全反式维甲酸对K562细胞的诱导分化作用

目的：全反式维甲酸(ATRA)对肿瘤细胞具有广泛的抑制增殖、促进分化作用。本研究通过体外培养检测ATRA对K562细胞是否具有诱导分化作用。方法：采用联苯胺染色、瑞氏染色、非特异性酯酶染色、硝基四唑氮蓝还原试验4种不同的染色方法及流式细胞术,观察经1μmol/L及2.5μmol/L ATRA诱导1d,4d,5d后,K562细胞出现诱导分化特征。结果：1μmol/L及2.5μmol/L ATRA均可诱导K562细胞向粒系分化。培养4d,1μmol/L ATRA组61.5％的K562细胞、2.5μmol/L组39％的K562细胞显示出向粒系成熟方向分化;培养5d,处理组的分化细胞数仍明显高于对照组(P<0.05),但两种浓度ATRA的诱导分化强度无统计学差异(P>0.05)。且均未出现向红系或单核细胞方向分化的特征。流式细胞仪检测ATRA诱导前后CD13及CD71的表达,1μmol/L ATRA诱导K562细胞1d,CD13抗原表达阳性率为8.0％,2.5μmol/L组则为6.7％,均高于对照组(2.1％)。培养5d,1μmol/L和2.5μmol/L AFRA组的CD13分别升高到28.1％,37.8％,而CD71则分别下降至1.2％和0.9％。与对照组比差异均具有显著性(P<0.05)。结论：ATRA可诱导K562细胞向粒系成熟方向分化。     

K562细胞诱导分化过程中早期生长反应基因mRNA表达的研究

目的 通过12-0-十四酰基咐哌醇-13-乙酸酯(TPA)诱导K562细胞分化,探讨白血病细胞早期生长反应基因(EGR-1)的表达及与细胞分化的关系。方法应用体外细胞培养技术通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化的情况;用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应等技术检测细胞周期、纽咆表面分化抗原CD33、CD14及EGR-1 mRNA的表达。结果 TPA作用后K562细胞形态趋向成熟分化,非特异性酯酶(NSE)染色阳性,多可被氟化钠抑制;多数细胞被阻滞在G0 G1期,S期细胞减少;随处理时间的延长细胞表面抗原CD33,表达有所减少,CD14表达逐渐增多;EGR1 mRNA仅在TPA诱导K562细胞分化过程中表达。结论 TPA可诱导K562细胞向单核或巨噬细胞分化;EGR1-mRNA在TPA诱导K562细胞分化过程中才有表达,它可能参与K562细胞向单核或巨噬细胞分化的过程,并在诱导和维持细胞分化方面可能发挥重要作用。     

不同铁状态下HL-60细胞中IRP_2 mRNA和TfR mRNA的表达

目的探讨不同铁状态下IRP2 mRNA和TfR mRNA在HL-60细胞中的表达以及二者之间的关系。方法将FeCl3或去铁胺(Desferrioxamine,DFO)加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,使HL-60细胞处于缺铁或富铁的状态下进行培养。于细胞培养后第12、24和48小时收集各组细胞,提取总RNA。采用RT-PCR半定量法测定IRP2 mRNA和TfR mRNA的相对表达量。结果①各实验组之间IRP2 mRNA的表达量变化不大,无明显差异(F组间=1.199,P>0.05)。细胞培养时间对IRP2 mRNA的表达有影响,差异有显著性(F组内=43.418,P<0.05),表现为随时间的延长,IRP2 mRNA的表达降低。②各实验组之间TfR mRNA的差异有显著性(FW-S=7.184,F组间=113.926,P<0.01)。在加入DFO的两个实验组中TfR mRNA表达升高。在加铁的两个实验组中,与对照组相比较,在12h时TfR mRNA的表达量上升,24h时达到高峰,之后迅速下降。结论①铁或去铁胺对HL-60细胞IRP2 mRNA的表达无直接影响。②当细胞内铁降低时,TfR mRNA的基因表达则增加;当细胞内铁增加时,TfR mRNA的基因表达则降低。     

促红细胞生成素增加K562细胞转铁蛋白受体的表达及其对细胞周期的影响

目的探讨重组人促红细胞生成素(recombinant human erythroipoitin,rhEPO)和铁对白血病细胞K562转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)即CD71抗原表达的影响,及其相同处理因素对K562细胞周期变化的影响.方法体外培养K562细胞并加rhEPO等处理因素,分别在24 h和72 h终止处理,各处理组细胞分别与FITC荧光标记的CD71单抗孵育,或与DNA染料碘化丙啶作用.通过流式细胞分析技术检测CD71抗原的表达和细胞周期,观察各组TfR表达情况和S期细胞百分率.结果 (1)不同浓度的rhEPO培养K562细胞72 h,均可使TfR表达增加,与同期空白对照组相比差异有显著意义(P＜0.05).(2)单独使用rhEPO(5 U/ml)或rhEPO(5 U/ml)+FeCl3(100 μmol/L)培养细胞72 h可使S期细胞百分率上升,且与空白对照组相比差异有显著意义(P＜0.05).结论 rhEPO可通过增加白血病细胞转铁蛋白受体的表达而增加DNA的合成.     

槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响

目的 观察槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用以及对相关基因表达的影响,探讨槐耳清膏联合羟基脲抗白血病作用的效果及分子作用机制.方法 取体外培养、对数生长期的白血病细胞株K562细胞用于实验研究;应用四甲基偶氮唑盐比色法和细胞形态学观察槐耳清膏联合羟基脲对体外培养的K562细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术观察槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的凋亡诱导作用;采用RT-PCR技术检测K562细胞bcr-abl、bax和bcl-xl mRNA表达水平的变化.结果 槐耳清膏单用及联合羟基脲均对K562细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用,且两药联合应用具有协同作用;两药单独应用均可不同程度下调bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达,联合应用时具有协同作用;槐耳清膏亦可下调bcr-abl mRNA的表达,而羟基脲对其表达无明显影响,两药联合对bcr-abl mRNA表达未见有协同作用.结论 槐耳清膏可协同羟基脲抑制K562细胞增殖及诱导K562细胞凋亡;槐耳清膏诱导K562细胞凋亡可能与下调K562细胞bcr-abl, bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达有关;槐耳清膏联合羟基脲对K562细胞的抑制增殖和诱导凋亡的协同作用机制可能与两药协同下调bcl-xl mRNA的表达并上调bax mRNA的表达有关,而两药联合应用的协同作用机制并不是通过调节bcr-abl mRNA表达而实现的.     

铁剥夺对K562细胞动态铁池的改变及凋亡相关基因表达的影响

目的探讨去铁胺(DFO)对白血病细胞K562动态铁池(LIP)、凋亡和凋亡相关基因表达的影响及其分子机制。方法实验分为DFO组、DFO 三氯化铁组及空白对照组,分别采用钙黄绿素检测K562细胞LIP改变、流式细胞术观察K562细胞凋亡和RT-PCR测定K562细胞c-myc、Rbb、ax mRNA表达。结果1.不同浓度的DFO作用于K562细胞后,随培养时间延长及DFO浓度增加,LIP降低,细胞生存率逐渐下降,显示一定的时间剂量依赖性。2.不同浓度的DFO作用于K562不同时间后,细胞凋亡增加,高于对照组(P<0.05);3.RT-PCR结果显示,DFO能明显上调c-myc、Rb和bax mRNA表达(P<0.05)。结论DFO可诱导K562细胞凋亡;其诱导K562细胞凋亡作用可能与其螯合细胞内铁,降低细胞LIP,上调细胞凋亡相关基因c-myc、Rb、bax mRNA表达密切相关。     

苦参碱上调K562细胞γ珠蛋白 mRNA表达和诱导红系分化

目的研究苦参碱对K562细胞γ珠蛋白mRNA表达及红系分化作用。方法不同水平苦参碱诱导K562细胞6d,应用台盼蓝拒染试验细胞计数、联苯胺染色、Wright-Gimesa染色进行红系分化的研究,同时应用荧光定量RT-PCR技术来相对定量研究药物诱导后Gγ、Aγ珠蛋白基因mRNA表达水平的变化。结果K562细胞增殖抑制程度随苦参碱水平增大而增加,联苯胺染色阳性细胞数由未诱导时的0.7%最高可上升至15.7%,且在形态上出现向红系分化的特征,同时伴有Gγ珠蛋白mRNA表达增加。结论苦参碱可引起K562细胞增殖抑制,在诱导其向红系方向分化中伴有Gγ珠蛋白mRNA表达被上调,为药物诱导治疗β珠蛋白基因缺陷性疾病提供实验依据。     

ATRA对K562细胞HOXA5基因表达与细胞周期、凋亡的影响

目的本研究旨在通过全反式维甲酸(ATRA)对人髓系白血病细胞株K562细胞的干预来分析同源盒基因(HOX)A5的表达变化及其与细胞周期、凋亡的关系,探讨HOXA5在髓系白血病发生、发展过程中的作用,为临床治疗白血病提供实验依据。方法通过细胞增殖-毒性实验(CCK-8)筛选出ATRA干预K562细胞的最佳浓度值。流式细胞术检测10μmol/LATRA分别干预K562细胞24 h、48 h和72 h后,各组细胞的凋亡情况及细胞周期分布的变化。实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹法测定K562细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达情况,并分析HOXA5 mRNA及蛋白的表达与细胞周期、凋亡的关系。结果 K562细胞中可以检测到HOXA5 mRNA及蛋白的表达,ATRA干预K562细胞后HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高,细胞凋亡率明显增加(P0.05),细胞增殖周期被阻抑在G_0/G_1期,细胞增殖受抑,且HOXA5 mRNA及蛋白的表达量与细胞凋亡率呈正相关(r=0.944,r=0.826),与细胞周期G0/G1期增加百分比呈正相关(r=0.870,r=0.962),与S期降低百分比呈负相关(r=-0.946,r=-0.926)。结论 ATRA干预K562细胞后,细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高;ATRA可能通过上调HOXA5 mRNA及蛋白的表达抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡。     

Apollon siRNA联合川芎嗪对白血病细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察Apollon siRNA 靶向沉默Apollon 基因联合川芎嗪（TMP）对人慢性粒细胞白血病细胞株K562 增殖及凋亡的影响。方法 根据前期实验筛选出的干扰效果最佳的Apollon siRNA 片段,构建pGPHIGFP-Neo-Apollon 真核表达载体,并将构建成功的载体转染至K562 细胞。将实验分为细胞对照组（未行任何处理）、阴性对照组（转染阴性质粒载体）和RNA 干扰组（转染pGPHI-GFP-Neo-Apollon 质粒载体）,利用RT-PCR 法和细胞免疫荧光法分别检测各组细胞Apollon mRNA 及蛋白的表达情况;再于上述分组基础上新增TMP 组（施加320 μg/mL TMP）、TMP+ 阴性对照组和TMP+RNA 干扰组,应用MTT 法和流式细胞术分别检测各组K562 细胞的增殖能力和细胞凋亡率。结果 构建的pGPHI-GFP-Neo-Apollon 载体能在K562 细胞内稳定表达;RNA 干扰组Apollon mRNA 及其蛋白的相对表达水平明显低于细胞对照组和阴性对照组（均P<0.05）;RNA 干扰组K562细胞的增殖抑制率和凋亡率高于细胞对照组（P<0.05）,与RNA 干扰组及TMP 组比较,siRNA 转染联合TMP能显著提高K562 细胞的增殖抑制率和凋亡率（均P<0.05）。结论 Apollon siRNA 转染能显著抑制K562 细胞增殖并促进其凋亡,且与TMP 联合使用对提高K562 细胞的增殖抑制率和凋亡率具有显著协同作用,提示siRNA技术联合药物在白血病治疗中具有重要的潜在价值。     

脐血粒系祖细胞发育过程同源盒基因B7的表达及干预

目的 探讨人类脐血造血干细胞向粒系祖细胞发育过程中同源盒(HOX)B7 mRNA和蛋白的表达及全反式维A酸(ATRA)和(或)三氧化二砷(As2O3)对脐血粒系祖细胞发育过程中HOXB7表达的影响.方法 采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)、Western-blot技术测定空白对照组、ATRA组、As2O3组、ATRA+As2O3组造血干细胞向粒系祖细胞增殖过程中HOXB7 mRNA及蛋白表达水平.结果 1.琼脂糖凝胶电泳显示RNA电泳图的5 S,18 S,28 S 3条带型整齐,无明显拖尾及弥散,说明RNA结构完整,无明显降解.2.反转录PCR扩增各组均有目的 基因HOXB7和内参照ACTB基因的cDNA产物,与DNA分子Marker相比扩增产物大小分别如下:HOXB7为129 bp,ACTB基因为111 bp,与预定理论值大小符合.3.人类造血干细胞向粒系祖细胞增殖分化过程中,空白对照组、ATRA组、As2O3组及ATRA+As2O3组的HOXB7 mRNA第3天少量表达,第7天表达较强烈,第12天表达减弱;空白对照组、ATRA组的HOXB7蛋白在增殖分化的第3天少量表达,第7天表达较高,第12天表达减弱,As2O3组及ATRA+As2O3组的HOXB7蛋白的表达在各时间点无明显差异.4.与空白对照组比较,ATRA组HOXB7 mRNA及蛋白的表达上调(P<0.05),而As2O3组HOXB7的表达无明显差异(P>0.05).结论 HOXB7基因可能是人类造血干祖细胞向粒系祖细胞增殖分化过程的调控基因之一,HOXB7基因与粒系造血有相关性.ATRA治疗白血病的作用可能与调节HOX基因的表达有关.As2O3对HOXB7 mRNA及蛋白的表达无明显调节作用.     

苦参碱和川芎嗪抑制白血病细胞侵袭转移作用的实验研究

目的探讨苦参碱及川芎嗪对低氧(3%O2)培养条件下人B淋巴细胞白血病细胞株Raji细胞、人慢性髓系白血病细胞株K562细胞侵袭转移的抑制作用及机制。方法体外常规培养细胞,低氧环境下继续培养24 h后,分别加入终浓度为0、0.15、0.2、0.25 g/L苦参碱或0、0.1、0.15、0.2 g/L川芎嗪处理,以常氧培养不加药物的细胞为对照组,分别检测细胞黏附、迁移和侵袭能力,并以RT-PCR方法检测HIF-1α、VEGF mRNA的表达。结果低氧环境下Raji细胞和K562细胞的黏附、迁移和侵袭能力,以及HIF-1α、VEGF mRNA的表达均较常氧对照组显著增强(P<0.01)。0.15、0.2、0.25 g/L苦参碱均有效抑制低氧环境下Raji细胞的黏附、迁移和侵袭能力,并下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达(P<0.05)。0.2、0.25 g/L苦参碱均有效抑制低氧环境下K562细胞的黏附、迁移和侵袭能力并下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达(P<0.05)。0.1、0.15、0.2 g/L川芎嗪均有效抑制Raji细胞、K562细胞的黏附、迁移和侵袭能力,并下调HIF-1α、VEGF mRNA的表达(P<0.05),均呈剂量依赖性。结论苦参碱和川芎嗪能有效抑制低氧环境下Raji细胞和K562细胞黏附、迁移和侵袭能力,其作用机制可能通过下调细胞内HIF-1αmRNA的表达,从而减少VEGF mRNA的生成来实现。     

槲皮素逆转K562、K562/ADM细胞耐药性研究

目的探讨槲皮素对K562、K562/ADM细胞热休克蛋白70信使核糖核酸(HSP70 mRNA)及多药耐药基因信使核糖核酸(MDR1 mRNA)表达的影响。方法采用MTT法检测槲皮素对K562细胞生长的抑制作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测多柔比星化疗前、后加入槲皮素K562细胞HSP70 mRNA及MDR1 mRNA的表达,及K562/ADM细胞在槲皮素作用后加多柔比星化疗两者的表达情况。结果1.槲皮素对K562细胞的生长抑制作用随浓度增加而增强。2.槲皮素作用后加多柔比星化疗组K562、K562/ADM细胞中HSP70 mRNA及MDR1 mRNA表达均显著降低。多柔比星化疗后加槲皮素组与多柔比星化疗组比较,K562细胞HSP70 mRNA、MDR1 mRNA表达均无显著性差异。结论槲皮素对白血病细胞生长具有抑制作用,并能下调HSP70 mR-NA及MDR1 mRNA表达。槲皮素能增加白血病细胞对多柔比星敏感性,逆转白血病细胞对多柔比星的耐药性。     

β-榄香烯对K562细胞周期与细胞凋亡的影响及其机制探讨

目的探讨β-榄香烯(β-ELE)对人慢性髓性白血病细胞株K562细胞周期及细胞凋亡的影响及其机制。方法K562和不同浓度的β-ELE共同培养后,应用流式细胞仪技术和Hoe-chest33258/PI荧光染色法检测β-ELE对K562细胞周期及凋亡的影响,应用RT-PCR技术测定野生型p53活化片段(P21wild-type p53 activated fregmentl,P21WAF1)、Survivin mRNA水平。结果不同浓度β-ELE能使K562细胞阻滞于G1期,G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比明显下降,呈剂量、时间依赖性,且与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。β-ELE作用于K562细胞24h,48h后,在G0/G1期前,可见明显的亚二倍体(凋亡峰),其凋亡率呈剂量、时间依赖性,与对照组比较有显著意义(P<0.01)。Hoechest33258/PI免疫荧光技术发现β-ELE能使凋亡细胞数目明显增多(P<0.01)。RT-PCR结果显示β-ELE能下调K562细胞Survivin mRNA表达,上调P21WAF1mRNA的表达(P<0.01)。结论β-ELE能够阻止细胞K562细胞从G1期向S期转换。β-ELE可以诱导K562细胞凋亡,呈剂量、时间依赖性。β-ELE导致细胞周期阻滞可能与上调P21WAF1mRNA的表达有关;促进K562细胞凋亡机制可能与下调Survivin mRNA的表达有关。随着药物浓度的增加,P21WAF1mRNA表达增加,而SurvivinmRNA表达下降。     

低氧对K562细胞侵袭转移的增强作用

［摘要］目的：研究低氧对白血病细胞株K562细胞侵袭能力和转移能力的影响。方法：细胞体外常规培养,用浓度为1%,3%,5%的氧分别处理细胞24 h,以常氧培养K562细胞为对照组,通过细胞黏附实验检测细胞黏附力,细胞迁移实验检测细胞运动力,肿瘤细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭力,RT-PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）,MMP-2,MMP-9 mRNA的表达,Western blot检测细胞HIF-1α蛋白的表达。结果：与对照组相比,3%和5%的氧均增强K562细胞黏附力、运动力和侵袭力(P<0.05或P<0.01),而且还能上调K562细胞HIF-1α蛋白,HIF-1α mRNA,VEGF mRNA,MMP9 mRNA,MMP2 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01);而1%氧与对照组相比,以上各检测指标无明显变化(P>0.05)。结论：适度低氧能增强白血病细胞株K562细胞侵袭能力和转移能力,其机制可能是通过HIF-1α上调VEGF,MMP-2和MMP-9表达实现的。［中国当代儿科杂志,2009,11（7）：566-570］     

三氧化二砷对白血病细胞系K562和HL-60血管内皮生长因子表达的影响

目的研究三氧化二砷对白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养白血病细胞株K562、HL-60,加入不同浓度的As2O3干预,用Westem bloting和荧光定量RT-PCR测定VEGF的蛋白和mRNA表达。结果K562和HL-60细胞经As2O3作用后,VEGF的蛋白表达明显减少,但VEGFmRNA拷贝数无差异。结论As2O3在蛋白水平抑制白血病细胞VEGF的表达,从而抑制骨髓血管生成,抑制白血病细胞的生长。     

二烯丙基二硫诱导人白血病K562细胞凋亡及其对Fas、FasL及caspase-8表达的影响

目的：探讨二烯丙基二硫（DADS）诱导白血病 K562 细胞凋亡的作用及其机制。方法：采用 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞术分析不同浓度及不同作用时间 DADS 对 K562 细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR法检测DADS作用48 h后 Fas、FasL、caspase-8 mRNA的表达。结果：DADS可诱导K562 细胞凋亡。DADS(作用细胞24 h)浓度从10 mg/L增至40 mg/L时,其对K562细胞的凋亡率由（11.60±0.83）%增至（37.94±0.87）%;DADS(40 mg/L浓度组)作用时间从24 h增至72 h,其对K562细胞的凋亡率由（37.94±0.87）% 增至（47.02±0.66）%,各实验组随时间、浓度增加凋亡率明显增加 (P<0.05)。DADS作用48 h后,Fas、caspase-8 mRNA 表达水平较对照组上调;FasL mRNA 较对照组下调（P＜0.05）。结论：DADS 呈时间和浓度依赖性诱导白血病K562 细胞凋亡,其凋亡机制可能与上调 Fas、caspase-8,下调 FasL有关。