平榛主要过敏原一个片段区基因的克隆表达及免疫鉴定

目的:克隆表达平榛(Corh)主要过敏原Corh1的一个片段区基因,并纯化表达的蛋白及检测其免疫学活性。方法:采用生物信息学方法选取Corh1的主要抗原表位区,设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其导入pMD18-T载体中测序。将测序正确的质粒双酶切,并将获得的片段基因导入pET-32a中表达。通过Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,采用Westernblot方法检测其IgE结合活性。结果:克隆并获得了Corh1的主要表位区基因,基因开放阅读框为243个碱基,编码81个氨基酸,蛋白相对分子质量(Mr)约为9000。表达的蛋白以可溶性为主,纯化出的蛋白有较好的免疫原性。结论:成功地克隆表达了Corh1的主要表位区基因,蛋白具有良好的免疫学活性。     

花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h 8基因;将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中;IPTG诱导表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白Ara h 8;Western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生Ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。Western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原Ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

花生主要过敏原Ara h2的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

花生中的Ara h2蛋白是花生的主要过敏原,本研究从化生中克隆出Arah2的基因并表达了该蛋白,该蛋白具有特异的变应原性.     

鸡蛋主要过敏原Gal d1片段基因的克隆、表达、纯化及免疫学鉴定

目的克隆、表达和纯化鸡蛋主要过敏原Gald1区基因,并对其免疫学活性进行鉴定。方法用生物信息学方法对鸡蛋主要过敏原Gald1基因进行抗原表位预测,设计特异性引物,用PCR的方法分别扩增Gald1N端和C端基因,将其分别连接到原核表达载体PET32a上。重组质粒转入大肠杆菌,用IPTG诱导表达,通过镍亲和柱层析法纯化重组蛋白,最后用Western-blotting检测重组蛋白的免疫原性。结果表达的蛋白均以可溶性为主,N端融合蛋白相对分子质量为28600,C端融合蛋白相对分子质量为26800,纯化的N端和C端蛋白均有较好的免疫原性,C端的免疫原性强于N端。结论成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原基因Gald1的N端和C端,为鸡蛋过敏的诊断和免疫治疗奠定了基础。     

猫过敏原白蛋白的克隆表达、纯化和免疫学特性鉴定

目的 克隆、表达猫过敏原白蛋白(Fel d 2),并分析其过敏原活性.方法 提取猫肝脏总RNA,逆转录合成cDNA,采用适宜引物进行PCR扩增目的 基因,随后将其克隆到原核表达载体PET24a( ),在大肠杆菌中进行表达,镍亲和柱层析法提纯重组蛋白,Western blot检测其过敏原活性.结果 序列分析表明所克隆白蛋白的序列由1 752 bp组成,编码584个氨基酸,与Genebank上的基因序列(NM 001009961)同源性为99.9%.SDS-PAGE显示表达的重组白蛋白Mr65 000.免疫印迹表明重组白蛋白具有与猫过敏原过敏病人血清IgE结合活性.结论 表达的重组白蛋白具有与猫过敏患者血清IgE结合活性.     

芝麻主要过敏原清蛋白基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

了芝麻是亚洲地区重要的油料作物,主要含有两种储存蛋白,为11S的球蛋白和2s的清蛋白,这两种蛋白占芝麻中总蛋白的80%～90%,清蛋白是其中主要的致敏蛋白之一.     

牛奶主要过敏原α_(s1)-酪蛋白全长与片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆并表达牛奶中主要过敏原αs1-酪蛋白的全长及N端、C端两个片段区基因,用于筛选与制备牛奶主要过敏原的单克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术克隆αs1-酪蛋白基因,测序后将目的片段克隆入原核表达质粒pET载体,转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,获得重组αs1-酪蛋白。用Ni2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELISA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性。结果:克隆获得αs1-酪蛋白全长的开放阅读框基因为645bp(含终止密码子),编码214个氨基酸。N、C端片段区基因(含终止密码子)分别为285、294bp,编码94、97个氨基酸。三种重组蛋白均能以可溶性表达形式纯化,经Western blot和ELISA检测都具有较好的免疫原性,而αs1-酪蛋白全长的免疫原性更强。结论:成功地克隆和表达了αs1-酪蛋白全长及N、C端两个片段区基因,为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体,制备牛奶主要过敏原的检测试剂奠定了基础。     

椰子花粉过敏原基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆并表达椰子花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白(Profilin).方法:利用RT-PCR结合RACE技术克隆椰子花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析.然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个椰子花粉profilin的开放阅读框,将其与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western blot检测其IgE结合活性.结果:克隆获得了椰子花粉profilin的全长基因,由608个碱基组成,开放阅读框为396个碱基(包括终止密码子),编码131个氨基酸.经分析,这个序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白,等电点为4.61,分子量约为14 kD.此序列已被GeneBank收录,登陆号为EF173598.重组椰子花粉profilin在大肠杆菌中高效的表达和纯化后,经Western blot检测具有良好的免疫学活性.结论:成功地克隆和表达了椰子花粉profilin,为该花粉profilin用于椰子花粉过敏诊断和免疫治疗提供了理论依据.     

王棕花粉过敏原基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

目的 克隆并表达王棕花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白(profilin).方法 利用RT-PCR结合RACE技术克隆王棕花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析.然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个王棕花粉profilin的开放阅读框,将其与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用Western blot检测其IgE结合活性.结果 克隆获得了王棕花粉profilin的全长基因,由675个碱基组成,开放阅读框为396个碱基(包括终止密码子),编码131个氨基酸.经分析,这个序列编码的蛋白为小分子质量酸性蛋白,等电点为4.86,相对分子质量(Mr)约为14.2×103.此序列已被GenBank收录,登录号为EF173599.重组王棕花粉profilin在大肠杆菌中高效表达,进一步经Ni2+亲和层析柱纯化后经Western blot检测具有良好的免疫学活性.结论 成功克隆和表达了王棕花粉profilin,为王棕过敏的诊断和免疫治疗奠定了基础.     

家蚕过敏原CSP5克隆表达、纯化鉴定及分析

克隆家蚕过敏原CSP5(chemosensory protein 5precursor)基因,表达、纯化该蛋白,鉴定其免疫活性,并进行生物信息学分析。人工合成家蚕化学感受蛋白5前体CSP5基因,将其连接至pMD18-T克隆载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后进行纯化,用western blotting和ELISA鉴定其免疫学特性,并采用生物信息学方法预测CSP5蛋白的理化性质、三级结构、潜在B细胞抗原表位。本研究成功克隆了纯度较高的重组CSP5蛋白,测序鉴定蛋白分子质量约为14.25kD。重组过敏原CSP5能与家蚕过敏患者血清IgE发生特异性结合。生物信息学方法推导其潜在B细胞抗原表位为17~22、35~36、51~55、70~74、106~110、112~115。获得的重组蛋白CSP5具有与天然蛋白相似的免疫学活性,为以标准化抗原作为临床特异性诊断和治疗以及由家蚕引起的过敏性疾病的进一步研究奠定了基础。     

平榛主要过敏原Corh1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb)。方法用重组Cor h 1蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白A亲和层析法纯化抗体。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该McAbs的特性和交叉性。结果获得4株可稳定分泌鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的McAbs,其Ig亚型均为IgG1,均具有良好的效价;ELISA和Western Blotting分析表明该4株单抗均能识别重组Cor h 1蛋白,其中3株单抗能够识别天然平榛提取物。结论成功制备了4株鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体,为建立平榛主要变应原Cor h 1检测及纯化方法奠定了基础。     

Ca2+离子对榛子过敏原Cor h 1二级结构和抗原活性影响研究

目的:研究Ca2+离子对非CaBPs蛋白类过敏原二级结构和抗原活性的影响。方法:以重组榛子主要过敏原Cor h 1为研究对象,用圆二色谱(CD)研究了系列浓度的Ca2+和EDTA各自存在情况下,不同蛋白浓度溶液中rCor h 1二级结构的变化及规律,并以榛子过敏患者血清为一抗,用ELISA实验分析了Ca2+和EDTA对rCor h 1抗原活性的影响。结果:在高浓度rCor h 1溶液中Ca2+的加入可以引起椭圆率的增加,而在低浓度的rCor h 1溶液中则引起椭圆率的降低;EDTA在高浓度和低浓度的rCor h 1溶液中均能引起rCor h 1二级结构相对含量的降低;椭圆率增加(或降低)的幅度与Ca2+、EDTA终浓度成正比。ELISA实验表明Ca2+和EDTA都能显著降低rCor h 1的抗原活性。结论:Ca2+离子可以显著影响rCor h 1的二级结构,降低其抗原活性,为非CaBPs蛋白类低致敏原的研究奠定了较好的前期研究基础。     

梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定

目的构建梅毒螺旋体0751基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及进行免疫学鉴定。方法以梅毒螺旋体基因组DNA为模板,PCR扩增梅毒螺旋体0751基因,构建其重组原核表达载体,并采用Western-blot方法初步鉴定该蛋白的特异性。结果成功扩增出梅毒螺旋体0751基因,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特异性识别梅毒患者血清。结论在大肠杆菌中成功表达梅毒螺旋体0751基因,为梅毒螺旋体的诊断提供了新的特异性抗原。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

TEM-1型β-内酰胺酶编码基因的克隆表达

目的：构建TEM-1型β内酰胺酶基因的表达载体。方法：通过PCR扩增TEM—1全编码基因,将其连接入pBK—CMV载体中,并在大肠杆菌JM109中表达。采用琼脂二倍稀释法对TEM-1克隆菌株进行MIC检测,双纸片法筛选及确证实验检测其袁型,等电聚焦（IEF）电泳测定其等电点（pls）。结果：经酶切测序鉴定TEM—1基因的表达载体构建正确。重组菌产pl为5．4的TEM-1广谱酶,仅对青霉素类耐药。结论：TEM—1基因原核表达载体正确构建,为进一步研究打下了基础。     

人4-1BB配体基因真核表达载体的构建、表达及其体外抗肿瘤效应

目的： 构建人4-1BB配体（h4-1BBL）全长基因的真核表达载体, 并在肿瘤细胞HT-29中转染表达; 探讨人4-1BBL基因转染的肿瘤细胞体外诱导的抗肿瘤活性.方法： 用RT-PCR从Raji细胞中克隆h4-1BBL全长基因, 测序后, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1（-）-h4-1BBL.通过脂质体法以重组载体转染HT-29细胞, 用RT-PCR检测转染细胞中h4-1BBL mRNA的表达; 用流式细胞术检测转染细胞表面h4-1BBL分子的表达.分离外周血单个核细胞（PBMC）, 用抗CD3 mAb扩增T细胞, 并与h4-1BBL基因转染及未转染的HT-29细胞混合培养.用MTT比色法检测CTL的增殖及杀伤活性; 用流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞.结果： 从Raji细胞中克隆到h4-1BBL全长cDNA, 测序完全正确.构建的h4-1BBL基因真核表达载体在HT-29中获得稳定表达.与未转染的细胞相比较, h4-1BBL基因转染的肿瘤细胞HT-29能更有效地刺激T细胞活化、增殖, 促进IFN-γ分泌, 并能有效地诱导CTL产生针对野生型HT-29细胞的特异性杀伤.结论： 成功地构建pcDNA3.1（-）h4-1BBL重组真核表达载体.4-1BBL基因转染的肿瘤细胞介导的协同刺激信号, 能增强野生型肿瘤细胞的免疫原性, 诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

Relevance of Ara h1, Ara h2 and Ara h3 in peanut-allergic patients, as determined by immunoglobulin E Western blotting, basophil–histamine release and intracutaneous testing: Ara h2 is the most important peanut allergen

BACKGROUND: A number of allergenic proteins in peanut has been described and the relative importance of these allergens is yet to be determined. OBJECTIVES: We have investigated the relevance of previously identified peanut allergens in well-characterized peanut-allergic patients by in vitro, ex vivo and in vivo assays. METHODS: Thirty-two adult peanut-allergic patients were included based on careful and standardized patient history and the presence of peanut-specific IgE. The diagnosis peanut allergy was confirmed using double-blind placebo-controlled food challenges in 23 patients. Major peanut allergens Ara h1, Ara h2 and Ara h3 were purified from peanuts using ion-exchange chromatography. IgE immunoblotting was performed and IgE-cross-linking capacity was examined by measuring histamine release (HR) after incubating patient basophils as well as passively sensitized basophils with several dilutions of the allergens. Intracutaneous tests (ICTs) using 10-fold dilution steps of the purified allergens and crude peanut extract were performed. RESULTS: Ara h2 was recognized most frequently (26 out of 32) in all tests and induced both positive skin tests and basophil degranulation at low concentrations, whereas Ara h1 and Ara h3 were recognized less frequently and reacted only at 100-fold higher concentrations as analysed with HR and intracutaneous testing (ICT). Next to the three tested allergens, proteins with molecular weights of somewhat smaller than 15 kDa were identified as a IgE-binding proteins on immunoblot in the majority of the patients (20 out of 32). CONCLUSION: We conclude that Ara h2 is, for our patient group, the most important peanut allergen, and that previously unidentified peanut proteins with molecular weights of somewhat smaller than 15 kDa may be important allergens as well. ICT in combination with basophil-HR and IgE immunoblotting provides insight in the patient specificity towards the individual peanut allergens.     

人TSLC1基因核心启动子的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定人TSLC1基因的核心启动子区,用于开展其转录调控机制的研究。方法用PCR方法从人基因组DNA中扩增出TSLC1基因翻译起始位点上游一系列大小不等的片段,连入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中。通过瞬时转染A549及NCI-H446细胞,检测细胞裂解液中的双荧光素酶活性,确定TSLC1基因的核心启动子区。结果在人TSLC1基因启动子区的分段克隆中,ATG上游-68～-329 bp片段在A549及NCI-H446细胞中均具有很强的启动活性,对TSLC1的转录起重要作用。结论人TSLC1基因翻译起始位点ATG上游-68～-329 bp区域可能为基因的核心启动子区。