腺病毒载体基因转移系统的建立及其在脑肿瘤中的高效表达

构建了含有ＣＭＶ启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ基因的重组质粒ｐＡｄＣＭＶｔｋ将其与缺陷型腺病毒Ａｄ５大框架ｐＪＭ１７－一起共转染病毒包装细胞２９３细胞，获得有感染能力但复制缺陷在得组腺病毒ＡｄＣＭＶｔｋ，以其感染大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞后用ＰＣＲ方法证实ＨＳＶ－ｔｋ基因能被腺病毒有效转入靶细胞，用带报告基因ＬａｃＺ的腺病毒感染大鼠Ｃ５脑胶质瘤细胞，经ｘ－ｇａｌ染色，证明腺病毒载体的基因转移效率可达１００％。     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

HCV 定量 RT-PCR 竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的ＥｃｏＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏⅠ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。应用限制性酶切和ＰＣＲ对这两种重组质粒进行了鉴定，为ＨＣＶ－ＲＮＡ的定量ＰＣＲ提供有用的内参照模板。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

多肿瘤抑制基因第二外显子表达载体的构建

建立人多肿瘤抑制基因第二外显子ｃＤＮＡ的表达克隆。方法 用反转录－ＰＣＲ取得ＭＴＳ１第二外显ｃＤＮＡ，并将春直接联接入质粒ｐＧＥＭ－Ｔ中，构建为重组质粒ｐＧＥＭ－ｐ１６。结果 重组质粒的酶谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入ｃＤＮＡ－ＰＣＲ片段大小为３０７ｂｐ，与引物区间大小一致。     

腺病毒-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化。经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶切图谱,重组病毒具高滴度的感染活性。结论：ＡＤＶ－ＴＫ基因的构建为ＨＳＶ－ＴＫ基因的临床应用提供了更为有效的手段。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

携带人尿激酶原cDNA的重组腺病毒载体的构建及其在体内的表达

目的 构建表达人尿激酶原的重组腺病毒载体,为临床基因治疗提供实验依据。方法 采用亚克隆获得的ｐＣＡ１４－ｐｒｏ－ＵＫ重组质粒与质粒ｐＪＭ１７共转染培养的２９３细胞,经同源重组,得到含有ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ的重组腺 主增纯化后,局部转染经球囊损伤后的兔股动脉。７天后,分别收集转染的血因管段,以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹和免疫组化检测表达。结果 （１）经ＰＣＲ扩增及体外感染Ａ５４９细胞结果表明,获得了具有生     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒

目的 构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法 应用PCR扩增出CD和TK基因，经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK。经酶切线性化后。转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。滴度测定后，体外感染血管内皮细胞ECV304。结果 PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒，为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短。     

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的：制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法：酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至芽梭载体构建重组pAcTrack-CMV-NP9载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果：酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(CFP)表达并逐渐增多、增强：结论：成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

SLC基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid organ chemokine, SLC)基因的重组腺病毒.方法 采用PCR技术从含有SLC基因的质粒上扩增出SLC基因,将PCR产物酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将SLC基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带SLC基因的重组腺病毒.结果 成功将SLC基因片段克隆至pAd/CMV/V5- DEST载体上,并经293细胞包装出病毒颗粒;经测定病毒滴度为2.6×108 pfu/mL.结论 构建的重组SLC腺病毒可将SLC基因导入肿瘤细胞或组织内,为进一步研究SLC基因的抗肿瘤作用提供了基础.     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

携带Lipocalin 2的溶瘤腺病毒抑制胰腺癌生长的实验研究

 目的 构建携带人Lipocalin 2基因且删除E1B55基因的溶瘤腺病毒,研究其体外对胰腺癌细胞生长的抑制作用。方法 利用RT-PCR技术获得Lipocalin 2基因并克隆至pCA13质粒, 构建pCA13-lipocalin 2。用Bgl II从pCA13-lipocalin 2酶切出包含CMV启动子及Lipocalin 2的表达框, 将该表达框亚克隆入质粒pZD55, 获得pZD55-lipocalin 2。将pZD55-lipocalin 2与pBHGE3共转染293细胞,重组产生携带Lipocalin 2的溶瘤腺病毒ZD55-lipocalin 2。经PCR和Western blot鉴定正确后,体外采用结晶紫染色和MTT法,观察其对胰腺癌细胞生长的抑制作用。结果 ZD55-lipocalin 2能在PANC-1细胞中增殖复制并表达Lipocalin 2蛋白,结晶紫染色和MTT法观察到该溶瘤腺病毒能明显抑制PANC-1细胞生长。结论 成功构建了携带人Lipocalin 2的溶瘤腺病毒,其能明显抑制胰腺癌细胞生长,为胰腺癌治疗提供新策略。     

人单纯疱疹病毒1型VP22介导的microdystrophin重组腺病毒的构建及其蛋白转导特性

目的构建含有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22与人microdystrophin基因融合的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,探讨VP22对microdystrophin基因在成肌细胞中的蛋白转导特性。方法设计引物,从质粒pSIN-rep5-VP22中扩增VP22全长基因,然后将VP22基因定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pCMV-VP22;再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-micro质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入重组质粒pCMV-VP22,获得重组质粒pCMV-VP22-MICDYS。PmeI线性化重组质粒pCMV-VP22-MICDYS,去磷酸化后回收与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组腺病毒。将含VP22-microdystrophin及microdystrophin的病毒上清分别转染成肌细胞C2C12,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测microdys-trophin的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,Western-blot及免疫组织化学检测显示VP22显著提高了microdystrophin蛋白在C2C12细胞中的表达。结论含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒载体的构建及VP22介导microdystrophin在成肌细胞C2C12间的转导,为利用此病毒进行假肥大型肌营养不良症疾病的治疗研究奠定了基础。