酸-聚乙醇酸种植人食管上皮细胞的实验研究

目的研究人食管上皮细胞在聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化人工食管.方法制作PLGA三维细胞支架;分离培养成人食管上皮细胞,体外扩增后种植到PLGA支架上.在体外和裸鼠体内分别培养食管上皮细胞-支架复合物,分期终止培养,进行组织学染色、扫描电镜、细胞角蛋白免疫组织化学检测.结果体外培养发现,人食管上皮细胞在支架材料上贴附生长良好,长期培养仍保持食管上皮细胞特性,裸鼠体内培养4周后可形成食管黏膜样组织.结论 PLGA支架适合食管上皮细胞黏附生长,可作为食管组织工程的细胞载体.利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化人工い食管.     

生物反应器构建组织工程化血管的初步研究

目的探讨生物反应器内构建具有一定力学强度的组织工程化血管的可行性.方法从6月龄毕格犬的颈总动脉、颈外静脉分别获取平滑肌细胞和内皮细胞,体外培养扩增后,将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上形成细胞-材料复合物,置于生物反应器内(搏动频率75次/min;扩张量＜5%)培养3周,接种内皮细胞继续培养1周后取新生血管,进行大体观察、组织学和免疫组化检测.结果生物反应器内培养的组织工程化血管大体观察具有良好的弹性,管腔圆;平滑肌纤维成分排列规则且有层次感;免疫组化染色显示,平滑肌细胞呈棕黄色层状排列,内皮细胞于血管内侧呈单层排列.结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的组织工程化血管.     

生物反应器构建组织工程化血管的初步研究

目的探讨生物反应器内构建具有一定力学强度的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬的颈总动脉、颈外静脉分别获取平滑肌细胞和内皮细胞,体外培养扩增后,将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸（PGA）上形成细胞-材料复合物,置于生物反应器内（搏动频率75次／min;扩张量〈5％）培养3周,接种内皮细胞继续培养1周后取新生血管,进行大体观察、组织学和免疫组化检测。结果生物反应器内培养的组织工程化血管大体观察具有良好的弹性,管腔圆;平滑肌纤维成分排列规则且有层次感;免疫组化染色显示,平滑肌细胞呈棕黄色层状排列,内皮细胞于血管内侧呈单层排列。结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的组织工程化血管。     

组织工程化口腔粘膜的构建技术初步研究

目的　探索组织工程化口腔粘膜的构建方法。方法　用 Dispase中性蛋白酶分离提取未长毛的 SD乳鼠硬腭口腔粘膜细胞 ,用角化细胞培养液对口腔粘膜细胞进行培养 ,以自制藻酸钠薄膜作为支架材料构建组织工程化的口腔粘膜。结果　 Dispase中性蛋白酶可较好地分离提纯口腔粘膜细胞 ,用 Dispase消化酶分离获取上皮后 ,再用胰蛋白酶消化上皮为单细胞的最佳时间为 10 m in,过低的细胞密度不易形成克隆 ,鼠口腔粘膜细胞培养的最适密度为 1.5× 10 5/ cm2 。角化细胞培养液能对鼠口腔粘膜细胞进行培养 ,且没有成纤维细胞污染 ;口腔粘膜细胞在藻酸钠薄膜上生长良好。结论　利用角化细胞培养液作为培养基 ,藻酸钠薄膜作为支架材料可成功构建组织工程化口腔粘膜     

牙龈上皮细胞与脱细胞真皮构建组织工程牙龈的初步研究

目的:体外培养人牙龈上皮细胞,并与脱细胞真皮构建组织工程牙龈.方法:将体外培养的人牙龈上皮细胞接种于无细胞真皮支架上,液面下培养7 d后,分别进行气-液界面培养7,14和21d,并在光镜下进行组织形态学观察.结果:牙龈上皮细胞在体外具备良好的生长增殖能力,且在无细胞真皮支架上形成了复层上皮样组织结构,表层上皮细胞出现部分角化.结论:利用体外培养的牙龈上皮细胞和脱细胞真皮,可以在体外联合构建具有复层上皮细胞结构的组织工程牙龈.     

以膀胱脱细胞基质为支架材料体内外构建组织工程化尿路上皮

目的:探讨利用组织工程技术体内外构建尿路上皮组织的方法.方法:制备新西兰兔膀胱脱细胞基质材料(bladder acellular matrix graft,BAMG),通过Masson染色和扫描电镜观察材料结构特点.酶消化法获取兔膀胱上皮细胞,体外培养扩增,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,并以免疫组织化学方法进行细胞鉴定.将膀胱上皮细胞与BAMG体外复合培养,HE染色和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况.将体外培养的细胞-材料复合物植入裸鼠体内,分别在4周和8周取材,进行大体观察、组织学以及免疫组织化学方法检测.结果:制备的BAMG呈白色半透明薄膜状,扫描电镜下为纤维网状结构,无细胞残留.体外培养的膀胱上皮细胞呈"铺路石"样外观,抗细胞角蛋白AE1/AE3免疫组化染色胞浆呈棕黄色阳性反应.膀胱上皮细胞接种到BAMG 7 d后,细胞铺满材料的表面,呈单层细胞结构.裸鼠体内植入4周和8周后,细胞-材料复合物形成多层细胞结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色呈阳性.结论:采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮组织,这可为进一步进行组织工程泌尿道修复及重建奠定基础.     

聚二乙醇酸与Degrapol对肌成纤维细胞粘附、生长的影响

目的　寻找一种更加理想的人工降解材料 ,为改进人工降解材料提供理论依据。方法　比较聚二乙醇酸( PGA)与 Degrapol对肌成纤维细胞粘附、生长、繁殖及产生胶原的影响。结果　 1细胞种植 2周和 6周 ,PGA组的细胞计数明显多于 Degrapol组 ( P<0 .0 1) ;2 6周 PGA组胶原含量明显高于 Degrapol组 ( P<0 .0 1) ;3 2周肌成纤维细胞粘附于 PGA上 ,分布广泛 ;6周后 PGA降解 ,胶原含量丰富。而 Degrapol则部分降解 ,胶原含量较少。结论　Degrapol作为一种新型人工降解材料 ,若用于构建组织工程心脏瓣膜 ,在细胞亲和力等方面尚有待进一步改进     

Adult nasopharyngeal mucosa xenograft and dinitrosopiperazine carcinogenesis in nude mice]

Adult nasopharyngeal mucosa from 44 patients of chronic nasopharyngitis diagnosed by pathology were transplanted into 59 nude mice. The control group, 13 nude mice, were given no treatment. 10 16 days after transplantation, the experimental group, 46 nude mice, were subcutaneously injected dinitrosopiperazine (DNP), 15mg/kg, twice a week, for 12-30 times. In the experimental group, the xenografts in 27 nude mice were examined 18-37 weeks after transplantation, and the epithelia survived in 20 mice. The survival rate was 74.1%. The survival epithelia showed focal hyperplasia, dysplasia (7/20) and carcinomatous changes (4 carcinoma in situ and 4 early infiltrating carcinoma). The carcinoma incidence was 40%. In the control group, the xenografts in 7 nude mice were examined 8-35 weeks after transplantation, and the epithelia survived in 6 mice. The survival epithelia did not develop dysplasia or carcinomatous changes. The results suggested that DNP may induce precarcinomatous lesions and carcinomatous changes of adult nasopharyngeal epithelia in nude mice. On the basis of these results, the factors related to the carcinomatous changes of the nasopharyngeal epithelia are analyzed and discussed.     

骨形态发生蛋白2／7异二聚体对人脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的：探讨新型成骨诱导生长因子骨形态发生蛋白2/7异二聚体（bone morphogenetic protein 2/7 heterodimer,BMP-2/7）在诱导人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化中的作用。方法：体外培养hASCs,以成骨诱导培养基（osteogenic medium,OM）中添加150 μg/L BMP-2/7为实验组,以单纯OM为阳性对照组（OM组）, 以常规增殖培养基（proliferation medium,PM）为阴性对照组（PM组）。体外诱导的第1、4和7天检测细胞DNA含量,第7和14天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及定量检测,第21和28天进行茜素红染色及定量检测,第1、4、7和14天分别进行成骨相关基因的检测。体内实验使用6只裸鼠,于其背部正中做皮肤切口,向两侧分离出4个皮下植入腔,分别植入：（1）单纯β 磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）支架（支架对照组）;（2）β-TCP支架+hASCs（体外PM培养1周）（增殖细胞对照组）;（3）β-TCP支架+hASCs（体外OM培养1周）（诱导细胞对照组）;（4）β-TCP支架+hASCs（体外OM+150 μg/L BMP-2/7培养1周）（实验组）。植入后4周进行取材,标本制成组织学切片,进行HE和Masson三色染色分析。结果：体外诱导后第1天,实验组细胞DNA含量与PM组差异没有统计学意义（P>0.05）,第4天时实验组细胞DNA含量较PM组升高（P<0.05）,第7天时组间DNA含量没有明显差异（P>0.05）。诱导7天和14天后,实验组的ALP染色及定量检测均高于OM组和PM组（P<0.05）;第21和28天矿化结节染色及钙沉积定量检测均高于OM和PM组（P<0.05）。诱导第1天时实验组的成骨相关基因（Runx2、ALP、COL-1A1）的表达量即高于PM组 (P<0.05),诱导第4天时骨钙素（osteocalcin,OC）基因表达量即开始升高,第4、7和14天的基因表达量较OM和PM组显著升高（P<0.05）。HE染色分析可见实验组和诱导细胞对照组的hASCs能分泌出嗜酸性较强的均质细胞外基质,出现了强嗜酸性的类骨组织;与诱导细胞对照组相比,实验组的细胞外基质嗜酸性更强,类骨组织的面积更大,结构更加典型;其他两对照组均未见矿化基质和类骨组织生成。Masson三色染色分析可见实验组呈强阳性表现,细胞基质中充满绿染的胶原;诱导细胞对照组和增殖细胞对照组的细胞基质中有不同程度的阳性表现,但较之实验组,胶原的数量明显减少;单纯支架组未见胶原的表达。结论：BMP-2/7在hASCs的成骨分化过程中发挥了重要作用,能够有效促进hASCs的体外和体内成骨分化。