XCT-790对沉默DKKl、Sost腺病毒载体转染MG63细胞中OPG、CTGF、FGF2、TNFα的影响研究

目的 研究ERRα抑制剂（XCT-790)对沉默Wnt信号通路抑制因子Dickkopf1(DKK1)、骨硬化蛋白Sclerostin( Sost)重组腺病毒载体转染MG63细胞中OPG、CTGF、FGF2、TNFα的影响。方法 本实验将培养好的MG63细胞分为空白对照组、沉默DKK1组、沉默Sost组、沉默（DKK1 + Sost)组、XCT-790处理空载腺病毒组、XCT-790处理沉默DKK1组、XCT-790处理沉默Sost组、XCT-790处理沉默（DKK1 + Sost)组,根据组别不同分别用包装好的沉默DKK1、Sost腺病毒载体转染MG63细胞,应用 Western blot检测MG63细胞中OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的表达量。结果 （1 )与空白对照组对比,沉默DKK1、Sost、 DKK1 + Sost可以提高OPG、CTGF、FGF2表达量（P <0. 05),降低TNFα表达量（P <0. 05) ;XCT-790干预MG63细胞可降低OPG、CTGF、FGF2 表达量（P <0. 05),增加 TNFα表达量（P<0. 05) ;(2)与沉默 DKK1、Sost、DKKl + Sost 组比较,XCT-790 处理沉默DKKl、Sost、DKKl + Sost组可降低因沉默DKK1、Sost、DKKl + Sost而增加OPG、CTGF、FGF2的表达量的作用（P <0. 05 ), 增加因沉默DKK1、Sost、DKKl + Sost而降低TNFα的表达量（P <0. 05)。结论 XCT-790可以降低MG63细胞中OPG、CTGF、 FGF2表达量,升高TNF α表达量;还可以调节因沉默DKK1、Sost、DKK1 + Sost而改变的MG63细胞中OPG、CTGF、FGF2及 TNFα的表达量。     

沉默DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞增殖、ALP活性和钙离子浓度影响研究

目的构建Wnt信号通路抑制因子Dickkopf1(DKK1)、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因沉默重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和钙离子浓度影响作用。方法设计出特异性针对DKK1、Sost和无关对照序列(Scr),构建DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,用q PCR法和蛋白印记(Western blot)法选出沉默效率最好的扩增DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,并用荧光显微镜观察计算病毒滴度。MG63细胞被分成空白对照组、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组、沉默Sost(Ad-sh Sost)组、沉默DKK1+Sost(Ad-sh DKK1+Ad-sh Sost)组4组,分别用优选出的沉默效率最好的sh DKK1和sh Sost腺病毒载体转染MG63细胞,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)检测观察细胞增殖、考马斯亮蓝蛋白定量法测定ALP活性、流式分析法测定钙离子浓度。结果 1DKK1 p Ad-sh DKK1-1和Sost p Ad-GFP-shRNA-2沉默效率最高;2与空白对照组对比,沉默DKK1组、沉默Sost组、沉默DKK1+Sost组的细胞光吸收值(OD)、ALP活性测定值均升高,而钙离子浓度均降低,以沉默DKK1+Sost组变化最明显,组间比较具有统计学差异(P0.01和P0.05)。结论 DKK1、Sost沉默可促进MG63细胞增殖、提高ALP活性,降低钙离子浓度,尤以二者同时沉默时的作用最强。     

沉默DKKl、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63 细胞增殖、ALP活性和钙离子浓度影响研究

目的 构建Wnt信号通路抑制因子Dickkopfl(DKKl)、骨硬化蛋白Sclerostin( Sost)基因沉默重组腺病毒载体，观察其对MG63细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP)活性和钙离子浓度影响作用。方法设计出特异性针对DKKl、Sost和无关对照序列 (Scr),构建DKKl、Sost沉默重组腺病毒载体，用qPCR法和蛋白印记（Western blot)法选出沉默效率最好的扩增DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体，并用荧光显微镜观察计算病毒滴度。MG63细胞被分成空白对照组、沉默DKKl(Ad-shDKKl)组、沉默 Sost(Ad-shSost)组、沉默DKK1 + Sost( Ad-shDKKl + Ad-shSost)组4组，分别用优选出的沉默效率最好的shDKKl和shSost腺病毒载体转染MG63细胞，采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT)检测观察细胞增殖、考马斯亮蓝蛋白定量法测定ALP 活性、流式分析法测定钙离子浓度。结果 ①DKK1 pAd-shDKKl-1和Sost pAd-GFP-shRNA-2沉默效率最高；②与空白对照组对比，沉默DKK1组、沉默Sost组、沉默DKK1 + Sost组的细胞光吸收值（OD)、ALP活性测定值均升高，而钙离子浓度均降低， 以沉默DKK1 +Sost组变化最明显，组间比较具有统计学差异（P<0.01和P<0.05)。结论 DKK1、Sost沉默可促进MG63细胞增殖、提高ALP活性，降低钙离子浓度，尤以二者同时沉默时的作用最强。     

补肾健脾活血方干预沉默DKK1、Sost骨细胞对细胞活性和相关蛋白的影响研究

目的用补肾健脾活血方干预沉默Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)转染的成骨细胞,观察其对细胞活性和相关蛋白的影响。方法将培养好的细胞分为空白对照组(NC组)、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组和沉默Sost(Ad-sh Sost)组,空载腺病毒转染NC组,沉默DKK1和Sost重组腺病毒转染其余两组,再分别给予空白血清和含药血清干预,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性以及骨相关蛋白变化情况。结果 (1)三组含药血清干预后的细胞活性强于空白血清干预后的细胞活性。与空白血清干预的三组比较,含药血清干预后的三组细胞活性在24、48、72 h均增加,尤其在72 h时含药血清对Ad-sh DKK1组的细胞活性作用更强,与同组空白血清比较,差异有统计学意义(P0.05);(2)三组含药血清干预与空白血清干预比较ALP活性明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。含药血清干预后,与NC组比较,其余两组ALP活性显著升高,差异有统计学意义(P0.01),Ad-sh DKK1组和Ad-sh Sost组比较,ALP活性升高不明显;(3)与空白血清干预比较,含药血清干预后三组的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)均升高,与NC组比较,Ad-sh DKK1组OPG、OPN差异有统计学意义(P0.05和P0.01),Ad-sh Sost组CTGF、OPG、OPN差异有统计学意义(P0.05)。结论补肾健脾活血方含药血清可显著促进沉默DKK1、Sost干预后细胞增殖和提高ALP活性,上调沉默DKK1、Sost腺病毒转染细胞CTGF、OPG、OPN的表达。     

Bcl2及Bak1重组表达腺病毒对MG63细胞的影响

目的研究Bcl2、Bak1重组表达腺病毒载体单独或共转染对MG63细胞活性及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响。方法收集对数期MG63细胞,分为4组:A组:空载腺病毒干预组;B组:Bcl2重组表达腺病毒转染组;C组:Bak1重组表达腺病毒转染组;D组:Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染组。A组给予空载腺病毒转染,B、C组分别给予Bcl2重组表达腺病毒、Bak1重组表达腺病毒转染,D组给予Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染,MTT法检测细胞活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性检测试剂盒检测ALP活性,流式细胞仪检测钙离子浓度,Western Blot检测CTGF、Runx2、OPN、TNF-α的表达。结果与A组相比,B组细胞活性、ALP活性升高,钙离子浓度降低,CTGF、OPN、Runx2蛋白相对表达量均升高,TNF-α表达量则降低,差异有统计学意义(P0.05);C组细胞活性、ALP活性降低,钙离子浓度升高,各蛋白相对表达趋势与B组相反,差异有统计学意义(P0.05);D组细胞活性、ALP活性、钙离子浓度升高,CTGF、Runx2相对表达量升高,OPN、TNF-α相对表达量降低,但差异均无统计学意义(P0.05)。(2)B组、C组、D组各检测指标组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 Bcl2重组表达腺病毒载体转染MG63细胞可增强细胞活性及钙化能力,促进骨形成。     

Bcl2促进UMR-106细胞BMP-2、OPG表达及补肾健脾活血方对其影响

目的基于构建Bcl2沉默和过表达腺病毒观察Bcl2对成骨细胞骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)蛋白的调节作用及补肾健脾活血方对其影响。方法将培养的UMR-106细胞分为空载腺病毒组(沉默Bcl2空载腺病毒NC-bcl2,过表达Bcl2空载腺病毒WT-bcl2)、Bcl2腺病毒组(沉默Bcl2腺病毒sh-bcl2,过表达Bcl2腺病毒Ad-bcl2),空载腺病毒+空白血清组(NC-bcl2,WT-bcl2)、空载腺病毒+补肾健脾活血方含药血清组(NC-bcl2+ME,WT-bcl2+ME)、腺病毒+空白血清组(sh-bcl2,Ad-bcl2)、腺病毒+补肾健脾活血方血清组(sh-bcl2+ME,Ad-bcl2+ME),用RT-q PCR检测Bcl2、OPG mRNA的变化、应用免疫印迹(Western Blot)检测Bcl2、OPG、BMP-2的变化。结果 (1)荧光倒置显微镜观察包装腺病毒转染UMR-106细胞;(2)在正常培养基中,与NC-bcl2比较,sh-bcl2可以降低Bcl2、OPG、BMP-2蛋白的表达(P均0.05),与WT-bcl2比较,Ad-bcl2可以提高Bcl2、OPG、BMP-2蛋白的表达(P均0.05);(3)与NC-bcl2比较,RTq PCR显示sh-bcl2可以降低Bcl2 mRNA的表达,但OPG mRNA无统计学意义;(4)在大鼠血清干预中,与空载腺病毒比较,补肾健脾活血方含药血清均可以增加BMP-2、OPG蛋白表达(P均0.05);在sh-bcl2干预的细胞中,补肾健脾活血方含药血清提高BMP-2、OPG蛋白的表达(P均0.05);在Ad-bcl2干预的细胞中,中药干预后,BMP-2、OPG未见明显变化。结论 Bcl2可以影响BMP-2、OPG蛋白的表达,补肾健脾活血方可能通过作用于Bcl2影响成骨细胞成骨相关蛋白的表达。     

基于Wnt信号通路研究骨康方对过表达DKK1大鼠骨形成影响

目的利用腺病毒过表达技术研究Wnt信号通路抑制因子Dickkopf1(DKK1)在大鼠骨形成中的作用并观察骨康方(补肾健脾活血方)对过表达DKK1转染大鼠骨形成的影响作用。方法选取成年SD大鼠18只,利用过表达DKK1(Ad-DKK1)腺病毒转染其中6只大鼠,空载腺病毒(Ad-EV)转染另外6只大鼠,用生理盐水对剩余的6只大鼠进行注射并设为对照组(NC)。转染成功后,每组随机选3只给予骨康方干预,另外3只给予等体积生理盐水,观察大鼠骨密度、Wnt信号通路相关因子DKK1,LRP6,β-catenin,APC,RUNX2,OPG表达量的变化。结果腺病毒成功转染大鼠,Ad-DKK1转染组DKK1表达量明显高于Ad-EV组及NC组,Ad-DKK1组骨密度低于Ad-EV组及NC组(P0.05);②中药干预后,Ad-DKK1组、Ad-EV组、NC组大鼠骨密度升高,Wnt信号通路抑制因子DKK1、APC表达量降低,Wnt信号通路成骨相关因子LRP6,β-catenin, RUNX2,OPG表达量升高(P0.05)。结论①过表达DKK1可导致大鼠股骨骨密度降低;②骨康方干预后,大鼠股骨骨密度升高,LRP6,β-catenin, RUNX2,OPG表达量增加, DKK1、APC表达量降低。     

利塞膦酸钠对人成骨样细胞MG63 OPG及TNFα表达的影响

目的研究利塞膦酸钠对人成骨样细胞MG 63护骨素（OPG）及肿瘤坏死因子α（TNFα）表达的影响，以阐明利塞膦酸钠发挥骨保护作用的机制。方法以不同浓度（10^-10mol／L；10^-9mol／L；10^-8mol／L；10^-7mol／L）的利塞膦酸钠干预MG 63细胞72h；ELISA法测定细胞条件培养液中OPG及TNFα的含量。结果利塞膦酸钠可下词MG 63细胞TNFα的表达；上调OPG的表达；并提高碱性磷酸酶（ALP）活性。结论利塞膦酸钠可通过调节成骨样细胞MG 63 OPG、TNFα的表达，从而发挥其抗骨吸收的作用．     

hsa-miR-655靶向CLCF1基因对人成骨肉瘤MG63 细胞OPG/RANKL系统表达的影响

目的探讨hsa-miR-655通过靶向调控心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因表达,对人成骨肉MG63细胞系增殖、护骨素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响。方法通过hsa-miR-655慢病毒转染MG63细胞进行功能获得实验。实验分阴性对照组(NC组)和hsa-miR-655过表达组(OE组),荧光显微镜和流式细胞术(flow cytometry analysis,FCM)评估转染效率,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖能力,FCM检测细胞周期分布,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-miR-655、CLCF1、OPG和RANKL mRNA的水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测CLCF1、OPG及RANKL蛋白的变化。结果荧光显微镜和FCM显示对照组和miR-655过表达组感染效率为80%以上;qRT-PCR结果显示,相对于对照组,过表达组MG63细胞hsa-miR-655表达上调,差异有统计学意义(P=0.0004);CLCF1 mRNA水平未见明显变化(P=0.0986);过表达组OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上调,差异具有统计学意义(P0.05);Western blot结果显示,过表达组CLCF1蛋白水平表达下调(P=0.0053);与对照组比较,过表达组OPG(P=0.0021)、RANKL(P=0.0002)蛋白均上调,而OPG/RANKL比值却降低(P=0.0078),差异具有统计学意义(P0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示,miR-655过表达后抑制MG63细胞增殖;FCM检测细胞周期结果显示,miR-655过表达后MG63细胞G0/G1期细胞比例增加,S期减少,差异具有统计学意义(P0.05)。结论hsa-miR-655通过负调控CLCF1基因的表达,抑制MG63细胞的增殖,下调OPG/RANKL的比值。     

葡萄糖、雌二醇对MG63细胞株TRAIL，OPG，OPGL mRNA表达的影响

目的 观察在不同浓度葡萄糖、雌二醇环境下人成骨肉瘤MG63细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其护骨素(OPG)、护骨素配体(OPGL)的表达,探讨绝经后糖尿病女性骨质疏松症的发病机制.方法 用不同浓度葡萄糖(5.5、16.7、33.3 mmol/L)和17β-E2分别刺激培养的MG63细胞24 h,RT-PCR法检测TRAIL、OPG、OPGL mRNA的表达.结果 葡萄糖对MG63细胞中TRAIL、OPGLmRNA的表达,均按照对照组、5.5 mmol/L组、16.7 mmol/L组、33.3 mmol/L组顺序递增(P＜0.05),OPGmRNA的表达按照此顺序递减(P＜0.05).33.3 mmol/L组TRAIL mRNA的水平明显高于对照组[(1.004±0.070)vs(0.740±0.023),P＜0.05],而17β-E2可增加OPG mRNA的表达,减少TRAIL、OPGLmRNA的表达.结论 高糖环境可能导致成骨细胞中TRAIL和OPGL表达增多,OPG的表达减少,从而导致骨质疏松.而雌二醇对葡萄糖环境下的MG63细胞中上述因子的表达可产生一定的对抗效应.这可能是绝经后糖尿病女性骨质疏松症患者雌激素替代治疗的依据之一.     

RNA干扰沉默CTGF表达对人成骨样MG63细胞I型胶原、ALP mRNA表达的影响

目的本研究将利用RNA干扰技术,阻断CTGF在人成骨样MG63细胞中的表达,观察CTGF降表达后对人成骨样MG63细胞Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶 mRNA表达的影响。方法针对人CTGF mRNA440、875、910位点设计、合成3对21核苷酸siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）;在阳离子脂质体介导下转染人成骨样MG63细胞,以空白及非特异性siRNA作为对照,转染48h后收集细胞。采用Northern杂交研究CTGF mRNA表达水平的改变,半定量RT-PCR观察Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达的改变,Western blotting观察CTGF蛋白表达的变化。MTT法测定RNA干扰后人成骨样MG63细胞活力的改变。结果空白对照组相比,转染siRNA1、siRNA3的MG63细胞CTGF mRNA和蛋白表达明显下调,转染siRNA2及非特异性siRNA的MG63细胞CTGF的表达无明显变化。转染siRNA1、siRNA3的MG63细胞Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达明显下调,细胞活力明显降低。结论针对人CTGF mRNA设计、合成的siRNA可有效抑制人成骨样MG63细胞CTGF的转录和表达;CTGF表达下调可抑制MG63细胞表型标志物Ⅰ型胶原、ALP mRNA的表达,降低MG63细胞活力,这说明CTGF可能在维持骨代谢平衡中具有重要的作用。     

热疗联合特异性沉默趋化因子受体4对骨肉瘤增殖和侵袭的影响

目的观察热疗联合特异性siRNA沉默趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)对骨肉瘤增殖和侵袭的影响。方法培养人骨肉瘤细胞株MG 63至对数生长期,接种于6孔板中,分为三组,空白组细胞不进行任何处理常规培养,control siRNA组以control siRNA转染细胞,CXCR4 siRNA组以CXCR4 siRNA转染细胞,采用Western blot检测各组CXCR4的表达变化,评估CXCR4 siRNA转染效能。细胞及体内实验设置control siRNA组(对照组)、热疗联合CXCR4 siRNA组(联合组)、CXCR4 siRNA组(沉默组)和热疗组,以CXCR4 siRNA转染沉默组和联合组的细胞,control siRNA转染对照组细胞,热疗组和联合组进行热疗处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)和Western blot检测各组细胞CXCR4的表达变化。CCK 8法和Transwell侵袭实验检测转染后MG 63细胞的增殖能力和侵袭能力变化。流式细胞技术检测转染后MG 63细胞的周期变化。体外裸鼠成瘤实验和肿瘤生长曲线观察转染后MG 63细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长情况。结果CXCR4 siRNA可以有效沉默MG 63细胞中CXCR4蛋白的表达。热疗联合CXCR4 siRNA有效沉默MG 63细胞中CXCR4的表达并能抑制MG 63细胞增殖和侵袭,阻滞细胞周期于G0/G1期(P均<0.05)。体内实验结果显示,从第14天起,联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合组的瘤重也低于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论热疗联合特异性沉默CXCR4抑制骨肉瘤的增殖和侵袭,可作为一个有效的骨肉瘤基因治疗新方法。     

TiO2喷砂酸蚀处理对人成骨细胞骨保护素和骨保护素配体mRNA表达影响的研究

[目的]探讨纯钛钛片经过喷砂及喷砂酸蚀处理后对人成骨细胞系MG63细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)mRNA表达水平的影响.[方法]纯钛钛片表面分别进行机械打磨、喷砂及喷砂酸蚀处理,将人成骨细胞系MG63细胞接种于钛片表面,采用荧光实时定量PCR法检测OPG、OPGL mRNA表达水平.[结果]MG63细胞在经过喷砂及喷砂酸蚀处理后的钛片上培养后其OPG mRNA水平增高,与机械打磨组相比有统计学意义(P＜0.05),而OPGL mRNA表达水平在各组之间没有明显差异(P＞0.05).[结论]经过喷砂及喷砂酸蚀处理的钛片均可促进人成骨细胞表达OPG,从而调节成骨细胞与破骨细胞之间的平衡,促进骨质重建.     

成纤维细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化腱细胞的研究

目的检测腺病毒携带成纤维细胞生长因子2(FGF2)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)后FGF2的表达情况并探索其对细胞增殖、分化及韧带相关特异性细胞外基质表达的影响。方法将腺病毒进行细胞转染,转染后将细胞分为空白组(正常培养)、对照组[重组腺病毒(Ad.e GFP)转染]和试验组[空病毒(Ad.b FGF2-e GFP)转染]。采用形态学、流式细胞仪观察、实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)、蛋白质印迹法(WB)检测转染后BMSCs中FGF2的表达。并采用MTT法检测过表达FGF2后BMSCs增殖的变化。最后用q RT-PCR及WB检测BMSCs中带韧带相关特异性细胞外基质基因的表达水平。结果试验组转染后FGF2表达最高,与空白组及对照组相比,差异有统计学意义(t=19.648,P0.001;t=17.506,P0.001);MTT结果示:在转染后第3天,与空白组及对照组相比,试验组可明显促进BMSCs的增殖,差异有统计学意义(t=3.401,P=0.015;t=3.234,P=0.018);过表达FGF2基因可明显上调BMSCs中特异性细胞外基质基因Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)、波形蛋白(Vimentin)及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结论 FGF2能促进BMSCs的增殖并向腱细胞分化,腺病毒携带FGF2转染BMSCs有望成为组织工程韧带的种子细胞。     

TGF-β_1诱导的黄韧带细胞增生效应及其对结缔组织生长因子的表达影响

目的探讨TGF-β_1诱导的黄韧带细胞增生效应及其对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响。方法取腰椎椎间盘突出髓核摘除术中的黄韧带组织,采用胶原酶预消化组织块培养法分离培养黄韧带细胞。采用形态学观察、免疫荧光染色观察、MTT法检测细胞增殖情况进行细胞鉴定。取第3代黄韧带细胞分为5组,A、B、C、D组分别于细胞中加入3 ng/mL TGF-β_1、50 ng/mL CTGF、3 ng/mL TGF-β_1+CTGF中和抗体(1∶500)封闭、50 ng/mL CTGF+CTGF中和抗体(1∶500)封闭,E组加入无血清DMEM作为对照。采用MTT法检测TGF-β_1和CTGF对黄韧带细胞增殖的影响,Western blot检测CTGF蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF基因表达。结果培养的黄韧带细胞形态呈多样性,均表现出典型的黄韧带成纤维细胞表型;所有细胞均表达Ⅰ型胶原蛋白及波形蛋白,部分细胞表达Ⅲ型胶原蛋白;MTT鉴定示随培养时间延长,各代细胞吸光度(A)值均逐渐增加,同代细胞各时间点间A值比较差异均有统计学意义(P0.05),相同时间点各代细胞间A值比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养24 h MTT法检测示A、B组细胞A值显著高于E组(P0.05);而加入CTGF中和抗体后,C、D组A值降低,但仍高于E组(P0.05);A、C组间及B、D组间比较差异亦有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示A、B组CTGF蛋白相对表达量明显高于E组(P0.05);而加入CTGF中和抗体后,C、D组CTGF蛋白相对表达量显著降低,但仍高于E组(P0.05);A、C组间及B、D组间比较差异亦有统计学意义(P0.05)。qRT-PCR检测示,与E组比较,A组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量均显著增高(P0.05);加入CTGF中和抗体后,C组各基因表达受到抑制,mRNA相对表达量显著低于A组,但仍显著高于E组(P0.05)。B组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量显著高于E组(P0.05),但CTGF mRNA相对表达量与E组比较差异无统计学意义(P0.05);加入CTGF中和抗体后,D组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量受到抑制,低于B组,但仍显著高于E组(P0.05),CTGF mRNA相对表达量与B、E组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 TGF-β_1可促进黄韧带细胞的CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因及蛋白表达水平增加,TGF-β_1通过CTGF协同促进黄韧带细胞增生。     

ERβ通过抑制SOST表达补偿ERα部分功能促进对成骨细胞增殖分化

目的观察ERα和ERβ调控前体成骨细胞增殖和分化中的相互作用及当ERα表达降低时,ERβ的激活能否通过抑制SOST信号传递补偿ERα部分功能调控成细胞增殖。方法利用RNA干扰技术,以小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1为对象,采用随机分层设计的对照研究,将细胞随机分层设计分组为4个组,根据研究需要再将相关组再进一步分为7个亚组,进行相关干预处理。检测各组细胞周期、MTT法绘制细胞生长曲线、检测SOST、OPG和Run X2等细胞因子的表达。应用SPSS16.0进行统计分析各组间差异,显著性差异定为P0.05。结果 ERα表达正常,单独沉默ERβ的表达(D组),细胞增殖稍增加,但与空白对照组(F组)比较,没有显著性差异,P0.05。同时沉默ERα和ERβ(E组),细胞增殖明显减少,SOST基因表达反而增强,但是OPG和Run X2的表达相对于空白对照组显著减弱,与空白对照组和B组比较,有显著性差异,P0.05。沉默ERα表达而保持ERβ正常表达(B组),成骨细胞增殖能力明显减弱,SOST基因表达减弱,OPG和Run X2的表达相对于空白对照组明显减弱,和空白对照组比较差异有显著性P0.05。相反,沉默ERα表达,但应用ERβ激动剂使ERβ过表达(A组),与B组和E组比较,细胞增殖能力反而明显增强,但是SOST基因表达显著降低,OPG和Run X2的表达反而升高,有显著性差异,P0.05。在E组细胞的培养液中加入SOST抗体(G组),和E组比较,OPG和Run X2蛋白表达明显增强,两组间差异有显著性,P0.05;这一结果与A组中应用ERβ激动剂有相似作用。结论 ERβ对ERα调控成骨细胞增殖过程中起着平衡作用,当ERα正常表达或活性增高时,ERβ抵抗ERα在骨形成中的刺激作用;当ERα活性减弱或丧失后,ERβ的激活补偿ERα刺激成骨细胞的增殖和分化,并且这一过程是通过ERβ抑制SOST表达而增强成骨细胞增殖相关细胞因子OPG和Run X2等而独立发挥作用。     

淫羊藿苷对人成骨样细胞成骨分化及OPG/RANKL 表达的影响

目的探讨淫羊藿苷对人成骨样细胞(MG-63)成骨分化及OPG/RANKL表达的影响。方法用1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L 5种浓度的淫羊藿苷对MG-63进行干预,并同时进行成骨诱导,RT-PCR在第3天检测其细胞增殖基因MYC、CDK7表达量,在第6天检测成骨分化标志基因RUNX2、COL1A1及OPG、RANKL的表达量。结果对成骨分化相关基因,10 nmol、1μmol干预的MG-63 RUNX2基因表达量较1 nmol及10μmol的高(P0.05),与100 nmol及空白对照组没有明显差别(P0.05),10μmol的RUNX2蛋白表达量较其余各组更高;COL1A1的基因表达呈剂量依赖型,随浓度的增加而升高,10μmol的表达量较其余各组有明显升高(P0.05),其蛋白表达也更多;RANKL的表达量极低,且在各组之间均无明显差异(P0.05);OPG的表达在1μmol浓度时较100 nmol、10μmol明显增高(P0.05),与1 nmol、10 nmol及空白组没有统计学差异(P0.05);与细胞增殖相关的MYC的表达各组之间均没有差异(P0.05),而CDK7的表达均较空白组降低(P0.05)。结论 10μmol/L的淫羊藿苷能够明显促进MG-63细胞的成骨分化,但并不通过影响OPG/RANKL起效。     

miR-96干扰NKD2表达对骨肉瘤MG63细胞株的增殖、凋亡的影响

目的探究miR-96通过干扰裸露角质蛋白同源物2(naked cuticle homolog 2,NKD2)的表达对骨肉瘤MG63细胞株的增殖、凋亡的影响。方法回顾性分析我院2013年9月至2018年2月收集的骨肉瘤标本57例临床资料作为研究组,同时收集距肿瘤边界5 cm的癌旁组织作为对照组,其中男39例,女18例;年龄21～49岁,平均(28.16±6.73)岁。将骨肉瘤MG63细胞株分为miR-96抑制组与空白对照组,其中miR-96抑制组细胞给予miR-96抑制剂转染,空白对照组细胞不作任何处理。培养48h后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法与Western blot法检测各组人骨肉瘤MG63细胞中miR-96与NKD2蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium assay, MTT)法检测各组细胞增殖情况;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况与细胞周期分布情况。结果骨肉瘤组织中miR-96表达水平明显高于正常骨组织(P0.05);骨肉瘤组织中NKD2蛋白表达水平明显低于正常骨组织(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤细胞中miR-96表达水平明显低于空白对照组(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤细胞中NKD2表达水平明显高于空白对照组(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株经miR-96抑制剂转染48h后细胞相对吸光度明显低于空白对照组细胞(P0.05);miR-96抑制组骨肉瘤MG63细胞株细胞凋亡率明显大于空白对照组(P0.05);miR-96抑制组与空白对照组骨肉瘤MG63细胞株细胞周期情况差异明显(P0.05)。结论 miR-96在骨肉瘤组织中呈高表达,NKD2在骨肉瘤组织中呈低表达;miR-96通过抑制NKD2表达而促进骨肉瘤MG63细胞株生长,并抑制骨肉瘤MG63细胞株早期凋亡。