NEDD9在神经胶质瘤中的表达及基因沉默对人胶质瘤U251细胞增殖与侵袭的影响

目的研究NEDD9在神经胶质瘤中的表达及NEDD9基因沉默对人胶质瘤U251细胞增殖与侵袭的影响。方法选取手术切除的脑胶质瘤组织36例及正常脑组织10例,采用qRT-PCR和Western blot法检测各组脑组织中NEDD9mRNA和蛋白表达情况,构建靶向NEDD9的shRNA重组慢病毒载体,将慢病毒载体转染U251细胞,应用qRT-PCR与Western blot方法检测NEDD9mRNA与蛋白表达,MTT方法检测转染后U251细胞活力的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果脑胶质瘤组织NEDD9的蛋白与mRNA表达水平显著高于正常脑组织。成功建立了稳定沉默NEDD9基因的U251细胞株,与空白对照组及阴性对照组比较,转染NEDD9-shRNA组U251细胞活力与侵袭能力显著降低(P0.01)。结论 NEDD9可能是治疗胶质瘤U251细胞的潜在靶点。     

慢病毒介导的TLR4基因沉默对U251细胞增殖与迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的TLR4基因沉默对U251细胞增殖与迁移的影响。方法构建TLR4基因沉默sh RNA慢病毒载体并鉴定,将慢病毒表达载体稳定转染人胶质瘤细胞U251后,real time PCR方法与Western blot方法检测U251细胞TLR4 m RNA与蛋白的表达,MTT方法检测U251细胞增殖情况,transwell实验检测细胞迁移能力的改变。结果 real time PCR方法与Western blot方法检测结果显示,转染TLR4基因沉默sh RNA慢病毒载体后,人胶质瘤细胞U251 TLR4在m RNA和蛋白水平表达均明显降低,结果表明成功建立了稳定沉默TLR4基因的U251细胞株。与空白对照组比较,在抑制TLR4表达后,U251细胞增殖和迁移能力也明显下降。结论成功建立了稳定沉默TLR4基因的U251细胞株,沉默TLR4基因后U251细胞增殖和迁移能力明显下降。     

慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响

目的探讨慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法构建靶向E2F-1的shRNA重组慢病毒载体,将慢病毒载体转染U251细胞,real-time PCR与Western blot在m RNA与蛋白水平鉴定转染结果,MTT方法检测转染后U251细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的变化,transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 real-time PCR方法与Western blot检测结果均表明成功建立了稳定沉默E2F-1基因的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染E2F-1-shRNA的U251细胞活力显著降低,细胞周期被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高,侵袭能力显著降低(P0.01)。结论转染E2F-1-shRNA能够显著降低U251细胞增殖侵袭能力。     

小RNA干扰骨桥蛋白抑制人U251细胞的体外生长与侵袭

目的:研究慢病毒载体介导的骨桥蛋白(OPN) RNA干扰对人U251神经胶质瘤细胞体外生长和侵袭的影响,并探讨其对神经胶质瘤生长、侵袭的可能机制.方法:应用本实验室已构建并鉴定的OPN特异性短发卡RNA慢病毒表达载体(LV-OPN shRNA)感染U251神经胶质瘤细胞.RT-PCR检测干扰前、后U251细胞OPN mRNA的表达;免疫印迹法检测干扰前、后U251细胞OPN、MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力的变化;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化;细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果:与未感染组、空载体感染组相比,LV-OPN shRNA感染组OPN mRNA、OPN蛋白及MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达均明显下降;LV-OPN shRNA感染组细胞增殖、侵袭能力及迁移能力也明显下降.结论:慢病毒载体介导的骨桥蛋白RNA干扰在体外能抑制U251细胞OPN mRNA和蛋白表达, 进而抑制U251细胞在体外的生长及侵袭,因此可以推测OPN是促进胶质瘤增殖和侵袭的基因之一,为胶质瘤的治疗提供新的靶点.     

慢病毒介导的RWDD3沉默对人胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨沉默RWDD3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法:构建靶向RWDD3的shRNA重组慢病毒并转染U251细胞,通过real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。MTT法检测转染后细胞的细胞活力;平板克隆实验检测克隆形成能力;Brd U实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:real-time PCR和Western blot结果均表明成功建立稳定沉默RWDD3的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染RWDD3-shRNA组的细胞活力和克隆形成能力降低;侵袭及迁移能力均下降,穿膜细胞数明显减少;细胞周期进展被抑制,阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:RWDD3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示RWDD3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因1对人胶质瘤U251细胞增殖侵袭的影响

目的 探讨小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因l (PTTG1)对人胶质瘤U251细胞增殖侵袭的影响及可能机制。方法 设计靶向沉默PTTG1的siRNA,将U251细胞随机分为PTTG1基因沉默组、阴性对照组和空白组,PTTG1基因沉默组U251细胞转染PTTG1-siRNA,阴性对照组细胞转染无关序列,空白组细胞不转染任何序列。转染后继续培养48 h,采用real-time PCR与Western blot方法鉴定转染结果,MTT方法和transwell实验分别检测细胞的增殖能力与侵袭能力,Western blot方法检测U251细胞中p-Akt、基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)的表达。结果 PTTG1基因沉默组U251细胞中PTTG1 mRNA和蛋白表达显著低于阴性对照组和空白组（P<0.01）,结果提示转染成功。与空白对照组及阴性对照组比较,PTTG1基因沉默组U251细胞活力显著降低,侵袭能力显著降低,p-Akt、MMP-2/9的表达显著降低（P<0.01）。结论 沉默PTTG1基因可以抑制U251细胞的增殖和侵袭,PTTG1有望成为胶质瘤靶向治疗的新靶点。     

miR-200b通过靶向CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的研究hsa-miR-200b对人U251胶质瘤细胞增殖的影响及相关作用机制。方法将miR-200b过表达和表达沉默质粒分别稳定转染至胶质瘤U251细胞,qRT-PCR验证转染效率,CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化,qRTPCR以及Western blot方法检测的CRKL的m RNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点。将CRKL过表达和表达沉默质粒载体分别稳定转染至U251胶质瘤细胞,使用CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化。分别建立miR-200b和CRKL的稳定双转染U251细胞系,使用CCK-8法检测对各组细胞增殖水平的变化。结果与对照组相比,miR-200b过表达显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖并且抑制CRKL在U251胶质瘤细胞的m RNA和蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证了miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点;CRKL过表达显著增强胶质瘤U251细胞增殖能力;CRKL过表达有效阻断了miR-200b抑制胶质瘤U251细胞增殖的作用。结论 miR-200b能够通过靶向下调CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖。     

基因沉默ILK对胰腺癌细胞Panc-1细胞增殖、凋亡与侵袭的影响

目的探讨基因沉默整合素连接激酶(ILK)对胰腺癌细胞(Panc-1)细胞增殖、凋亡与侵袭的影响。方法培养胰腺癌Panc-1细胞,构建ILK-specific shRNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染,qPCR与Western Blot方法验证干扰基因片段的有效性,MTT实验检测转染后胰腺癌细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测转染后胰腺癌细胞周期的变化,Transwell实验检测转染后胰腺癌细胞侵袭能力的改变。结果成功构建siRNA-ILK慢病毒载体,转染组细胞的ILK mRNA及蛋白表达明显低于空病毒组及阴性对照组。基因沉默ILK的胰腺癌Panc-1细胞增殖能力显著降低,停滞在G0/G1的细胞数显著增多,G2/M期细胞数明显减少,侵袭能力显著降低(P0.01)。结论基因沉默ILK能抑制胰腺癌细胞Panc-增殖与侵袭能力,并促进凋亡。     

shRNA沉默TXNDC12抑制脑胶质瘤细胞的增殖和迁移

目的 探讨TXNDC12(thioredoxin domain-containing 12)在脑胶质瘤发生中的作用机制。方法 采用生物信息学分析TXNDC12基因在脑胶质瘤中mRNA的表达及其与预后的相关性，并通过Western blot检测TXNDC12在脑胶质瘤组织和正常脑组织中蛋白表达；构建沉默TXNDC12基因的shRNA慢病毒表达质粒，建立沉默TXNDC12的U251稳转细胞株。采用qRT-PCR和Western blot实验分别检测稳转细胞株中TXNDC12的mRNA及蛋白表达；用CCK-8实验、Transwell和划痕实验检测沉默TXNDC12对U251细胞增殖和迁移能力的影响。结果 生物学信息分析显示TXNDC12在脑胶质瘤组织(1.885±0.902)中的蛋白表达比正常脑组织(1.0±0.545,P<0.05)高，且与不良预后相关(高表达组51.5%vs低表达组70.7%,P<0.000 1);沉默TXNDC12后U251细胞增殖能力和迁移能力明显下降(P<0.05)。结论 TXNDC12在脑胶质瘤中可能发挥促癌基因的作用，其高表达可能促进脑胶质瘤细...     

慢病毒介导NFAT 基因对HepG2 细胞生物学行为的影响

目的:观察人HepG2细胞转染载有NFAT-shRNA载体的慢病毒对HepG2细胞生物学行为的影响。方法:设计3种针对NFAT基因的shRNA的干扰序列及阴性对照序列,采用稳定转染的方式构建稳定转染细胞系,挑选出干扰效率最高的shRNA组用于后续实验,采用RT-PCR法检测慢病毒转染后NFAT mRNA及VEGFA mRNA表达情况,Western blot法检测NFAT蛋白及VEGFA蛋白表达量,CCK-8法检测HepG2细胞增殖情况,Transwell法检测细胞迁徙及侵袭能力。结果:3种干扰慢病毒中以shRNA103干扰效果最好。3种NFAT-shRNA干扰作用后,NFAT、VEGFA mRNA及蛋白水相对于对照组降低(P0.05),阴性对照组未见明显变化。CCK-8结果显示干扰组细胞增殖能力较对照组受到抑制。Transwell结果显示干扰组细胞迁徙及侵袭能力较对照组均有所下降。结论:通过RNA干扰技术沉默NFAT基因后,其细胞增殖能力及迁徙侵袭能力均下降,其作用可能与调节VEGFA有关,为靶向NFAT基因治疗原发性肝癌提供相关实验依据。     

人Hes1-shRNA,Hes5-shRNA慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的 构建人Hes1-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,为Notch-Hes信号通路的相关研究奠定基础.方法 根据人Hes1,Hes5基因mRNA序列分别设计、合成多对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至pENTR /U6入门载体.通过入门载体瞬时转染神经胶质瘤U251细胞筛选有效干扰序列.将含有效干扰序列的入门载体与pLenti6/BLOCK-iT-DEST载体进行LR重组构建Hes1-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒.用该慢病毒感染U251细胞,Western印迹法分别检测Hes1,Hes5蛋白的表达.结果 分别构建了针对Hes1和Hes5基因的特异性shRNA慢病毒表达载体,其包装获得慢病毒可有效感染U251细胞并分别对Hes1,Hes5蛋白的表达有显著抑制作用.结论 成功构建了Hes1-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体.     

沉默PAK4基因对胶质瘤细胞U251侵袭与迁移能力的影响

目的观察沉默P21活化酶4(p-21 activated kinase 4, PAK4)基因对神经胶质瘤细胞U251侵袭与迁移能力的影响。方法构建稳定沉默PAK4基因的U251细胞系,shRNA-U251(转染空载组作为对照即shNC组);应用免疫荧光实验检测PAK4在胶质瘤细胞系U251中的表达;应用细胞划痕愈合实验与Transwell侵袭实验比较两组细胞的迁移与侵袭能力的变化;通过Western blotting实验检测沉默PAK4基因后U251细胞系中基质金属蛋白酶MMP2与MMP9的表达改变。结果 PAK4蛋白主要表达于胶质瘤细胞系U251细胞核与细胞质; shRNA-U251组细胞划痕愈合率明显降低; shRNA-U251组细胞进入小室下壁的数量明显减少,shRNA-U251组细胞MMP2与MMP9蛋白的表达水平显著下调。结论沉默PAK4基因下调神经胶质瘤细胞U251的迁移与侵袭能力与降低基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达相关。     

SFRP5基因沉默促进人类胰腺癌细胞系PANC-1增殖与迁移

目的探讨慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默SFRP5基因对人类胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法构建靶向SFRP5基因特异性shRNA慢病毒载体并转染人胰腺癌PANC-1细胞系,以空白质粒转染阴性对照组,未处理细胞做为空白对照组。用real-time PCR及Western blot检测转染前后SFRP5 RNA以及蛋白的表达;CCK-8实验检测细胞体外增殖能力;使用Transwell小室实验分析细胞侵袭能力;细胞划痕实验分析细胞迁移能力。结果成功建立稳定转染shRNA-SFRP5胰腺癌PANC-1细胞株。SFRP5病毒转染组与阴性对照组及空白对照组相比细胞的增殖能力明显增加(P0.01);SFRP5病毒转染组的细胞侵袭、迁移能力明显高于阴性对照组及空白对照组(P0.01)。结论 SFRP5慢病毒干扰载体能有效抑制SFRP5基因在人胰腺癌PANC-1细胞中的表达,进而促进细胞的增殖、侵袭和迁移。     

含B7-H1 shRNA基因的慢病毒表达载体的制备及其抑制效果鉴定

目的 设计针对B7-H1的shRNA序列,构建慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后检测其对U251细胞中B7-H1基因的沉默效果.方法 设计3对针对B7-H1 mRNA的shRNA,化学合成正义链和反义链,退火后与酶切后的pLKO.1载体进行连接.测序正确后包装成病毒并感染U251细胞,分别用qRT-PCR及Western blot法检测干扰效果.结果 qRT-PCR及Western blot结果证实设计的3条RNA干扰序列中有2条可有效沉默U251细胞中B7-H1的表达.结论 所制备的针对B7-H1的shRNA慢病毒能特异性沉默B7-H1.     

基因沉默ILK对胰腺癌细胞增殖能力的影响

目的研究基因沉默ILK对胰腺癌细胞(Panc-1)增殖能力的影响。方法对胰腺癌Panc-1细胞进行细胞培养,成功构建ILK-specific shRNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染,荧光显微镜下观察评估转染效率,然后通过real time PCR及Western blot方法验证干扰基因片段的有效性,应用MTT方法比较转染前后各组胰腺癌细胞增殖能力变化。结果荧光显微镜下观察可见慢病毒转染Panc-1细胞的感染效率达80%以上,转染ILK-specific shRNA慢病毒载体后,ILK mRNA及蛋白表达水平明显降低,在转染后48h、72h、96h时,细胞增殖受到了明显的抑制,且抑制趋势随时间逐渐增强(P0.01)。结论基因沉默ILK的胰腺癌细胞增殖能力受到明显的抑制。     

RNA干扰沉默Aurora A基因表达对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制人胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞增殖及凋亡的影响。 方法 设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blotting检测Aurora A mRNA和蛋白的表达情况,同时利用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验和流式细胞仪观察转染后U251细胞增殖抑制率和细胞凋亡,透射电镜观察细胞凋亡超微结构改变。 结果 转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低;U251细胞增殖的抑制率和细胞凋亡率显著增高 (P<0.01),且U251细胞发生了显著的凋亡形态改变。 结论 体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功地抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡,提示Aurora A可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

RNA干扰TFF3基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰TFF3基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响。方法取60例卵巢癌患者的肿瘤标本,以相对应的癌旁正常卵巢组织标本作为对照组,免疫组织化学方法和real-time PCR法分别检测TFF3蛋白与mRNA的表达。构建针对人TFF3的shRNA表达载体,稳定转染卵巢癌SKOV3细胞株后,分别用MTT方法与Transwell细胞侵袭实验检测转染后各组SKOV3细胞的增殖与侵袭能力变化。结果卵巢癌组织TFF3蛋白的阳性率和平均光密度值、TFF3mRNA的相对表达水平明显高于癌旁正常卵巢组织。沉默TFF3基因后,卵巢癌SKOV3细胞株增殖与侵袭能力显著降低(P0.01)。结论 TFF3在卵巢癌组织过表达,沉默TFF3基因可以降低SKOV3细胞的体外增殖及侵袭能力。     

大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定

目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.     

过表达TAP1上调人胶质瘤细胞株U251 HLA-I的表达

 目的：探讨抗原提呈相关转运蛋白1（TAP1）过表达对人胶质瘤细胞株U251人类白细胞抗原I(HLA-I)表达的影响。方法：培养 U251细胞,构建慢病毒载体并转染U251细胞,获得稳定高表达TAP1的细胞株并设立转染空载体对照组,分别收集U251细胞组、空载体对照组和TAP1基因转染细胞组细胞的蛋白和RNA,行real-time PCR 和Western blotting分析过表达的TAP1对U251细胞HLA-I表达的影响,并用流式细胞术分析U251细胞HLA-I表面呈现的变化。结果：成功建立TAP1高表达U251细胞株,TAP1 mRNA和蛋白分别升高（8.73±1.07）倍和（11.71±0.83）倍。高表达的TAP1促进U251细胞HLA-A、HLA-B、HLA-C（重链）和β2微球蛋白（轻链） mRNA表达上调,分别升高（3.51±0.36）倍、（4.78±0.85）倍、（2.94±0.28）倍和（3.23±0.24）倍, HLA-I蛋白表达升高（3.14±0.53）倍,同时U251细胞HLA-I的表面呈现明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论：过表达TAP1能促进U251细胞HLA-I表达及其在细胞表面呈现的提高。     

血管细胞黏附分子-1增强人脑胶质瘤细胞系迁移和侵袭能力

目的探讨血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)在脑胶质瘤细胞迁移侵袭能力中作用。方法用慢病毒p SGU6/GFP/Neo介导VCAM-1的shRNA、慢病毒EF1a-GFP/puro介导VCAM-1过表达载体、划痕迁移、Transwell侵袭、蛋白免疫印迹(Western blot)和细胞染色等实验技术和方法,观察了VCAM-1蛋白表达水平对人脑胶质瘤T98G和U251细胞系细胞迁移和侵袭能力的影响。其中,T98G细胞分为空白对照组、空载体对照组、乱序对照组和实验组(抑制VCAM-1蛋白表达水平组),U251细胞分为空白对照组、空载体对照组和实验组(过表达VCAM-1组),每组6个复孔。结果首先利用慢病毒介导VCAM-1的shRNA和过表达载体建立了稳定低表达VCAM-1的T98G细胞和稳定过表达VCAM-1的U251细胞。稳定低表达VCAM-1的T98G细胞划痕恢复能力(迁移能力)明显减弱(P0.01);而稳定过表达VCAM-1的U251细胞迁移能力明显提高(P0.05)。同样,稳定低表达VCAM-1的T98G细胞侵袭能力显著减弱(P0.05);而稳定过表达VCAM-1的U251细胞侵袭能力明显增强(P0.01)。结论VCAM-1可显著增强人脑胶质瘤细胞系细胞的迁移和侵袭能力。