弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因的体外扩增及克隆

目的：构建大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因重组质粒。方法：从雌性SD大鼠脑组织中提取总RNA，根据OSCP基因已知序列，设计合成1对引物，用PCR方法扩增编码OSCP的基因片段，插入pGEM-T easy质粒，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，经酶切鉴定，而后进行测序。结果：OSCP基因体外扩增产物大小为700bp，重组质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论：在国内初次克隆了大鼠OSCP基因，为下一步OSCP的表达及功能研究奠定了基础。     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建

目的：构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶（NTPase-Ⅱ）重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法：采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果：NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论：成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序

目的：构建弓形虫ZS2分离株pWR450-1-MIC1原核表达重组质粒，为进一步表达及免疫做准备。方法：用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位，自行设计引物，用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白1（MCC1）的基因片段，经酶切，连接，重组入pWR450-1原核表达载体，再经含氨苄培养基筛选，酶切，PCR鉴定和测序。结果：从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段，克隆成功pWR450-1－MIC1重组质粒，测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致。高度保守，为下一步表达及免疫奠定基础。     

人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

弓形虫新基因wx2黄色荧光蛋白标记质粒的构建与鉴定

目的 构建弓形虫新基因wx2黄色荧光蛋白标记的黄色荧光超表达质粒,为进一步研究弓形虫新基因WX2的功能提供工具.方法 采用PCR扩增出编码wx2目的 基因,用BglⅡ,AvrⅡ分别对PCR扩增产物和ptubYFP-YFP/sagCAT进行双酶切.将wx2定向克隆到tubYFP-YFP/sag-CAT;对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果 特异扩增出预计wx2目的 基因片段,大小为558 bp;扩增产物成功连接到ptubYFP-YFP/sagCAT中,经PCR,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有基因wx2读框.结论 成功构建弓形虫新基因wx2黄色荧光超表达质粒wx2一tub-YFP sag/CAT.     

弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的：构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒，为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法：自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子，用酚／氯仿法提取基因组DNA，用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化)，定向插入到PQE-30表达质粒中，转化入TG1宿主菌，在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子，采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果：阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp，通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论：成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

目的：构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TS045-4B的真核表达质粒pcDNA3．1／TS045-4B。方法：全基因合成TSO45-4B的基因序列，并利用PCR扩增该基因序列，将其插入真核表达载体pcDNA3．1，经酶切、测序鉴定。结果：经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因。结论：成功构建pcDNA3．1／TS045-4B重组质粒。     

刚地弓形虫P30两个不同片段的克隆、表达及鉴定

目的：构建刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因的2个不同片段的克隆并进行表达、鉴定。方法：根据已发表的弓形虫P30基因序列，参考有关文献设计合成两对引物，用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段，分别构建T-A克隆，经PCR扩增及酶切鉴定后，进行测序，再亚克隆入pMAL—p2质粒并转化DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素LB平板上初步筛选阳性克隆，再经酶切及PCR扩增鉴定重组子。将重组子转入表达菌BL21，用IPTG进行诱导表达，并对所表达的蛋白以western blot鉴定，结果：成功构建相应的T-A克隆及pMAL—p2亚克隆，经诱导、表达和鉴定，证实2个表达产物均为目的蛋白，其分子量分别为70和73Ku。结论：成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物，为其进一步的纯化及应用奠定了基础。     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

弓形虫MIC8基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫微线体MIC8的真核表达重组质粒。方法设计合成弓形虫MIC8引物,运用PCR方法扩增其基因片段克隆至真核表达质粒pCDNA3．1,从而构建重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8。结果PCR扩增弓形虫MIC8基因序列正确,构建的重组表达质粒pCDNA3．1-MIC8经PCR、HindⅢ和XbaⅠ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒3-pCDNA3．1－MIC8,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

抗弓形虫感染ROP2核酸疫苗的研究

目的研究弓形虫核酸疫苗，以用于弓形虫病的防治。方法根据ROP2基因序列，设计合成能表达ROP2完整蛋白基因的扩增引物，扩增ROP2靶基因并克隆于PUCm—T载体，然后再亚克隆于真核表达载体pe—DNA3质粒中，制备弓形虫pe—DNA3—ROP2核酸疫苗；应用裸pc—DNA3—ROP2免疫小鼠，通过免疫学指标的检测，评价小鼠的免疫应答反应，最后应用弓形虫RH株攻击实验，评价出该疫苗的有效保护率、安全性和在人类及畜类的应用价值。结果以ROP2基因为模板，PCR扩增出1.7kb DNA条带，与预想结果一致；将扩增DNA回收并成功的克隆了ROP2（PUCm—T—ROP2），然后亚克隆并构建了pe—DNA—ROP2重组体，通过酶切、PCR扩增和基因测序证明亚克隆的重组子正确，ROP2扩增基因包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列；在应用疫苗免疫接种小鼠结果显示。疫苗接种能使小鼠产生强烈的细胞、体液免疫反应；攻击实验结果显示，实验组小鼠的存活时间明显延长。并且开始死亡时间明显延迟（P〈0.001），实验组9只小鼠中有1只长期存活；在实验的整个过程中，没有发现小鼠对免疫接种的毒性和异常反应。结论该疫苗免疫原作用强，具有很好的开发应用价值，目前可在动物群体中试验应用。     

携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

①目的构建携带人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7病毒癌基因的复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。②方法应用PCR技术从宫颈癌组织中扩增E7病毒癌基因全长片段,并导入T载体进行测序,与Nucleotide中HPV16标准毒株序列比较鉴定。目的基因及穿梭质粒载体pAdTrack-CMV分别经Bgl Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后连接,转化宿主菌E．coli DH5α,应用PCR法及限制性内切酶消化法双重鉴定重组质粒,并测序。③结果PCR扩增产物与Nucleotide中HPV16E7序列一致,重组穿梭质粒经Bgl　Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后电泳,可观察到9220bp大小的载体条带和313bp大小的目的基因条带;将经PCR和双酶切鉴定的重组阳性克隆测序,结果证实克隆成功。④结论成功地构建了携带HPV16E7基因的重组腺病毒穿梭质粒。