在体经皮微创注射TBX18构建生物起搏点

目的探讨经皮微创注射转录因子T-box 18(TBX18)对三度房室传导阻滞模型犬心率的影响。方法取两只比格犬,均植入起搏器(右室VVI起搏,45次/分)并经股静脉途径消融房室结构建三度房室传导阻滞模型。经导管(NOGA MyoStar)分别注射腺病毒-绿色荧光蛋白-TBX18(Ad-GFP-TBX18,TBX18犬)或Ad-GFP(GFP犬)至右室流出道靠近间隔处,观察14天后犬的心率变化及逸搏节律起源部位,并在荧光显微镜下观察注射部位心肌细胞荧光表达强度。结果房室结消融后两只犬均为起搏心律,频率45次/分,14天后TBX18犬心率64次/分,逸搏节律起源点位于注射部位,GFP犬心率48次/分,逸搏节律起源点远离注射部位。荧光检测显示注射部位心肌组织有绿色荧光表达。结论经皮微创注射TBX18可构建生物起搏点。     

携带TBX18的慢病毒载体转染脂肪干细胞并诱导其向起搏样细胞分化的研究

目的观察TBX18慢病毒载体在体外转染脂肪干细胞(ADSCs),能否诱导其向起搏样细胞分化。方法取40~50g SD大鼠的腹股沟脂肪,采用酶混合消化法分离培养ADSCs,光学显微镜下观察细胞形态,将细胞随机分为TBX18组、GFP组、null组,TBX18组转染携带TBX18转录因子和绿色荧光蛋白(GFP)的TBX18慢病毒,GFP组转染等量的GFP慢病毒作为空病毒对照组,null组不转染病毒作为空白对照组。一周后通过蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测三组相关转录因子TBX3、ISL1、SHOX2,缝隙连接蛋白CX45、CX43、CX30.2及心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白I(cTNI)、肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达量;通过免疫荧光技术检测TBX18组及GFP组的α-SMA蛋白的表达。病毒转染后第7、14、21、28天分别采用实时荧光定量聚合酶链式反(RT-PCR)检测TBX18组及GFP组TBX18及HCN4水平。结果 TBX18组转染ADSCs后,细胞形态发生改变,转染后4周内可通过荧光显微镜下观察到持续的荧光表达,诱导分化后,TBX18组TBX3、ISL1、SHOX2、CX45、CX30.2、cTN1、α-SMA蛋白水平明显高于GFP组及null组,而CX43蛋白表达低于null组;TBX18组免疫荧光检测到了α-SMA,而GFP组表达阴性;TBX18组TBX18及HCN4表达在慢病毒转染后4周内持续表达,明显高于GFP组(P0.05)。结论 TBX18慢病毒载体体外转染入ADSCs,能在细胞内稳定表达,且能使其向起搏样细胞分化。     

心脏起搏细胞的生成

要构建心脏起搏细胞首先需要理解起搏自动节律性,"膜钟"和"Ca2+钟"两种特征性现象负责起搏活性的调控。在过去几十年,生物起搏器取得了极大的发展,窦房结发育的关键调控因子Tbx18能直接将心肌细胞重编程为起搏样细胞。另一个关键转录因子Tbx3,具体表达在包括窦房结在内的心脏传导系统,其足以诱导心脏起搏基因表达。为了成功实现细胞治疗,生成的细胞应该具有心脏起搏细胞的所有调节机制。否则,生成的起搏细胞仅能作为基础研究的调查模型或新型抗心律失常药物的测试模型。     

TBX18腺病毒载体体外诱导乳鼠心肌细胞向起搏样细胞分化

目的观察TBX18腺病毒载体在体外转染乳鼠心肌细胞,能否诱导其向起搏样细胞分化。方法胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离培养乳鼠心肌细胞,光学显微镜下观察细胞形态,48h后用免疫荧光技术检测心肌细胞纯度。将心肌细胞随机分为实验组(TBX18组)、空病毒对照组(GFP组),转染时分别加入带TBX18转录因子和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒,带GFP的腺病毒,采用实时荧光定量聚合酶链式反应,蛋白质免疫印迹和免疫荧光技术检测各组心肌细胞HCN4mRNA和HCN4蛋白的表达。结果培养24h后,心肌细胞几乎完全贴壁,可见梭形、菱形或多边形;48h后形成网状或放射状细胞簇。α-actin检测心肌细胞纯度高达96%。TBX18组心肌细胞中HCN4mRNA和HCN4蛋白的表达水平明显高于GFP组(28 943.997±5 019.682vs 1.000±0.000,n=9,P0.05;0.631±0.025vs 0.192±0.003,n=9,P0.05);倒置荧光显微镜下观察TBX18组因表达HCN4蛋白而发出红色荧光,GFP组几乎看不到HCN4蛋白的表达。结论 TBX18腺病毒载体体外转染乳鼠心肌细胞,能使乳鼠心肌细胞向起搏样细胞分化。     

以诱导多潜能干细胞为模型构建生物起搏器的研究现状

<正>为克服传统电子起搏器的弊端,电生理医生们试图用具有生理功能的窦房结样细胞来替代电子起搏器的植入。最早的研究是在工作心肌细胞中过表达起搏相关基因HCN1-4,从而获得诱导的窦房结样细胞。随着基因工程、干细胞技术等领域的深入研究,使用细胞移植、组织工程等方法构建生物心脏起搏器有望成为今后治疗缓慢型心律失常的发展     

TBX5及其网络分子与室间隔发育的相关性

TBX5是一种转录因子,在心脏发育过程中起着重要作用.TBX5转录时点的变化将会导致室间隔发育异常,TBX5-Sall4-Nppa环的网络作用对室间隔的初发、定位有重要意义.Hey2属TBX5的下游调控基因之一,它的表达和TBX5类似,呈现出左侧梯度,故它在室间隔的发生中也有一定的作用.TBX20和TBX5同属T-box家族成员,这两者在表达的方式上呈现类似镜像的关系——一个主要表达于右室,另一个则主要表达于左室,两者的表达界点及相互作用也与室间隔的发生有关.     

超极化激活的环核苷酸门控的离子通道与生物心脏起搏器构建

超极化激活的环核苷酸门控的离子通道(HCN)是心脏的起搏基因,负责心脏起搏节律的产生和调控,该基因的遗传缺陷可以导致某些先天性的窦房结功能紊乱。近年来构建生物心脏起搏器治疗窦房结功能紊乱的研究十分活跃,涉及到基因和细胞治疗的各个方面。其中利用HCN来构建起搏器是该领域研究的热点,包括直接发送HCN治疗、间充质干细胞运送HCN治疗、工程化HCN构建生物心脏起搏器协同电子起搏器治疗三个方面的研究。     

生物起搏中的病毒载体

随着分子生物学和基因工程学的进展,为了弥补电子起搏器的不足,生物起搏器应运而生。基因治疗作为构建生物起搏器的一个切实可行的方法,指通过载体将目的基因导入宿主并使其表达,以达到治疗的目的。而病毒载体是实现基因递送的前提条件,不同病毒载体在研究应用中均存在一定的优势和局限,现就生物起搏中常用的病毒载体(慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)的结构特性以及在起搏中的应用选择做一综述。     

Nkx2-5与窦房结发育及相关转录调控因子

转录因子Nkx2-5与窦房结胚胎发育有关,同时与一系列转录调控因子如Tbx3、Shox2以及Isl1在胚胎发育过程中存在相互关系,微妙调控心脏发育分化。Nkx2-5可抑制Shox2、Tbx3和Isl1表达,Shox2和Tbx3亦可抑制Nkx2-5表达,其间关系复杂。深入了解转录因子与窦房结发育的关系对生物起搏的研究有重要的提示作用。     

窦房结自动除极相关离子通道的研究进展

在心脏传导系统中窦房结的自律性最高,为正常心脏活动的起搏点.多种离子通道参与自动除极是其高自律性的基础.近年来,研究能模拟窦房结功能的生物起搏器成为热点,而对窦房结生理起搏机制的深入了解对此有重要的意义.现就参与窦房结自动除极的离子流及相应离子通道作一简要综述.     

泛癌组织中T-box转录因子19基因水平与患者预后和肿瘤免疫微环境的相关性

目的 基于数据库数据分析泛癌组织中T-box转录因子19(TBX19)表达水平与患者预后和肿瘤免疫微环境（免疫细胞浸润、免疫检查点基因、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性）之间的关系。方法 从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中获取泛癌组织及相应正常组织中TBX19表达水平，比较不同WHO分级和TNM分期泛癌组织中TBX19表达水平，使用Cox回归分析TBX19表达水平与肿瘤患者预后的关系。基于肿瘤免疫估算数据库（TIMER2）数据，采用Pearson法分析TBX19表达水平与免疫细胞浸润丰度的相关性；在Sanger Box网站中利用TCGA数据库采用Pearson方法分析TBX19表达水平与免疫评分、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性的相关性；基于临床生信之家数据库数据，采用Spearman法分析TBX19表达水平与免疫检查点基因的相关性。结果 在膀胱尿路上皮癌、胆管癌、结肠癌（COAD）、结直肠癌（COADREAD）、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、混合肾癌、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌、肺鳞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、直肠腺癌、胃癌、胃和食管癌癌组织中TBX19高表达（P...     

窦房结功能的再生——生物起搏的电生理研究

生物起搏器有望成为治疗窦房结功能障碍的新方法。近来,国外学者通过动物实验,借助开胸、NOGA导管等技术手段,用病毒、质粒、基因突变等方法,介导外源基因在心脏局部表达,通过调节与离子通道功能的相关蛋白表达和功能状态,改变心脏起搏传导系统及心房心室肌的电生理性质,克隆出新的起搏电信号,恢复窦房结的功能。     

窦房结功能的再生——生物起搏的电生理研究

生物起搏器有望成为治疗窦房结功能障碍的新方法。近来，国外学者通过动物实验，借助开胸、NOGA导管等技术手段，用病毒、质粒、基因突变等方法，介导外源基因在心脏局部表达，通过调节与离子通道功能的相关蛋白表达和功能状态，改变心脏起搏传导系统及心房心室肌的电生理性质，克隆出新的起搏电信号，恢复窦房结的功能。     

动态心电图心率趋势分析对SSS者起搏器安装的参考价值

动态心电图(DCG)监护是评价窦房结功能(SAF)的检测方法之一，因其方便、无痛苦，易于被患者接受，近年来普遍应用。对病态窦房结综合征(SSS)患者安装起搏器适应症，目前多依靠经食管心房调搏或心内电生理检测法测定其窦房结恢复时间(SANRT)、窦房传导时间(SACT)和固有心率(IHR)等了解和评估窦房结功能的好坏以及体内起搏器     

干细胞移植治疗病态窦房结综合征

病态窦房结综合征是指窦房结及其周围组织病变和功能减退而引起一系列心律失常的综合征。传统的治疗方法是植入电子起搏器,随着分子生物学技术的发展,生物起搏为病态窦房结综合征的治疗开辟了一个全新的领域。生物起搏是指利用细胞分子生物学及其相关技术对受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代,使心脏的起搏和传导功能得以恢复。生物起搏包括基因生物起搏,细胞生物起搏和基因工程干细胞生物起搏。现就干细胞移植用于治疗病态窦房结综合征的研究取得的进展与存在问题做一综述。     

人类超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因体内转染大鼠心脏进行生物起搏的初步研究

严重的缓慢性心律失常往往需要置入电子起搏器。然而，电子起搏器自身存在一些局限性。近年来，人们开始探索采用基因治疗和细胞治疗技术构建生物起搏器。目前，构建生物起搏器的策略有多种，其中以通过增强起搏电流（pacemaker current，If）来构建生物起搏器的策略最受关注。If的分子基础是超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（hyperpolarization—activated cyclic nucleotide-gated cation channel，HCN）。本研究的目的是探讨利用人类HCN2（hHCN2）转染到大鼠心脏中进行生物起搏的可行性、安全性和时效性。     

重建心脏生物起搏器模型的体外研究

目的研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)改造的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与心室肌细胞共培养,构建具有自律性的心脏生物起搏器模型的可行性;并研究MSC中过表达连接蛋白45(CX45)对以上生物起搏器模型自律性的影响。方法 (1)体外分离培养新生大鼠的心室肌细胞,鉴定纯度及活力;并通过膜片钳方法记录心肌细胞的自发性动作电位。(2)基因克隆的方法构建包含HCN4基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4,并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒,转染大鼠的MSCs,构建成HCN4+MSCs;将仅转染有GFP基因的慢病毒颗粒的MSCs设为HCN4-MSCs。通过RT-PCR,以及荧光观察鉴定HCN4基因在MSCs中的表达;电压钳记录阳性转染细胞的起搏电流If。(3)将HCN~4+MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型,同时将HCN4-MSCs与心肌细胞共培养设为"HCN4-MSCs对照组"。为了监测生物起搏器的自律性,初步分析自律性变化的原因,计数心室肌细胞自发搏动频率、记录自发性动作电位;并通过免疫荧光标记等方法鉴定共培养的两类细胞间连接蛋白43(CX43)的表达;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸验证缝隙连接在模型中的价值。(4)为了构建CX45基因稳定表达的MSCs细胞株,首先通过基因克隆的手段构建含有CX45基因的表达质粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7,通过脂质体2000的介导将pDsRED2-N1-RFP/Gja7转染MSCs;G418筛选获得稳定转染的细胞株CX45+MSCs;同时将pDsRED2-N1-RFP空质粒转染的MSCs设为CX45-MSCs。为了鉴定MSCs中CX45基因的转录,进行了RT-PCR试验;CX43与CX45单克隆抗体免疫双标MSCs,鉴定CX45~+MSCs中连接蛋白类型的变化。(5)将CX45~+MSCs作为生物起搏的载体细胞,转染HCN4基因,构建HCN4~+CX45+MSCs;将HCN4~+CX45~+MSCs与乳鼠心室肌细胞共培养重新构建心脏生物起搏器;同时将CX45-MSCs中转染HCN4基因,与心肌细胞共培养后构建的生物起搏器模型设为"HCN4~+CX4     

超极化激活的环核苷酸门控的离子通道与生物心脏起搏器构建

超极化激活的环核苷酸门控的离子通道（HCN）是心脏的起搏基因，负责心脏起搏节律的产生和调控，该基因的遗传缺陷可以导致某些先天性的窦房结功能紊乱。近年来构建生物心脏起搏器治疗窦房结功能紊乱的研究十分活跃，涉及到基因和细胞治疗的各个方面。其中利用HCN来构建起搏器是该领域研究的热点，包括直接发送HCN治疗、间充质干细胞运送HCN治疗、工程化HCN构建生物心脏起搏器协同电子起搏器治疗三个方面的研究。     

心房颤动患者射频消融术影响TBX5和NKx2.5及其调控微小RNA

目的探讨心房颤动(房颤)患者射频消融术对转录因子TBX5和NKx2.5及其调控微小RNA(miRNA)的影响作用,寻找可能的miRNA调控干预靶点。方法选择行房颤射频消融术患者30例(房颤组),其中阵发性、持续性和永久性房颤各10例,健康体检者10例(对照组)。射频消融术前和术后3个月分别取外周血,使用miRNA芯片进行全基因组miRNA表达谱微阵列分析,实时PCR对调控结构蛋白的主要miRNA表达差异结果进行验证,通过mirbase、miranda、targetscan数据库进行靶基因分析。结果与对照组比较,房颤组术前转录因子TBX5和NKx2.5mRNA表达明显异常;主要参与调控TBX5的miRNA共有hsa-miR-892a等8种,hsa-miR-186-5p等4种主要miRNA术前表达下调,术后显著上调(P<0.05)。与对照组比较,房颤组参与调控NKx2.5的miRNA有hsa-miR-3149等3种,手术前后均有显著性改变(P<0.05)。结论房颤射频消融术逆转了调控转录因子TBX5、NKx2.5的主要miRNA异常,为房颤射频消融术后窦性心律的恢复和维持奠定了基础。这些miRNA有可能成为未来房颤干预的靶点。     

转录抑制基因TBX2在甲状腺癌中的表达及其临床病理意义

目的 检测甲状腺癌组织中TBX2的表达,探讨其表达的临床意义.方法 应用免疫组织化学技术,检测正常甲状腺、甲状腺腺瘤及甲状腺癌组织中TBX2的表达.结果 TBX2在甲状腺癌组织中的阳性表达明显高于其在正常甲状腺及甲状腺腺瘤组织中的阳性表达(P＜0.05);TBX2在甲状腺癌组织中的阳性表达强度与甲状腺癌的组织学分型及分化程度有关(P＜0.05).结论 TBX2在甲状腺癌的发生、发展中起重要作用,检测甲状腺癌中TBX2的表达,可为临床甲状腺癌的诊断、治疗方案的选择及预后评估提供参考指标,同时也为甲状腺癌的治疗提供新靶点.