肝癌新标志物人宫颈癌基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建表达截短型人宫颈癌基因(HCCR)-1蛋白的质粒,并进行原核表达、多克隆抗体制备。方法用逆转录聚合酶链反应法从HepG2细胞中扩增HCCR-1_(167-360) cDNA,将其克隆到原核表达载体pRSET-B上,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达。用纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了表达HCCR-1(167-360)蛋白的质粒,原核表达后纯化得到了分子量约为2.70×10~4的目的蛋白,用之免疫BALB／c小鼠获得了高效价的特异性多克降抗体。结论所获得的重组HCCR-1_(167-360)蛋白纯度高,免疫原性强。获得的抗HCCR-1_(167-360)多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性,为HCCR的临床检测和研究奠定了基础。     

淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达及多克隆抗体制备

目的为进一步研究蚊视蛋白参与杀虫剂抗性的相关分子机制和将其作为现场抗性检测靶标提供多克隆抗体。方法以前期制备的重组质粒pGEM-T Easy/opsin为模板,通过基因工程手段克隆视蛋白基因胞外区片段,构建原核载体,IPTG诱导表达蛋白,并利用His亲和层析以及肠激酶酶切片段获得纯度较高的蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western blot鉴定抗体特异性。结果成功构建淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达载体,经IPTG 1mmol/L诱导3h后高效表达可溶性重组蛋白,经His亲和层析及肠激酶酶切后获得纯度较高的蛋白,制备的多克隆抗体经Western blot证实能特异性地识别蚊视蛋白而不与非特异性蛋白结合。结论成功构建了淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达载体,制备的抗重组蛋白多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步研究视蛋白参与杀虫剂抗性的分子机制和将其作为现场抗性检测靶标提供了基础。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

新肿瘤睾丸抗原Ropporin重组蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建新肿瘤睾丸抗原Ropporin原核表达载体,表达和纯化人Ropporin重组蛋白,并制备其兔抗血清.方法:人Ropporin全长cDNA克隆入pQE30载体,在大肠杆菌中利用IPTG诱导表达并纯化人Ropporin重组蛋白.利用人Ropporin重组蛋白免疫兔,制备人Ropporin多克隆抗体.结果:以构建的pQE30-Ropporin质粒转化大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达和纯化得到相对分子质量与鼠Ropporin蛋白一致的蛋白质,利用其免疫动物后.Western blot检测显示该蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗血清效价>1:512 000,对该蛋白具有高度特异性.结论:利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化了2LRopporin重组蛋白,并成功制备了人Ropporin多克隆抗体.     

新型冠状病毒Nsp16蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达新型冠状病毒Nsp16重组蛋白并制备兔抗Nsp16多克隆抗体。方法通过琼脂糖凝胶电泳对含有Nsp16基因的重组质粒进行双酶切鉴定,并将鉴定后的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞;通过IPTG诱导重组蛋白的表达,利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白并进行Western blot鉴定;将鉴定后的目的蛋白与弗氏佐剂以1:1的体积比混匀,乳化后免疫新西兰大白兔,利用ELISA和Western blot分别进行多克隆抗体效价的测定及其特异性鉴定。结果Nsp16基因重组质粒经双酶切后得到912bp的目的片段,重组质粒转化大肠埃希菌表达出分子质量单位为33.3ku的重组蛋白,且主要存在于上清中。用纯化的重组蛋白免疫大白兔,获得兔抗Nsp16特异性多克隆抗体,且其效价达1:409600以上。结论重组Nsp16蛋白可以在大肠埃希菌中正确表达,免疫大白兔后获得高效价抗Nsp16多克隆抗体,即具有免疫反应性。为SARS-CoV-2Nsp16蛋白在新型冠状病毒肺炎中的进一步研究奠定了基础。     

新型冠状病毒M蛋白表达及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的利用原核表达系统表达新型冠状病毒M蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并与M真核质粒免疫效果相比较,为新型冠状病毒感染检测试剂盒的研制奠定基础。方法将酶切鉴定正确的原核重组表达载体PMAT-9s-M转化BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达M蛋白并进行鉴定。M蛋白经镍离子亲和层析柱纯化浓缩后免疫大白兔,制备多克隆抗体。将M真核重组质粒转化至DH5α,碱裂解法大量抽提质粒后免疫大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA检测2种抗血清的抗体效价,采用Western blot检测2种抗血清与M蛋白的反应性。结果PMAT-9s-M转化BL21后表达70 ku的His-MBP-M融合蛋白,且该蛋白主要存在于包涵体中。纯化后免疫大白兔,制备的多克隆抗体血清效价与真核重组质粒免疫制备的抗血清抗体效价均达1︰16000,且2种抗血清均与凝血酶切M蛋白有良好反应性。结论原核表达的M蛋白免疫制备的多克隆抗体特异性强,效价高,且重组M蛋白制备简便、经济高效,为新冠病毒感染诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

人突触相关蛋白抗原表位分析及多克隆抗体的制备

目的　泡沫化细胞差异表达基因FRG4经生物信息学分析 ,与人突触相关蛋白基因有很高同源性 ,经联机检索 ,有关突触相关蛋白的研究很少 ,与脂蛋白代谢、泡沫细胞形成和凋亡的关系没有报道。本文在对泡沫化相关基因FRG4分析的基础上 ,利用计算机软件进行抗原表位分析 ,制备特异的抗人突触相关蛋白的多克隆抗体 ,为进一步深入研究其表达和功能提供条件。方法与结果　①选取抗原多肽 :利用ExPASy软件和BioEdit软件对FRG4cDNA序列进行亲水性分析 ,预测其二级结构 ;使用Lasergene99软件预测其抗原决定族 ;根据亲水性、二级结构、偶联难易及实验难度选取抗原 13肽PKLVKEEVFWRNY。②多肽合成及交联 :采用美国ABI公司的多肽自动合成仪 ,以固相合成法合成 ,合成产物经高效液相色谱纯化检测 ,纯度达到 90 %以上 ;抗原多肽与血兰蛋白用BDB法交联 ,与不完全弗氏佐剂等体积混合包被。③动物免疫 :多点皮下注射抗原免疫新西兰兔 ,每两周强化免疫一次 ,第三次免疫后 10天取耳血测抗体效价 (ELISA法 )。④抗血清收获及检测 :第四次免疫后第十至十四天经颈动脉放血 ,分离抗血清 ,冷冻抽干 ,- 2 0℃保存。高效液相色谱检测显示抗体纯度达 82 .79% ,抗体滴度为 1∶16 0 0 0 ,免疫印迹方法检测在 4 0kDa处有一条带 ,与软件分析     

反式作用因子中血清反应因子变化与心力衰竭关系的研究

目的研究反式作用因子与心力衰竭相关蛋白表达量变化的关系。方法运用生物信息学方法对4种心力衰竭相关蛋白质的基因序列5＇调控区进行反式作用因子定位分析,应用免疫组化法检测40例尸检心肌标本中血清反应因子水平。结果通过定位分析,预测出9种反式作用因子可能在心力衰竭发生发展过程中对心力衰竭相关蛋白发挥转录调控作用,选择其中的血清反应因子(SRF)为例,经免疫组化分析得出正常成人心脏中SRF量处于高水平,SRF阳性细胞百分率为(91.6±10.05)％;在慢性心力衰竭患者中SRF表达水平明显降低,仅(28.73±12.79)％,且SRF水平与心功能分级呈负相关;在急性心肌梗死患者中,SRF表达水平较慢性心力衰竭者高,为(45.33±13.30)％,较正常组仍明显降低。结论血清反应因子在心力衰竭发生发展过程中通过其自身量的变化对心力衰竭相关蛋白表达起转录调控作用。     

新型冠状病毒RDRP的原核表达、多克隆抗体制备及生物信息学分析北大核心CSCD

目的应用原核表达系统制备重组新型冠状病毒依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP),纯化后免疫新西兰大白兔获得高效价多克隆抗体,并对RDRP进行生物信息学分析。方法鉴定正确的pET-22b RDRP质粒转化表达载体,诱导表达RDRP蛋白,纯化后免疫大白兔,间接ELISA法检测其多克隆抗体效价。运用Expasy PortParam、SWISS MODEL等生物信息学软件对RDRP蛋白的等电点、分子质量、亲疏水性等理化性质、蛋白的空间结构、跨膜结构域、磷酸化位点、蛋白信号肽进行预测;构建系统进化树,进行亲缘性分析。结果pET-22b RDRP重组质粒酶切鉴定正确,经诱导重组蛋白以包涵体的形式表达,8 mol/L尿素梯度复性后得到纯度高的RDRP蛋白。用纯化蛋白免疫大白兔,间接ELISA检测血清抗体效价>1∶256000,Western blot检测抗体具有良好特异性。经生物信息学分析RDRP蛋白为亲水性,非跨膜蛋白,且无信号肽。11种病毒系统进化树显示,SARS-CoV-2 RDRP蛋白与SARS-CoV RDRP亲缘关系较近。结论成功获得重组SARS-CoV-2 RDRP蛋白,用该蛋白免疫大白兔能刺激产生高效价的多克隆抗体。预测与SARS-CoV RDRP亲缘关系较近,为亲水性非跨膜蛋白,为研究SARS-CoV-2 RDRP蛋白的生物学功能及其疫苗的制备奠定了基础。     

Asia1型口蹄疫病毒分离株P1基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达口蹄疫病毒Asia1/HeB株衣壳蛋白前体P1基因并纯化。制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法从重组克隆载体pGEM-P1中扩增编码P1区结构蛋白的基因片段。并克隆入原核表达载体pET-28a(+)中。原核表达与蛋白纯化后,免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。抗体效价及特异性检测分别用间接ELISA和Westernblot法鉴定。结果在大肠杆菌中成功表达了分子量约为80.475kDa的P1蛋白。ELISA法检测抗血清的效价可达到1∶25600,Westernblot分析抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合。结论在大肠杆菌中成功表达了口蹄疫病毒Asia1/HeB株衣壳蛋白前体,并制备了P1衣壳蛋白前体的抗血清,为进一步研究P1区结构蛋白的结构、功能以及抗原表位的确定奠定了基础。     

寨卡病毒NS1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

目的 高效表达和纯化重组的寨卡病毒NS1蛋白,制备抗NS1蛋白的单克隆抗体。方法 构建含有寨卡病毒NS1基因的原核表达质粒,利用大肠杆菌大量表达重组NS1蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠并进行细胞融合,筛选制备高纯度的单克隆抗体。结果 在大肠杆菌中高效表达了重组NS1蛋白,重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,筛选出3株分泌针对寨卡病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B8、7D11和3E2,纯化的单克隆抗体与重组NS1蛋白有良好的特异性反应。结论 利用重组NS1蛋白免疫制备了抗NS1的单克隆抗体,为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供了基础。     

p7TP2融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及其多克隆抗体的制备和应用

目的应用基因芯片技术筛选获得p7蛋白反式调节的新基因,即丙型肝炎病毒(HCV)p7蛋白反式激活基因p7TP2,研究其生物学功能。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-p7TP2,转入大肠埃希菌Rosetta-gami B中,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在相对分子量约35kD处有一条特异的蛋白质条带,以包涵体形式表达,并通过蛋白质变性、重折叠及纯化后得到了高纯度融合蛋白,将重组蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备抗-p7TP2多克隆抗体。结果经酶联免疫吸附法(ELISA)测定、蛋白印迹(Western blot)和免疫组织化学鉴定,制备的多克隆抗体具有较高效价和特异性。结论 p7TP2蛋白的表达及多克隆抗体的制备为进一步研究HCV p7TP2蛋白的功能及丙型肝炎的发病机理创造了条件。     

人载脂蛋白A5多克隆抗体的制备和组织分布

目的制备人载脂蛋白A5(ApoA5)重组蛋白及其多克隆抗体,利用该抗体检测ApoA5在体内的组织分布情况,为进一步研究该分子的功能和血清水平等提供条件。方法2004年3月至6月,中南大学湘雅二医院心内科通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,构建了含ApoA5编码基因的表达载体,表达了His-ApoA5融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备了抗ApoA5多抗;经酶联免疫吸附分析技术(ELISA)、Western-blot等方法进行鉴定,并初步用于临床组织标本的检测,观察ApoA5在体内的表达。结果所表达的His-ApoA5融合蛋白相对分子质量约为40ku),以其为抗原制备的ApoA5特异性抗血清具有良好的免疫反应性、较高的效价和特异性。Western印迹表明,ApoA5存在于人血清和肝组织中(无论正常血脂和高血脂者),其他组织中(心、血管、小肠、脾、肺)未见到阳性结果。结论ApoA5存在人血清中,ApoA5在肝内表达对于血脂在肝内代谢可能具有重要的意义。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式激活蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 对HCV非结构蛋白2反式激活蛋白(NS2TP)进行原核表达,制备多克隆抗体,并探讨其在不同肝组织中的表达情况.方法 PCR法获得HCV NS2TP基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)上,并转化入E.coli BL21.在大肠埃希菌中诱导表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,经免疫印迹分析验证后,大量表达并纯化该重组蛋白.将重组蛋白免疫家兔后获取多克降抗体,应用免疫组织化学技术检测健康人及慢性HCV患者的肝组织.结果 成功获得丁重组目的 蛋白(相对分子质量为33×103)及高滴度、高特异度的多克隆抗体.慢性HCV患者肝组织内NS2TP的表达高于健康肝组织,且以细胞核内分布为主.结论 明确了慢性HCV患者肝组织内NS2TP表达量及细胞内定位的变化,为进一步研究NS2TP的生物学功能和HCV的致病机制奠定了基础.     

抗旋毛虫鸡卵黄抗体的活性检测

目的制备特异性抗旋毛虫的鸡卵黄免疫球蛋白,研究其免疫应答规律及其稳定性。方法用纯化的旋毛虫幼虫免疫育龄种鸡,经水稀释法初步纯化浓缩后获得卵黄抗体。应用酶联免疫吸附试验检测卵黄抗体的效价及其敏感性和稳定性。结果通过免疫可成功诱导出高效价的抗旋毛虫抗体,效价可达1∶106以上,免疫应答持续时间可达34周以上。免疫后卵黄抗体敏感性和血清抗体敏感性无显著性差异(P>0.05)。稳定性试验表明IgY敏感性高,在pH4～10及温度不超过60℃条件下活性稳定。结论成功制备出高效价的特异性抗旋毛虫卵黄抗体,其敏感性高,有一定的耐热、耐酸碱性,可进一步用于旋毛虫感染的研究。     

猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法 通过逆转录PCR(RT-PCR)技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达产物,用HisLink亲和层析柱进行纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的分布。结果 成功构建猪带绦虫重组表达质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 kD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了Ts14-3-3.3多克隆抗体,其效价为1∶512 000。Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论 成功制备猪带绦虫重组Ts14-3-3.3蛋白,并获得了高纯度、高效价的兔多克隆抗体。     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白NP的原核表达及抗体制备

目的制备H5N1亚型禽流感病毒NP重组蛋白和抗体,为研制含NP组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法提供检测抗原和抗体。方法以H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)NP基因cDNA克隆质粒pMD-NP为模板,PCR扩增获得NP基因抗原区片段,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-ΔNP,转化大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL,IPTG诱导重组蛋白表达。采用Ni亲和层析方法纯化NP重组蛋白,免疫家兔,收集免疫血清,ELISA测定抗体效价;间接免疫荧光检测所制备抗体与真核细胞表达NP蛋白的反应性。结果与结论成功的制备了高效价兔抗NP抗体,抗体效价在105以上,该抗体能与原核和真核系统中表达的NP蛋白特异性反应,为研制以NP蛋白为抗原组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法奠定了基础。     

血清应答因子在血管新生内膜形成过程中的表达变化

目的探讨SRF与VSMC表型转化及增殖之间的关系。方法建立大鼠颈总一胸腹主动脉内皮剥脱后内膜增生模型，应用Northern印迹、Western印迹及免疫组化等方法从RNA和蛋白质水平上检测新生内膜形成过程中SRF表达的动态变化。结果血管内皮剥脱后3d，可见局部内膜增生，中膜平滑肌细胞排列不齐；术后7～14d，内膜呈进行性弥漫增厚，管腔出现狭窄。在增生的内膜中，SRF的mRNA和蛋白水平明显升高，于术后7d达高峰，其动态变化模式与血管内膜增厚速率相一致，但与收缩型VSMC的标志物SM22α的表达却呈反相关变化。结论血管内皮剥脱后SRF表达活性升高与VSMC去分化和新生内膜形成具有直接关系。