青蒿琥酯对新生血管生长与成型影响的实验研究

目的通过观察新生血管生长发育与成型过程的形态学变化，研究青蒿琥酯对新生血管形成的影响。方法采用鸡胚绒毛尿囊膜模型、大鼠主动脉环无血清培养及人脐静脉内皮细胞体外培养，检测青蒿琥酯在新生血管形态发育过程中的作用。结果青蒿琥酯可影响血管内皮生长与实心条索形成，使血管生长期明显滞后，抑制血管生长。结论青蒿琥酯能通过干扰血管生长发育与成型而抑制血管生成。     

基于VEGFR2/Src/FAK通路探讨葫芦素D抗血管新生机制

目的探讨葫芦素D对VEGF诱导的血管新生的作用及其机制。方法鸡胚绒毛尿囊膜血管新生实验、大鼠胸主动脉血管内皮迁出与人血管内皮细胞划痕实验检测葫芦素D对VEGF诱导的血管新生和内皮细胞迁移的作用,Western blot技术检测葫芦素D对VEGF诱导的VEGFR2及其下游的Src、FAK磷酸化水平的影响。结果葫芦素D对VEGF诱导的鸡绒毛尿囊膜血管新生具有明显的抑制作用,并能抑制VEGF诱导的大鼠胸主动脉环模型和划痕实验中血管内皮迁移。葫芦素D能够抑制VEGF刺激的VEGFR2、Src、FAK磷酸化。结论葫芦素D具有抑制VEGF诱导的血管新生作用,其机制可能与抑制VEGFR2及其下游的细胞信号通路蛋白活化有关。     

骨肉瘤血管生成与肿瘤治疗的实验研究

目的：研究人骨肉瘤OS－732细胞系促进血管生成作用及血管内皮生长因子（VEGF）抗体对其血管生成的抑制作用。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜模型。通过解剖显微镜、光镜及免疫组化方法观察人骨肉瘤OS－732细胞系血管生成活性，并探讨VEGF抗体的血管生成抑制作用。结果：OS－732细胞系具有较强的促血管生成能力，鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤组织中VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）均呈阳性表达，且VEGF呈持续高表达。给予VEGF抗体后VEGF抗体组血管数目、瘤细胞数低于PBS对照组。结论：VEGF、bFGF、TGF-β1可能共同参与骨肉瘤OS－732细胞系诱导的血管生成，其中VEGF可能起着主要作用。VEGF抗体能抑制本细胞系的血管生成，提示VEGF抗体对骨肉瘤治疗具有良好的应用前景。     

Fas及FasL和Caspase-3在青蒿琥酯诱导人胚肺成纤维细胞凋亡中的表达

背景:青蒿琥酯具有减轻肺纤维化的作用,但相关机制的研究罕见报道。 目的：探讨青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞凋亡的作用及其与Fas,FasL,Caspase-3表达的关系。 方法：用1,10,100 mg/L青蒿琥酯分别干预体外培养的人胚肺成纤维细胞。采用CCK-8法检测青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞增殖的影响,流式细胞术测定细胞凋亡率,RT-PCR法测定Fas,FasL,Caspase-3 的mRNA的表达。 结果与结论：青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制人胚肺成纤维细胞增殖,细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P  < 0.05或P  < 0.01),Fas,FasL,Caspase-3 mRNA的表达显著高于对照组(P < 0.05)。结果证实,青蒿琥酯可通过上调Fas,FasL,Caspase-3 mRNA的表达抑制人胚肺成纤维细胞增殖、并促进细胞凋亡,发挥抗肺纤维化作用。     

新型酪氨酸激酶抑制剂XCF-43b体外抗血管新生研究

目的 探究XCF-43b 体外抗血管新生机理.方法 鸡胚尿囊膜(CAM)检测化合物抑制血管新生能力,MTT检测其对HUVEC细胞增殖影响,划痕实验和微管形成实验检测化合物对HUVEC迁移和微管形成的影响,Western印迹检测VEGFR2信号通路相关蛋白表达情况.结果 XCF-43b能够抑制CAM血管新生,抑制HUVEC细胞增殖的IC50为(28.42±7.23) μmol/L,对在VEGF刺激下的HUVEC的IC50值为(9.03±1.28) μmol/L,此外,2.5 μmol/L的XCF-43b能够抑制HUVEC细胞的迁移和微管形成;且能够抑制VEGFR2及其下游信号因子的激活.结论 XCF-43b通过抑制VEGFR2信号通路来抑制血管新生.     

诱导细胞凋亡青蒿琥酯抗食管癌作用机制研究

 [摘要] 目的 研究青蒿琥酯诱导食管癌细胞凋亡作用及探讨青蒿琥酯抗食管癌作用机制。方法 不同浓度的青蒿琥酯(Artesunate, Art)(0、10、20、40μg/ml) 作用Eca109细胞24h,流式细胞术（Flow cytometry, FCM）方法检测细胞凋亡、周期及细胞中bcl-2和bax蛋白的表达量。结果 青蒿琥酯作用Eca109细胞24h后,与对照组相比,细胞凋亡率显著增高P<0.05,且具有剂量依赖性。青蒿琥酯组与对照组相比,Eca109细胞中bcl-2蛋白表达水平及细胞增殖指数显著降低P<0.05,而bax蛋白表达量显著增高P<0.05,且具有剂量依赖性。结论 青蒿琥酯可以通过调节Eca109细胞中bcl-2、bax蛋白表达水平和细胞增殖,从而诱导Eca109细胞产生凋亡,起到抗食管癌作用。     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。     

血管生成素1基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的 构建携带人血管生成素1(Ang-1)基因的腺病毒表达载体,并观察其感染QBI-293A靶细胞后目的基因的表达及其促血管新生的效应。方法 以骨髓细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增Ang-1基因片段,于BglⅡ、Sal Ⅰ酶切位点亚克隆至pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒。然后pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒同源重组后,再经QBI-293A细胞包装、扩增和纯化获得高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒。RT-PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性Ang-1基因在QBI-293A细胞中的转录和表达。将鸡胚随机分成3组：Ad-Ang-1重组腺病毒组、Ad空载体腺病毒组、生理盐水(NS)组,观察鸡胚绒毛膜尿囊膜(CAM)新生血管形成。结果获得了高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒,其病毒效价可达3×1010 pfu/ml。Ad-Ang-1感染后,QBI-293A细胞中的Ang-1含量(47522.53±3685.57) ng/L较QBI-293A细胞对照组(2490.86±550.95) ng/L和Ad空病毒感染组(2323.20±260.55) ng/L均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。Ad-Ang-1重组腺病毒组有效地促进了二、三级分支血管的生成。结论 成功获得了携带人Ang-1基因的腺病毒表达载体,为进一步开展Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

青蒿琥酯对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及联合化疗药物的抗肝癌效应

目的: 研究青蒿琥酯对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用,并检测其是否影响HepG2细胞对化疗药物的敏感性。方法: 采用CCK-8法观察不同浓度青蒿琥酯对HepG2细胞生长增殖的影响;克隆形成实验检测青蒿琥酯对HepG2细胞克隆形成的影响;Hoechst 33258染色观察青蒿琥酯作用HepG2细胞后细胞形态的变化;PI单染流式细胞术检测青蒿琥酯对HepG2细胞周期以及亚二倍体率的影响;Annexin V-PI双染测定青蒿琥酯对HepG2细胞凋亡的影响;CCK-8法检测青蒿琥酯对HepG2细胞化疗药物敏感性的影响。结果: (1)青蒿琥酯作用于HepG2细胞48 h后,能有效抑制其增殖,随着浓度的升高,增殖抑制率越高,IC₅₀值为19.2 μmol/L。(2)青蒿琥酯作用HepG2细胞7 d后,能有效抑制HepG2细胞形成的克隆数。(3)青蒿琥酯作用于HepG2细胞48 h后,Hoechst 33258染色可见实验组细胞胞核固缩、边聚和裂解、凋亡小体形成等凋亡形态学变化。(4)青蒿琥酯作用于HepG2细胞48 h后,PI单染流式细胞术检测细胞周期发现实验组细胞明显阻滞于G₂期。(5)青蒿琥酯作用于HepG2细胞48 h后,PI单染实验检测实验组出现明显的亚二倍体凋亡峰;Annexin V-PI 双染实验检测实验组细胞出现明显的早期凋亡细胞群。(6)青蒿琥酯分别联合化疗药物5-氟尿嘧啶、卡铂和表柔比星作用于HepG2细胞48 h后,能明显增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用,增敏倍数分别为3.33、2.02和1.71。结论: (1)青蒿琥酯对人肝癌HepG2细胞有增殖抑制作用,并诱导其凋亡。(2)青蒿琥酯能提高人肝癌HepG2细胞对5-氟尿嘧啶、卡铂和表柔比星的敏感性。     

鸡胚尿囊绒毛膜法研究细胞间黏附分子-1在血管生成中的作用

目的　探讨细胞间黏附分子 1(intercellularadhesionmolecule 1,ICAM 1)在血管生成中的作用。　方法采用鸡胚尿囊绒毛膜 (chorioallantoicmembrane ,CAM)法进行在体血管生成实验。　结果　 1 10d鸡胚的尿囊绒毛膜经ICAM 1作用 3d后 ,明胶海绵周围放射状走行的微血管非常明显 ,似车辐 ,显微镜下明胶海绵内有垂直长入的微血管 ,明胶海绵周边CAM间充质内微血管数目显著多于对照组 (P <0 0 1)。 2 6d鸡胚的尿囊绒毛膜经Anti ICAM 1作用 3d后 ,明胶海绵周围放射状走行的微血管极不明显 ,显微镜下明胶海绵内几乎没有新生的微血管 ,明胶海绵周边CAM间充质内微血管数目显著少于对照组 (P <0 0 1)。　结论　结果提示 1 ICAM 1有诱导微血管生成的作用 ;2 ICAM 1参与胚胎的血管生成。     

重组表达人载脂蛋白(a)羧基末端kringle结构域抑制新生血管

 目的 利用毕赤酵母重组表达人载脂蛋白（a）[Apo(a)]羧基末端kringle结构域,明确其抑制新生血管和肿瘤细胞增殖的能力。方法 分别构建重组表达Apo(a)羧基末端kringle V结构域（RHAKA）与kringle IV 10型 - kringle V结构域（RHAKB）的pPICZ?A质粒;转染毕赤酵母X-33分泌表达RHAKA与RHAKB,RHAKs利用His?Tag亲和层析纯化,以及反相高效液相色谱与氨基酸残基测序鉴定;明确RHAKs的糖基化及二硫键形成情况后,利用细胞增殖实验与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验检测RHAKs对新生血管和肿瘤细胞增殖的影响。结果 毕赤酵母可以大量表达RHAKs,并对RHAKs进行翻译后修饰;RHAKA与RHAKB可以抑制血管内皮细胞的增殖和CAM的新生血管,但对肿瘤细胞增殖无直接的抑制作用。结论 利用毕赤酵母高效重组表达人Apo(a)羧基末端kringle结构域可以显著抑制新生血管。     

bFGF单抗的抗血管新生作用

目的在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及鸡胚中来研究抗碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单抗对血管新生的作用。方法制备3种腹水型bFGF单抗MabF7,MabF10,MabF12。CCK-8法检测bFGF单抗对HUVECs细胞增殖的影响;Transwell小室研究bFGF单抗对HUVECs迁移的影响;ECM gel检测其对HUVEC体外成管的影响;并研究其体内对鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生作用。结果 MabF7,MabF10,MabF12均可中和bFGF的活性;3株单抗均可抑制内皮细胞迁移过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组细胞迁移率分别为100%,106.25%±7.89%,69.50%±6.86%,74.00%±4.16%,67.75%±3.30%;3株单抗均可抑制内皮细胞成管过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组管状结构形成率分别为:100%,105.93%±3.85%,56.53%±4.35%,29.23%±6.45%,12.77%±2.67%;计数尿囊膜上加药滤纸周围呈放射状的血管条数,bFGF组,bFGF+MabF7组,bFGF+MabF10组,bFGF+MabF12呈放射状的血管条数分别为15±0.82,7.5±1.29,13.5±3.10,8.5±0.58。结论 bFGF单抗对HUVECs的增殖、迁移、成管以及鸡胚尿囊膜血管新生均有抑制作用,从而为具有抗肿瘤作用的抗体药物的研发奠定基础。     

青蒿琥酯抑制人食管癌Eca-109细胞系的CDC25A表达

目的观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对人食管癌Eca-109细胞系的抑瘤作用,并进一步探讨Art诱导肿瘤细胞周期阻滞与CDC25A、TGF-β表达的关系。方法体外培养人食管癌Eca-109细胞系及正常人外周血单个核细胞(hPBMC),利用MTT法测定细胞增殖;采用流式细胞术(FCM)测定细胞周期;应用RT-PCR方法检测CDC25AmRNA表达,应用Western blot方法检测蛋白表达。结果Art能显著抑制Eca-109细胞的增殖,IC50为(68.80±0.76)μmol/L,而对hPBMC的增殖则没有明显抑制作用。低浓度Art可将细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞显著减少,当浓度达到100μmol/L时,细胞阻滞于G2/M期。Art可显著抑制Eca-109细胞CDC25AmRNA及蛋白表达,同时显著上调TGF-β的蛋白表达水平。结论Art可抑制肿瘤细胞生长,上调TGF-β表达,抑制CDC25A表达。     

大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

目的优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性。方法用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化最适复性条件。复性结束后用阳离子交换层析纯化。并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋白的活性。结果通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%。复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性。结论提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究。     

青蒿琥酯通过调控PI3K/Akt信号通路抑制肝癌细胞增殖促进凋亡

目的 探讨青蒿琥酯对人肝癌细胞系HepG2的增殖和凋亡的影响及可能机制.方法 体外培养人肝癌细胞系HepG2,分别用浓度为12.5、25、50、100mg/L青蒿琥酯作用不同时间后,采用CCK-8实验检测细胞增殖情况;随后选择最佳浓度的青蒿琥酯作用HepG2细胞24h后,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的水平.结果 不同浓度的青蒿琥酯处理细胞24h后,青蒿琥酯均能显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖,且该作用呈现剂量依赖性.流式细胞仪检测发现青蒿琥酯能显著促进肝癌细胞HepG2的凋亡,同时Western blot也进一步证实,青蒿琥酯处理后HepG2细胞中的抑凋亡蛋白Bcl-2显著下调,促凋亡蛋白Bax表达显著上调;同时发现青蒿琥酯能够降低p-PI3K和p-Akt的水平,但未磷酸化的PI3K和未磷酸化的Akt含量变化无显著性差异.结论 青蒿琥酯可以抑制肝癌细胞HepG2的增殖,促进细胞凋亡,该作用与调控PI3K和Akt的磷酸化水平密切相关.     

青蒿琥酯抑制人食管癌Eca-109细胞系的CDC25A表达

目的观察青蒿琥酯（artesunate，Art）对人食管癌Eca-109细胞系的抑瘤作用，并进一步探讨ATt诱导肿瘤细胞周期阻滞与CDC25A、TGF-β表达的关系。方法体外培养人食管癌Eca-109细胞系及正常人外周血单个核细胞（hPBMC），利用MTT法测定细胞增殖；采用流式细胞术（FCM）测定细胞周期；应用RT．PCR方法检测CDC25AmRNA表达，应用Western blot方法检测蛋白表达。结果Art能显著抑制Eca-109细胞的增殖，ICS0为（68．80±0．76）μmol／L，而对hPBMC的增殖则没有明显抑制作用。低浓度Art可将细胞阻滞于G0／G1期，S期细胞显著减少，当浓度达到100μmol／L时，细胞阻滞于G2／M期。Art可显著抑制Eca-109细胞CDC25AmRNA及蛋白表达，同时显著上调TGF-β的蛋白表达水平。结论Art可抑制肿瘤细胞生长，上调TGF-β表达，抑制CDC25A表达。     

重组人血管内皮抑素对人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226增殖和相关蛋白表达的影响

 目的： 研究重组人血管内皮抑素（恩度）在体外对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞增殖、细胞周期及细胞相关蛋白表达的影响。方法： 用CCK-8检测恩度对RPMI 8226细胞增殖的影响;流式细胞术检测凋亡和细胞周期的改变;Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达变化;以实时定量PCR和Western blotting检测RPMI 8226细胞血管细胞粘附因子 1（VCAM-1）、白细胞介素 6（IL-6）和血管内皮生长因子（VEGF）mRNA以及蛋白表达变化;ELISA检测细胞上清液中细胞因子IL-6和VEGF水平。结果： 恩度对RPMI 8226细胞有增殖抑制作用,250 mg/L恩度对RPMI 8226细胞 72 h增殖抑制率为（59.5±5.6）%（P<0.05）,细胞G1期比例增加（P<0.05）,但对细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达无显著影响;经恩度作用后RPMI 8226细胞 VCAM-1表达下降（P<0.05）,IL-6和VEGF表达及分泌降低（均P<0.05）。结论： 恩度能通过改变细胞周期变化抑制RPMI 8226细胞增殖,并能减少VCAM-1表达及IL-6、VEGF分泌,对细胞凋亡无明显改变。     

黄芪、脉络宁注射液载入修饰胶原对鸡胚尿囊膜血管新生的协同促进作用

背景:课题组先期研究发现黄芪载入修饰后胶原可以促进血管新生,与生长因子载入疗效相当,运用中医理论中具有协同作用的中药合用是否能进一步提高疗效尚不清楚。目的:探查黄芪、脉络宁载入修饰后胶原促鸡胚尿囊膜血管新生及长入胶原的疗效,并证明黄芪与脉络宁是否有协同作用。方法:实验分空白组、控制组(单纯胶原)、黄芪组(黄芪注射液1mL载入胶原)、脉络宁组(脉络宁注射液1mL载入胶原)、黄芪+脉络宁组(黄芪注射液及脉络宁注射液各0.5mL载入胶原),各组植入鸡胚尿囊膜孵化7d后取出,测定鸡胚尿囊膜内微血管数、各组胶原内微血管数、血红蛋白含量、rhVEGF165阳性细胞数。结果与结论:各实验组鸡胚尿囊膜内血管呈轮辐状生长及鸡胚尿囊膜包裹标本率高于空白组与控制组,鸡胚尿囊膜内微血管数、胶原内微血管数、血红蛋白含量、rhVEGF165阳性细胞数均高于控制组,差异有显著性意义(P0.01);其中黄芪+脉络宁组又高于黄芪组与脉络宁组,差异有显著性意义(P0.05)。提示黄芪、脉络宁载入胶原后可以促进鸡胚尿囊膜内血管新生并刺激血管长入胶原内,黄芪与脉络宁合用具有协同作用,机制之一为刺激血管内皮细胞血管内皮生长因子的表达。     

表没食子儿茶素没食子酸酯与西妥昔单抗联用体内外抗食管癌细胞Eca-109的作用研究

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与西妥昔单抗联用体内外抗食管癌Eca-109的作用。方法采用MTT法检测化合物对肿瘤细胞增殖的影响;采用克隆形成法检测EGCG对肿瘤细胞克隆形成的影响;采用流式细胞术检测化合物对肿瘤细胞凋亡的影响;采用动物实验评价药物或EGCG对移植于裸鼠的移植瘤的生长抑制作用;同时采用免疫组化的方法检测药物或EGCG对血管形成的影响。结果 EGCG能够剂量依赖性地抑制Eca-109细胞增殖,其IC50值为43.22μmol/L。经克隆形成法检测结果表明,EGCG能够明显抑制Eca-109细胞的克隆形成,IC50值为28.49μmol/L。EGCG能够显著引起Eca-109细胞凋亡,60和80μmol/L EGCG诱导的凋亡百分率分别为(21.70±0.62)%、(57.13±9.09)%。EGCG和西妥昔单抗联用对Eca-109细胞的增殖抑制作用较单独用药组强,具有相加作用。体内实验结果表明,EGCG和西妥昔单抗均能抑制Eca-109裸鼠移植瘤的生长,两者联用存在增强作用。EGCG和西妥昔单抗均能抑制裸鼠移植瘤的血管形成,两者联用血管形成抑制作用较单用组更强。结论 EGCG能够抑制食管癌Eca-109的细胞增殖和克隆形成,具有诱导Eca-109细胞凋亡作用,与西妥昔单抗联用在体内外均具有增强作用。