不同培养代数大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞转分化能力的比较

为确定诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)向神经元样细胞转分化的适宜培养代数,本研究比较了不同培养代数的BMSCs的转分化潜能。首先体外培养大鼠BMSCs并传代,于不同的培养代数利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、全反式维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导分化,随后运用免疫荧光法和免疫印迹法检测诱导细胞中的神经元样细胞。结果显示骨髓基质细胞体外培养1至3代时能够被诱导分化为神经元样细胞,培养至第7代时丧失转分化为神经元样细胞的潜能。上述结果提示:传代次数增多将引起BMSCs自发分化,使其向神经元样细胞转分化的能力下降,因而BMSCs培养至第3代时适宜进行诱导分化。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元

目的:联合应用不同生长因子与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)体外诱导人骨髓间充质干细胞(hBMSCs),探讨体外hBMSCs向神经元和多巴胺能神经元分化的潜能。方法:获得正常人BMSCs并纯化,先用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)进行预诱导,再用胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合诱导第3代生长良好的BMSCs向神经元分化。利用倒置显微镜观察BMSCs分化过程中细胞形态的变化;通过RT-PCR方法检测诱导前后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果:不同浓度的AngⅡ诱导2周后,应用倒置显微镜观察到各组BMSCs具有典型神经元样的细胞形态,大多呈双极、多极和锥形;RT-PCR方法检测显示NSE、TH的基因表达量在诱导组较其对照组有显著性增加(P<0.05)。结论:多种生长因子联合AngⅡ可以在体外诱导人BMSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。     

右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子诱导大鼠骨髓基质细胞分化为 神经元样细胞

背景：既往研究证实补肾益精中药能体外诱导骨髓基质细胞转化为神经元样细胞。 目的：观察右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化作用。 方法：密度梯度离心法结合贴壁培养法培养大鼠骨髓基质细胞,将传3代的骨髓基质细胞用右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子诱导向神经元样细胞分化,并设单独碱性成纤维细胞生长因子组和正常组为对照。 结果与结论：诱导7 d后,光学显微镜下观察右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子诱导组部分细胞呈双极或多极神经元形态。免疫组织化学染色结果显示,与正常组和单独碱性成纤维细胞生长因子组相比,右归丸+碱性成纤维细胞生长因子组细胞中神经元特异性醇化酶、巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白阳性率明显增高(P < 0.05)。结果说明,右归丸联合碱性成纤维细胞生长因子可体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞(ESCSCs)的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况,本文从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清限定性培养基培养,并通过添加维甲酸(RA)、音猬因子(SHH)和神经营养因子-3(NT-3)等诱导因子,进行干细胞体外诱导,用免疫荧光细胞化学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明:从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,通过含EGF和bFGF的限定性培养基培养可获得干细胞球,通过添加RA、SHH和NT-3等诱导因子后,可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示,胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ESCSCs性状,在添加特殊因子的条件下,并在体外ESCSCs可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。     

定向诱导人尿液细胞源性多能干细胞向多巴胺能神经元的分化

目的探讨定向诱导人尿液来源诱导性多能干细胞(U-iPS)向多巴胺(DA)能神经元分化。方法单层贴壁法体外培养U-iPS,通过时向性添加TGF-β及BMP信号通路抑制剂,SHH细胞因子,GSK3β抑制剂Chir99021将U-iPS诱导为DA能神经前体细胞(NPCs),通过添加BDNF/GDNF等细胞因子将其进一步分化为DA能神经元。在诱导分化的4个时间点(第0天、7天、14天及25天)采用RT-qPCR和免疫荧光检测多能干细胞标志物Oct4与Nanog的表达;NPCs标志物Nestin、Pax6和Foxa2的表达;DA神经前体细胞标志物Lmx1a和En1的表达;神经元标志物Tuj1的表达以及DA能神经元标志物TH的表达情况。以人皮肤成纤维细胞来源的iPS(F-iPS)向DA能神经元的诱导分化作为对照进行分化效率的比较。结果 U-iPS在第0天表达多能干标志物Oct4和Nanog;诱导第7天能转化为Nestin、Pax6及Foxa2阳性的NPCs;第14天转化为Lmx1a和En1阳性的DA能神经前体细胞;第25天分化得到的神经元样细胞表达神经元标志物Tuj1,其中部分细胞表达DA能神经元标志物TH。各时间点神经类细胞标志物的表达与F-iPS诱导分化得到的神经类细胞标志物的表达差异无统计学意义(P0.05)。结论 U-iPS细胞具有向DA能神经元分化的潜力,能在体外经过诱导分化得到TH阳性的DA能神经元,且与F-iPS向DA能神经元分化的效率无明显差异。     

小鼠胚胎干细胞的体外培养及诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元

探索小鼠胚胎干细胞 (ES)在体外培养及向酪氨酸羟化酶阳性神经元诱导分化的可能性。将小鼠胚胎干细胞在含有白血病抑制因子 (LIF)的ES培养基中扩增 ,并通过以下几个步骤 :胚胎体的形成、巢蛋白 (Nestin)阳性细胞的筛选、Nestin阳性细胞的体外扩增及撤除碱性成纤维细胞生长因子等后观察向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化。结果表明小鼠胚胎干细胞在含有LIF的特定培养基中能够稳定传代并保持不分化状态 ,经过无血清培养基的筛选和培养 ,在SonicHedgehog(SHH)及成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor 8,FGF8)等细胞因子的作用下能定向分化成酪氨酸羟化酶阳性神经元。这种方法有望为帕金森病等神经变性病的细胞移植治疗提供充足的细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞,在体外一定条件下可向神经细胞分化。本实验通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs,并用脑源性神经营养因子(BDNF)、forskolin(FSK)和多巴胺(DA)联合对BMSCs进行诱导,电子显微镜观察诱导后细胞是否具有成熟神经元的超微结构特点;免疫细胞化学和RT-PCR检测DA能神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3、和Lmx1b的表达。结果显示:诱导2周后,电镜下可见细胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体,以及神经丝。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学表明诱导2周后TH阳性细胞的表达较诱导3d后明显提高。上述结果表明BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs定向分化为DA能神经元。     

成纤维细胞生长因子2和丹参酮ⅡA在大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的 探讨成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA）在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化中的作用。 方法 体外分离、培养BMSCs,利用流式细胞术进行鉴定。实验分组：对照组（不加任何诱导剂）、FGF-2组、丹参酮ⅡA组及两者联合诱导组。MTT检测诱导后的活性及增殖情况;Real-time PCR检测早期心肌转录因子GATA-4、Nkx2.5的表达;免疫细胞化学染色法检测缝隙连接蛋白43(Cx43)以及心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的表达;免疫荧光化学染色法检测结蛋白(desmin)、原肌球蛋白（Tm）的表达;Western blotting检测结蛋白、Tm的表达。 结果 各诱导组较对照组增殖明显。与对照组相比,诱导组GATA-4和Nkx2.5基因的表达增强,联合组表达量最高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。联合诱导组各标记物Cx43、cTnI、结蛋白、Tm的阳性表达率高于FGF-2及丹参酮ⅡA单独诱导组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blotting结果显示,联合诱导组结蛋白、Tm的表达量明显高于其他实验组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。透射电子显微镜结果显示,诱导后细胞的细胞核居中,细胞质中可见肌丝、粗面内质网、线粒体和核糖体。 结论 FGF-2和丹参酮ⅡA均能促进BMSCs增殖,诱导BMSCs分化为心肌样细胞,两者联合诱导的效果较其他组更佳。     

体外诱导脂肪基质干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：鉴于脂肪干细胞具有来源丰富、取材简便、易分离纯化和扩增、可进行自体移植并有多项分化潜能等特点,有学者认为其可作为治疗帕金森病的种子细胞来源。 目的：观察大鼠脂肪基质干细胞体外向多巴胺能神经元诱导分化及分泌功能。 方法：利用胶原酶消化法获得SD 大鼠脂肪干细胞,体外培养至第 3代时用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和抗坏血酸联合诱导作为实验组,以单纯加入体积分数5%血清为对照组。 结果与结论：实验组诱导3 d后,免疫荧光法和免疫组织化学法均可检测到诱导后的细胞表达酪氨酸羟化酶。实验组分化出多巴胺能神经元比例显著高于对照组(P < 0.01)。ELISA法检测实验组连续诱导3 d上清中有多巴胺分泌,诱导的第一二天中多巴胺浓度呈上升趋势,第3天有所下降。说明脂肪干细胞具有向多巴胺能神经元分化的能力。     

灯盏花素注射液对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探索灯盏花素注射液体外诱导大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)分化为神经元和胶质细胞的可行性。方法贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质细胞。第4代细胞行表型鉴定后,用灯盏花素注射液诱导,每6h倒置相差显微镜观察形态变化,免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞的神经元特异性稀醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测不同浓度灯盏花素注射液诱导后细胞的活力,流式细胞术及RT-PCR检测诱导前后细胞中NSE、GFAP mRNA的表达变化。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,诱导18h后BMSCs胞体开始收缩,有突起伸出,24h后突起增多形成网络结构。免疫细胞化学染色,NSE阳性表达率为(48.7±3.4)%,GFAP阳性表达为(56.8±4.2)%,流式细胞仪检测诱导24h后的细胞NSE及GFAP蛋白表达量均较未诱导组升高,RT-PCR检测诱导后细胞表达NSE、GFAP mRNA,未诱导的细胞则不表达。结论灯盏花素注射液可诱导大鼠骨髓间充质细胞在体外分化为神经元和神经胶质细胞。     

新生乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间质干细胞向视网膜神经样细胞分化

目的：探讨体外培养的新生乳鼠视网膜细胞对骨髓间质干细胞的诱导分化作用。方法： 取成年Wistar大鼠股骨全骨髓细胞体外培养，经多次传代后获得高纯度的骨髓间质干细胞。以新生乳鼠视网膜细胞作诱导条件，采用分层共培养的方法诱导骨髓间质干细胞。倒置相差显微镜观察骨髓间质干细胞与新生乳鼠视网膜细胞共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微丝微管相关蛋白-2(Map-2)、Thy 1.1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等特异性标记物的表达；RT-PCR进一步分析诱导后细胞表达nestin、NF、NSE、Thy 1.1及Ran等mRNA的情况。结果：新生乳鼠视网膜细胞作诱导剂，诱导48 h后可见部分细胞长出突起并向视网膜神经元特性样的细胞分化，最长可维持10 d。结论： 骨髓间质干细胞在体外培养的新生乳鼠视网膜细胞的诱导作用下可以向视网膜神经元样细胞分化。     

麝香多肽体外诱导成年大鼠和人骨髓间充质干细胞定向分化为神经元的研究

目的:观察麝香多肽体外定向诱导成年大鼠和人骨髓间质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)分化为神经元的能力。方法:采用含100-150mg/L麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导成年大鼠和人BMMSCs分化为神经元,免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经巢蛋白(nestin)的表达。结果:成年大鼠和人BMMSCs在加入含麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导后,BMMSC胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:麝香多肽可以在体外诱导成年大鼠和人BMMSCs定向分化为神经元。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化蛋白的表达

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外神经分化蛋白的表达。方法采用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓MSCs。取生长状态良好的第1、3、7代细胞绘制生长曲线,免疫细胞化学法鉴定其性质,检测巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果细胞传代后1-2d为滞留期,3d后达对数生长期,第6d进入平台期。免疫细胞化学法鉴定大鼠骨髓MSCsCD44呈阳性,CD34呈阴性,nestin、NSE、MAP2、GFAP、TH均呈不同程度的阳性表达,其阳性表达率分别为(25.5±5.6)%、(14.2±2.1)%、(1.4±0.5)%、(4.5±1.2)%、(3.6±1.2)%。结论大鼠骨髓MSCs在体外能自发地表达神经干细胞和神经细胞的某些标志蛋白,这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法:采用Ficoll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,FGF-2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10⁶,15代可获得(2-3)×10¹²个细胞,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。FGF-2促进hMSC生长,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:丹参酮ⅡA可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45。采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化。免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显。GFAP在诱导10d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10dNestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达。结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化。     

Enriched NCAM-positive cells form functional dopaminergic neurons in the rat model of Parkinson's disease

We describe a method of generating an enriched population of NCAM-positive cells from a human teratocarcinoma cell line (NTera2/D1) and their differentiation into midbrain dopaminergic neurons in the absence of the caudalizing factor retinoic acid (RA). NTera2 cells were induced to form embryoid bodies and then to generate nestin-positive cells on treatment with serum-free defined medium supplemented with neurotrophic factors. We enriched the neuroprogenitor population by magnetic sorting of the nestin-positive cells using the antibody to neural cell adhesion molecule (NCAM). These cells were expanded by exposing them to the signaling molecule sonic hedgehog (SHH) in conjunction with fibroblast growth factor-8 (FGF-8). The predifferentiated cells when analyzed by RT-PCR showed expression of dopaminergic markers such as Nurr1, Engrailed-1, aromatic amino decarboxylase (AADC), VMAT2, tyrosine hydroxylase (TH), and dopamine transporter (DAT). These cells also stained positively for protein markers such as nestin, NCAM, MAP-2, and TH. We further demonstrated that when transplanted into the brain of Parkinsonian rats, these neuroprogenitor cells did not form tumors but differentiated into dopaminergic neurons, as revealed by TH immunolabeling. The origin of transplanted cells were further confirmed by positive immunolabeling with anti-human nuclei. Our results suggest that enriching the neuroprogenitor population by magnetic sorting prevents tumor formation and is a prerequisite before cell replacement therapy for Parkinson's disease.     

大鼠骨髓间质干细胞用肾上腺素类激素诱导为神经细胞的研究

目的:体外诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经细胞。方法:SD大鼠股骨骨髓细胞体外扩增。用肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素注射液分别加入无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经细胞。免疫细胞化学鉴定有神经元烯醇化酶(NSE)、神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞在体外扩增5-22代,对照组不加任何诱导剂,有53%的神经样细胞。加入肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素诱导1-5h,约70%MSC形态转变为典型的神经样细胞。免疫细胞化学显示诱导出的神经样细胞NSE、nestin、GFAP表达阳性。继续培养5d后对照组神经样细胞逐渐凋亡。肾上腺素类各组虽存活6d,但细胞正常形态改变,部分细胞死亡漂浮。一瓶MSC在正常培养至第7代时,自发出现约50%的神经细胞,传至第13代,有约60%的神经细胞(66.5%±6.4%)。结论:骨髓本身可能存在着神经干细胞。大鼠骨髓间质干细胞用肾上腺素类诱导可分化为多种形态的神经细胞。     

不同血清浓度对bFGF联合EGF诱导BMSCs向神经细胞分化的影响

目的:探讨不同血清浓度条件下碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)联合表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经细胞分化方向的影响。方法:全骨髓贴壁法体外分离培养BMSCs,流式细胞法检测BMSCs表面骨髓基质标志CD90和造血细胞标志CD45,MTT法绘制第3(P3)代BMSCs生长曲线。取P4代细胞分为3组给予不同诱导条件,分别给予含20 ng/ml的bFGF和20 ng/ml EGF的无胎牛血清(A组)、10 ml/L胎牛血清(B组)及100 ml/L胎牛血清(C组)的DMEM/F-12培养液进行诱导,倒置显微镜观察细胞的形态变化,诱导6 d时免疫组织化学法检测细胞内神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,台盼蓝染色检测各组细胞的活力。结果:BM-SCs经3-4次传代培养后形态大致呈单一的长梭形或扁平形,流式细胞鉴定显示CD90阳性,CD45阴性;细胞生长曲线近似呈"S"形;诱导后可见细胞胞体收缩,呈双极、多极并伸出突起;诱导6 d时3组活细胞率分别为:86.57%、95.29%、97.32%;免疫组化各组均见NSE、GFAP表达,3组NSE阳性率高于GFAP,A组NSE阳性率高于B、C组,差异具有统计学意义(P<0.01),C组NSE阳性率高于B组,差异具有统计学意义(P<0.01),A组GFAP阳性率低于B、C组,差异具有统计学意义(P<0.01),C组GFAP阳性率高于B组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:bFGF联合EGF可诱导BMSCs向神经细胞分化,在无血清条件下趋向于向神经元分化,在高浓度血清条件下趋向胶质细胞分化。