A型口蹄疫病毒1D蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及电子显微镜检测

目的 本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。 方法 根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli）中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS。构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。 结果 成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒。 结论 本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法。     

SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1及其C端的表达、纯化和反应原性分析

目的:表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1及其C端,进行反应原性分析并制备多克隆抗体。方法:以SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1编码区的重组克隆载体为模板,设计特异性引物,扩增VP1基因及其C端编码区,然后将该其分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导,以金属离子螯合层析法对表达的VP1、VP1C端融合蛋白进行纯化,经Westernblot对其反应原性进行分析。用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价。结果:实现了SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1及其C端的高效表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在相对分子质量35000和19000处有单一目的条带,具有较高的纯度。Westernblot结果显示,纯化的VP1及其C端均可与牛SAT2型FMDV阳性血清反应,而与阴性对照血清无交叉反应。结论:用纯化的VP1及VP1C融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

肠出血型大肠埃希菌O157：H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化

目的制备肠出血型大肠埃希菌（EHEC）O157：H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157：H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白（KLH）,免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86（0.506）为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157：H7EspF蛋白的抗血清效价达1：2048000;该血清对EHECO157：H7野生株和espF突变株（△espF）的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157：H7EspF蛋白多克隆抗体。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1的可溶性表达、纯化及活性鉴定

目的克隆、表达和鉴定肠道病毒71型（EV71）VP1基因,得到可溶性的蛋白VP1,为制备EV71的抗体和诊断试剂的开发打下基础。方法优化EV71VP1蛋白基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/VP1,转化大肠杆菌BL21。使用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Westernblotting检测目的蛋白。以重组蛋白VP1为抗原,ELISA检测抗原活性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为36000,与预计大小一致。ELISA实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了EV71VP1蛋白,并得到可溶性的蛋白,对肠道病毒71型诊断试剂的开发有进一步潜在的应用价值。     

上海闵行地区腹泻患者非O157型产志贺毒素大肠埃希菌感染特点及毒力基因评估

目的研究上海闵行地区腹泻患者非0157型产志贺毒素大肠埃希菌（非0157STEC）感染情况及其毒力基因分布特点。方法收集该地区三个监测哨点及复旦大学附属儿科医院腹泻门诊患者肛拭样本及临床资料,通过培养、分离、生化鉴定及血清凝集等金标准确认非0157STEC菌株。同时运用聚合酶链反应（PCR）方法检测毒力基因stxl、stx2、eae、hly、etpD、及katP。结果380例（儿童195例,成人185例）大肠埃希菌阳性的腹泻患者肛拭样本中,40例（儿童30例,成人10例）确认为非0157STEC阳性,儿童阳性率（15．4％）显著高于成人（5．4％）。全部40例非0157STEC分离株均显示stx2毒力基因阳性,而stxl及eae基因阳性率很低,未检测到hly、etpD、及katP毒力基因。结论上海闵行地区非0157STEC是引起人群尤其是儿童腹泻的主要病原体之一,其菌株均显示stx2毒力基因阳性。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7Tir的表达、纯化及不同免疫途径对其免疫效价的影响

目的 克隆、表达和纯化肠出血型大肠埃希菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7转位紧密黏附素受体蛋白(Tir),观察不同免疫途径对其免疫效价的影响,为EHEC O157:H7亚单位疫苗的研究提供了实验资料.方法 扩增tir基因,克隆到pET-30a(+)载体上,转化至大肠埃希菌BL21/DE3,诱导表达目的 蛋白,通过Ni-IDA亲和层析进行纯化;将重组蛋白Tir免疫小鼠,检测血清和粪便提取物中抗体效价.结果 双酶切和测序鉴定结果均显示重组质粒pET-30a (+)-tir构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的 蛋白Tir在大肠埃希菌BL21(DB3)中得到表达.皮下免疫和鼻腔免疫小鼠,血清中均能检测到高效价的IgG类抗体,鼻腔免疫组小鼠血清和粪便lgA类抗体效价明显高于皮下免疫组.结论 Tir蛋白具有一定的免疫原性.

Abstract：

Objective To clone and express translocation intimin receptor(Tir)of enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC)O157:H7,and to analyze the effect of different routes on the induction of immunity to the recombinant protein.Methods The tir eucoding genes were amplified from EHEC O157:H7 strain guangzhou 246 genome,and genes were cloned into the vector pET-30a(+).The pET-30a(+)tir recombinant was transformed into E.coli BL21.and expression was induced bv IPTG.The expressed product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography.The immunized mice sera and fecal against the recombinant protein was detected.Resuits The length of the tir is 1677 bp,with the initiation codon ATG and the termination codon TAA.Double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid pET-30a(+)-tir was constructed.The recombinant protein was expressed in Escherichia coli expression system,and was purified by Ni-IDA affinity chromatography.The mice were able to produce a high serum IgG antibody titer after both subeutaneous and intranasal immunizations.Meanwhile,the intranasal immunization induced serum and fecal IgA antibody titer was significantly higher than that of the subcutaneous immunization group.Conclusion Tir molecule is potential vaccine candidate for preventing EHEC disease.     

口蹄疫病毒 VP1 蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 ,为研制新型FMDVVP1的基因工程疫苗奠定了基础     

人微小病毒B19 VP1独特区蛋白的表达及纯化

目的：利用原核表达系统表达人微小病毒B19的VP1独特区蛋白, 大量发酵培养细菌后纯化蛋白, 为制备VP1蛋白的mAb奠定基础.方法：构建重组质粒VP1-PQE30, 转化大肠杆菌M15, 测序正确后发酵培养、 IPTG诱导表达, 通过SDS-PAGE及Western blot分析表达产物, 表达蛋白经AKTA explorer 100快速纯化系统纯化.结果：成功地构建原核表达系统VP1-PQE30-M15, 经IPTG诱导发酵培养细菌可大量表达VP1蛋白, 纯化后蛋白纯度达95%以上.结论：重组表达质粒可表达VP1独特区蛋白, 高纯度蛋白对制备VP1 mAb及疫苗具有重要意义.     

Role of arginine-56 within the structural protein VP3 of foot-and-mouth disease virus (FMDV) O1 Campos in virus virulence

FMDV O1 subtype undergoes antigenic variation under diverse growth conditions. Of particular interest is the amino acid variation observed at position 56 within the structural protein VP3. Selective pressures influence whether histidine (H) or arginine (R) is present at this position, ultimately influencing in vitro plaque morphology and in vivo pathogenesis in cattle. Using reverse genetics techniques, we have constructed FMDV type O1 Campos variants differing only at VP3 position 56, possessing either an H or R (O1Ca-VP3-56H and O1Ca-VP3-56R, respectively), and characterized their in vitro phenotype and virulence in the natural host. Both viruses showed similar growth kinetics in vitro. Conversely, they had distinct temperature-sensitivity (ts) and displayed significantly different pathogenic profiles in cattle and swine. O1Ca-VP3-56H was thermo stable and induced typical clinical signs of FMD, whereas O1Ca-VP3-56R presented a ts phenotype and was nonpathogenic unless VP3 position 56 reverted in vivo to either H or cysteine (C).     

Location of neutralizing epitopes defined by monoclonal antibodies generated against the outer capsid polypeptide, VP1, of foot-and-mouth disease virus A12

The epitopes of six monoclonal antibodies generated against type A12 foot-and-mouth disease virus (FMDV) VP1 or its largest cyanogen bromide fragment (13 kd) were characterized. Five of these monoclonal antibodies neutralized viral infectivity. Solid-phase and competitive antigen binding assays using virion-derived antigens or a biosynthetic VP1 polypeptide identified two distinct neutralizing epitopes. One epitope was located between amino acid residues 145-168 of VP1 and the other between amino acids 169-179. The results indicate that antibodies reacting with two distinct areas of the VP1 polypeptide are capable of neutralizing FMD virus.     

Antigenic features of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1 as revealed by monoclonal antibodies and neutralization-escape mutants

Neutralizable antigenic sites/epitopes of serotype Asia1 foot-and-mouth disease virus (strain IND63/72) were identified using monoclonal antibodies (mabs) and their neutralization-escape mutants. Relative affinity/reactivity of the mabs for viral (both native and trypsin-cleaved) and subviral antigens in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed dominance of trypsin-sensitive and conformation-dependent neutralizable antigenic sites. Characterization of neutralization escape mutants identified at least four independent trypsin-sensitive neutralizable antigenic sites on Asia1 FMD virus. One site was identified by mabs B3, 1A, 24, 2A, 40 and 63, second site by mabs 34 and 81, third site by mab 72 and fourth site by mab 89. The reaction profile of the mabs with selected field isolates in ELISA identified four different neutralization epitopes within the site B3/1A/24/2A/40/63.     

AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法：用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB／c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果：成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株，分别命名为：188、5E1、5E2，其分泌的mAb为IgG1（188）和IgG2a（5E1、5E2）亚类，他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒，其腹水效价在1：10^5～1：10^6。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV，中和效价达1：1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性，型间无交叉反应，证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论：在口蹄疫病毒mAb的研究中，VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1 mAb的成功制备，为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

2008-2009年广东手足口病非CA16非EV71肠道病毒株的鉴定及其VP1基因分型研究

目的 探讨2008-2009年广东省手足口病非CAI6非EV71肠道病毒株的流行情况以及毒株型别.方法 从2008-2009年广东省手足口病粪便样本中采用RD细胞和HEp-2细胞分离病毒毒株,待出现细胞病变后收集上清采用RT-PCR进行鉴定.非CA16非EV71毒株再进行VP1测序分析,序列通过BLAST程序鉴定型别,用MEGA4.0软件进行基因进化分析.结果 共分离到22株非CA16非EV71毒株,通过BLAST程序鉴定犁别.2008年9株非CA16、非EV71的毒株有CA2型、CA4、CB3型;2009年13株有EV80、E13、E30、CB5、E24、PV1、CA10、CA6和CA2.各毒株间同源性低,各毒株分别归属CoxA、CoxB、埃可肠道病毒、新型肠道病毒和脊灰病毒组.结论 广东省2008-2009年两年来,手足口病除了CA16和EV71占主导地位外,并不存在其他的优势株,其他型肠道病毒分布比较广,既有CoxA组病毒、CoxB组,也有E13、E24、E30、新型病毒EV80和脊髓灰质炎病毒PV1,儿组病毒伴随流行.     

Display of the VP1 epitope of foot-and-mouth disease virus on bacteriophage T7 and its application in diagnosis

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious epidemic disease threatening the cattle industry since the sixteenth century. In recent years, the development of diagnostic assays for FMD has benefited considerably from the advances of recombinant DNA technology. In this study, the immunodominant region of the capsid protein VP1 of the foot-and-mouth disease virus (FMDV) was fused to the T7 bacteriophage and expressed on the surface of the bacteriophage capsid protein. The recombinant protein of about 42 kDa was detected by the anti-T7 tag monoclonal antibody in Western blot analysis. Phage ELISA showed that both the vaccinated and positive infected bovine sera reacted significantly with the recombinant T7 particle. This study demonstrated the potential of the T7 phage displaying the VP1 epitope as a diagnostic reagent.     

肠道病毒-D68 VP1蛋白原核表达、纯化及抗原性的评价

目的 原核表达EV-D68结构蛋白VP1,并对其抗原性进行评价.方法 以肠道病毒68型P1基因为模板,设计引物扩增出目的片段VP1,将其连接至大肠杆菌表达载体pGEX-5X-1上.将重组表达载体pGEX-5X-1-VP1转化大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)pLysS,对该工程菌进行诱导表达.菌体裂解后用SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定融合蛋白;对表达菌体进行超声破碎和亲和层析纯化;使用酶联免疫吸附试验方法评估目的蛋白与不同种属EV-D68阳性血清的结合能力及亲和力.结果 成功构建融合表达载体pGEX-5X-1-VP1,经过双酶切及测序鉴定均正确;成功表达和纯化出EV-D68(En-terovirus D68,EV-D68)VP1融合蛋白,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,得到与预期蛋白相对分子质量为61000大小一致的目的条带;纯化蛋白与不同种属的阳性血清可以特异性结合,与兔血清、恒河猴血清、小鼠血清的亲和力常数分别为1.6×106、3.9×105、3.1×106.结论 成功表达了EV-D68 VP1融合蛋白,为研究EV-D68 VP1蛋白的结构、功能及中和抗体筛选奠定基础.     

新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。