甲状腺癌差异表达cDNA消减文库的构建

目的 应用抑制性消减杂交技术，构建人甲状腺癌与正常甲状腺差异表达的cDNA消减文库。方法 分别从甲状腺癌及正常甲状腺组织中提取总RNA，应用高效、灵敏的抑制性消减杂交技术，构建成功cDNA消减文库，再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果 构建成功具有高消减效率的人甲状腺癌组织cDNA消减文库，文库扩增得到了400个克隆，随机挑取50个制备质粒，酶切分析均得到50bp-400bp大小插入片段，这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论 人甲状腺癌组织cDNA消减文库的建立为进一步克隆甲状腺癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

人胃癌细胞表达cDNA文库的快速构建

从人胃癌细胞中提取总ＲＮＡ，分离其ｍＲＮＡ，合成双链ｃＤＮＡ，插入定向表达载体λｇｔ１１，转染大肠肝菌Ｙ１０９０，构建了人胃癌细胞ＭＧＣ ８０３表达ｃＤＮＡ文库。该文库有１０×１０６个重组子，重组率为９１５％。     

人骨质疏松cDNA表达文库的构建及分析

目的构建人骨质疏松骨组织cDNA文库,为筛选与骨质疏松的发生特异相关的基因及探讨骨质疏松发病机制奠定基础.方法以Trizol一步法从骨质疏松小鼠长骨中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR法反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建骨质疏松小鼠cDNA文库,对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定.结果原始文库的滴度为4.8×105pfu/ml,总克隆数为4.6×105,重组率为96.2%,扩增后文库总滴度为6.1×109pfu/ml,插入片段多分布在0.5～2.6kb之间,绝大部分在1.4～1.9kb左右,文库质量鉴定结果表明,构建的骨质疏松小鼠cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.结论构建cDNA文库为克隆骨质疏松相关功能基因的研究奠定了基础.     

二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞差异表达基因cDNA文库的建立

目的　建立二烯丙基二硫 (DADS)诱导人胃癌细胞MGC80 3细胞差异表达基因的cDNA文库。方法　采用抑制消减杂交技术 ,筛选DADS处理人胃癌细胞MGC80 3细胞后差异表达的相关基因。经过抑制消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增 ,获得富集的差异表达的cDNA文库 ,PCR检测插入片断的阳性克隆。结果　建立DADS诱导人胃癌MGC80 3细胞差异表达基因的cDNA文库 ,并从消减文库中随机挑取的 10 0个白色克隆中筛选个阳性克隆 ,发现插入片断为 10 0～ 6 0 0bp。结论　应用抑制消减杂交方法可有效筛选DADS处理人胃癌细胞MGC80 3细胞后差异表达的相关基因 ,其消减cDNA文库的建立 ,为进一步寻找胃癌发生相关新基因 ,深入揭示DADS对肿瘤细胞的作用机制提供了新的重要线索。     

传代培养后主动脉内皮细胞差异表达基因cDNA序列的动脉粥样硬化相关性分析

目的筛选并分析传代培养后血管内皮细胞上表达下调基因。方法通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建的传代培养前后主动脉内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,用聚合酶链反应(PCR)方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆,将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对部分cDNA序列进行初步鉴定。建立兔动脉粥样硬化模型,采用RNA点杂交技术鉴定部分筛选到的cDNA序列的动脉粥样硬化相关性。结果从消减文库中随机挑取的750个白色克隆中筛选出88个阳性克隆,DNA测序获得61个cDNA序列,其中26个为已知牛基因序列,19个与已知人基因具有高度同源性,其他16个是未知基因片段,选择4个已知基因采用RT-PCR验证了基因筛选的可靠性。5个新基因具有动脉粥样硬化相关性。结论用抑制消减杂交法构建的传代培养前后主动脉内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库富含动脉粥样硬化相关基因。     

二烯丙基二硫诱导人白血病HL-60细胞分化差异表达cDNA文库的构建

目的　应用抑制性消减杂交技术构建二烯丙基二硫(diallyldisulfide ,DADS)诱导人白血病细胞分化的消减杂交cDNA文库 ,以期克隆DADS诱导人白血病HL 6 0细胞分化的相关基因。方法　用DADS诱导人白血病HL 6 0细胞分化 ,提取polyA+ RNA ,反转录合成cDNA ,消化成短片段后分成两组 ,分别与两种不同的接头连接 ,再与未处理的白血病细胞cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增 ,将PCR产物与pGEM T线性载体连接 ,转化大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆进行酶切鉴定。结果　成功地构建了具有高消减效率的DADS诱导白血病细胞分化的cDNA文库 ,随机挑取消 2 0 0个克隆制备质粒并酶切分析 ,其中 84 5 %的克隆均具有 1 0 0～ 6 0 0bp左右的插入片段 ,说明每一克隆中均含有特异性的目的片段 ,从而为大批量筛选、克隆DADS诱导人白血病细胞分化的相关未知新基因奠定了基础。结论　DADS能诱导人白血病HL 6 0细胞分化 ,并引起相关的基因发生改变 ,而抑制性消减杂交技术能有效地分离差异表达的基因。     

中华大蟾蜍耳后腺全长cDNA文库的构建

目的构建中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)耳后腺全长cDNA文库。方法采用TRIzol法提取耳后腺总RNA,经亲和色谱纯化获得总mRNA。以总mRNA为模板,利用In-FusionSMART-erTMDirectional cDNA Library Construction Kit获得初始文库,测定文库滴度、重组率及插入片段长度。随机选取211个克隆进行测序。结果初始文库的滴度为1.3×109cfu.L-1,重组率90%,插入片段大小分布为0.4～4.0 kbp,平均片段大小约为1.1 kbp。共获得180个表达序列标签(ex-pressed sequence tag,EST)。结论此方法所构建文库各项指标均符合要求,为从功能基因组水平研究中华大蟾蜍耳后腺的基因表达及其功能奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBVe抗原结合蛋白1反式激活基因

目的：筛选与克隆HBe抗原(HBeAg)结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因。了解其可能存在的调节功能线索。方法：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因．以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞。以空载体pcDN3．1(-)为平行对照。制备转染后的细胞裂解液。提取mRNA并逆转录为cDNA。经RasI酶切后。将实验组cDNA分成两组。分别与两种不同的接头衔接。再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)。将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果：成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库．文库扩增后得到85个阳性克隆。进行菌落PCR分析。均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序。并通过生物信息学分析获得其全长基因序列。结果共获得14种编码基因。包括13种已知基因和1种未知基因．结论：筛选到的cDNA全长序列。包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。推测。HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

长春花细胞C_(20)hi生物碱超量合成及激素自养的分子机制探讨

以长春花激素自养型细胞株C20hi及其母株C20D为材料,构建抑制性差减cDNA文库,斑点杂交筛选后对阳性克隆进行测序,共得到104个不同的差异表达基因片段。将这些序列在GenBank中进行BLAST比对分析,其中28个与已知基因具有很高的同源性。对部分基因的分析发现长春花细胞C20hi中g10h-like、CrPS(Catharanthus roseus protein S)、HyPRP(hybrid prolin-rich protein)、PNAE(polyneuridine aldehyde ester-ase)-like等基因的差异表达可能与该细胞株生物碱超量合成有关;而细胞色素P45071D和CR5基因的差异表达则可能与其激素自养有关。此外,培养基中2,4-D的缺失引起的TDC等酶活性的增强也可能是C20hi细胞生物碱超量合成及激素自养的原因之一。     

人膀胱癌BLZ211细胞cDNA文库的构建分析

目的:构建人膀胱癌BLZ211细胞表达型cDNA文库,为肿瘤抗原的筛选奠定工作基础。方法:提取BLZ211细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,削平cDNA末端,连接EcoRI适配子,磷酸化EcoRI适配子5′端,XhoI酶切,Sephacryl-S400柱除去小于400bpcDNA片段,与λZAP表达载体连接,包装蛋白包装后建成cDNA文库;取出1μl倍比稀释感染大肠杆菌XL1-Blue-MRF’,测定文库大小、重组率;随机挑取7个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoRI和XhoI酶切后,初步确定片段的大小及多样性。结果:构建成含1.39×106重组子的BLZ211细胞cDNA文库,重组子平均插入外源片段长约1.3kb。结论:所建文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

重组β-干扰素上调HepG2细胞表达基因抑制性消减杂交技术筛选

目的利用抑制性消减杂交技术筛选重组β-干扰素（IFN-β）上调HepG2细胞表达基因。方法以重组IFN-β 2 000 U·mL^-1刺激对数生长期HepG2细胞，设经0.9%氯化钠注射液作用的HepG2细胞为阴性对照组；制备HepG2细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录合成cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与阴性对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行基因文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建了重组IFN-β作用HepG2后差异表达的cDNA消减文库。扩增后得到50个200～1 000 bp插入片段的克隆，随机挑选其中31个插入片段测序，通过生物信息学分析获得其全长基因序列，共获得20种编码基因，其中1种为未知功能的新基因。结论通过该方法可筛选得到IFN β作用于HepG2细胞后上调表达的部分基因，包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。     

应用抑制消减杂交技术克隆人胰腺癌差异表达基因

目的应用抑制消减杂交技术克隆胰腺癌差异表达基因。方法提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA并合成双链cDNA,经Rsa1酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为2组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物克隆至T／A载体,并转化大肠杆菌TOPIOF’构建消减cDNA文库。随机挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到251个白色克隆,随机挑取53个白色克隆进行PCR扩增分析,其中50个克隆有插入片段,克隆阳性率为96％。片段大小主要集中在300—600bp之间。对50个有插入片段的阳性克隆进行测序,得到45个可用序列。同源性分析发现44个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因。结论应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条差异表达基因可能为新的胰腺癌相关基因。为进一步研究胰腺癌发生,发展的分子机量提供了新的线索。     

海南产桶形芋螺毒管cDNA文库构建

目的构建海南产桶形芋螺毒管cDNA文库,为桶形芋螺毒素基因资源的永续保存和新型药物的研发提供依据。方法以总RNA抽提试剂盒,从桶形芋螺毒管中提取总RNA,采用SMART技术,LD-PCR扩增获得双链cDNA,经SfiⅠ酶切和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,将500bp以上的片段与载体pDNR-LIB连接,通过电穿孔转入E.coli JM109,获得原始文库;随机挑取单菌落,经菌液PCR鉴定重组率及插入片段大小,最后扩增文库。结果经鉴定,所得文库的容量约为5.0×106个克隆,原始文库的平均滴度为5.01×108,插入片段平均长度为1.0kb,文库的重组率达到92%。结论所构建的文库是合格的,为新型芋螺毒素的发现和研究利用提供了依据。     

新疆一枝蒿cDNA文库构建方法研究

目的:建立构建新疆一枝蒿cDNA文库的方法。方法:采用改良Trizol法提取一枝蒿幼嫩叶片总RNA,反转录成单链c DNA,长距离聚合酶链反应法(LD-PCR)合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K消化,采用sfiⅣ酶切,酶切产物用CHROMA SPIN-400柱分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA,以λTripl E×2噬菌体连接并进行体外蛋白包装,利用SMART技术构建一枝蒿全长cDNA文库;随机挑取文库中20个单克隆,电泳法测定原始文库滴度、文库容量、cDNA插入片段的重组阳性率与大小。结果:原始文库滴度为1.94×107pfu/mL,库容量为0.97×107pfu;cDNA插入片段重组阳性率为96%,大小为0.5~2.0 kb,平均为0.9 kb。结论:所构建的高库容、高质量的文库可为新疆一枝蒿cDNA文库的构建提供基础。     

cDNA芯片技术杂交效率的优化

目的cDNA芯片杂交影响因素很多,如固定于玻片的DNA片段的浓度、溶解DNA片段的点样液、荧光探针浓度及纯度杂交液、杂交温度、杂交时间和Cy3与Cy5荧光素标记探针等,本实验针对其中重要影响因素进行优化筛选,以提高杂交效率。方法通过逐一改变cDNA杂交技术重要影响因素的实验条件,平行设置多组实验,从中筛选出最佳实验数据。结果与结论重复实验结果表明,杂交效率较高的条件为:浓度约为0.50 μg·μL^-1 DNA片段，溶于1×Micro Spotting Solution(ArrayIt^TM)中，与纯化后的荧光标记在0.5%SDS/10×SSC甲酰胺杂交液，在42℃杂交。     

人EPO cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人红细胞生成素（ＥＰＯ）的工程细胞株。方法：用 ＤＮＡ磷酸钙共转染法,将人ＥＰＯ ｃＤＮＡ的表达质粒 ｐＣＤＢ与标志质粒 ｐＳＶ－ｄｈｆｒ共转染到 ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。用 ＥＬＩＳＡ法检测到 ７０个克隆的细胞培养上清,筛选出５０个克隆细胞系。结果：经ＭＴＸ加压扩增,获得４系高效表达ＥＰＯ的细胞系（Ｂ４、Ｃ３、Ｆ１０、Ｇ７）,表达量为 ２． ２～１０ μｇ／（１０６ ｃｅｌｌ· ２４ ｈ）,ＥＰＯ的分泌量在上述细胞系扩增了 １１～３１倍。 Ｆ１０细胞系表达量为最高,并进一步亚克隆纯化。其中Ｆ１０－６亚克隆细胞株的平均表达水平为１０ ｕｇ／（１０６ｃｅｌｌ·２４ ｈ）,细胞冻存后复苏传代１５次,ＥＰＯ的表达水平无明显改变。结论：以Ｆ１０－６亚克隆细胞株建立了工程细胞株。     

大理石芋螺Fosmid文库的构建及鉴定

目的 芋螺毒素(芋螺肽)具有特异结合各种离子通道和受体的特殊功能,拥有巨大的新药开发潜力.但因海洋生态环境的破坏和无序采集,芋螺的种类和数量在不断减少,在国际上已被列为濒危保护动物.所以,对芋螺遗传资源和基因信息的长期保存具有非常重要的科学和实际意义.方法 研究针对中国南海产大理石芋螺(Conus marmoreus)...     

体外凝集性生长状态下毛乳头细胞特异表达基因分析

目的克隆并分析毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因。方法应用抑制性消减杂交技术构建毛乳头细胞在凝集性生长状态下特异表达基因的消减cDNA文库,通过PCR、eDNA斑点杂交技术筛选和验证差异表达基因,并通过同源性检索对其进行分析。结果体外凝集性生长状态下的毛乳头细胞可以特异表达与细胞同源凝集、生长调控、分化发育及信号转导相关的基因,包括已知基因（如加帽蛋白、palladin,VEGF基因）、造血干细胞分化相关基因（HSPC011、HSPC016基因）及1段新基因。这些基因多是首次发现在毛乳头／毛囊中有表达。结论多种基因可能协同作用参与毛乳头细胞的凝集生长、增殖和细胞周期调控。在这些基因产物中,加帽蛋白和palladin可能与凝集生长相关,VEGF和HSPC可能与毛乳头细胞的增殖和分化相关。