过氧化物酶体增殖激活物受体γ配体诱导肾癌细胞的凋亡

目的 观察过氧化物酶体增殖激活物受体γ(PPARγ)配体对肾癌细胞凋亡的影响.方法 通过ELISA方法 观察0～100 μmol/L浓度的吡格列酮和曲格列酮(TZDs)对肾癌细胞786-0、A498及正常肾细胞HK-2、HMCC凋亡的影响,Heochst 33342荧光染色、DNA片段化分析检测70.00 μmol/L吡格列酮或80.00 μmol/L曲格列酮处理后肾癌细胞的凋亡,Western blot观察TZDs处理后肾癌细胞凋亡调控蛋白bcl-2/bax的表达变化及Caspase-3活性的改变.结果 超过50.00 μmol/L的TZDs可诱导肾癌细胞出现凋亡,LC_(50)值分别为65.11 μmol/L(曲格列酮/786-O)、67.73 μmol/L(吡格列酮J/786.0)、63.91 μmol/L(曲格列酮/A498)和78.12 μmol/L(吡格列酮/A498),但对正常肾细胞没有影响.荧光染色显示80.00 μmol/L的吡格列酮及70.00 μmol/L的曲格列酮处理后肾癌细胞明显凋亡,伴随bcl-2蛋白的表达水平降低和bax蛋白的增加,Caspase-3的活性明显增强,在48 h可达到基础值的3.5-4.5倍.结论 激活PPARγ可以诱导肾癌细胞的凋亡,PPARγ有可能成为肾细胞癌新的治疗靶点.     

二甲双胍调控PI3K/Akt/mTOR通路减轻糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

目的探讨二甲双胍(Met)调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路对糖皮质激素地塞米松(Dex)诱导的成骨细胞凋亡的影响。方法将体外培养的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分为对照组(正常培养)、Dex组(以Dex处理)、Met组(以Dex和Met共同处理)、Met+IGF-1组(以Dex、Met和PI3K/Akt/m TOR通路活化剂IGF-1共同处理)、Met+NVP-BEZ235组(以Dex、Met和PI3K/Akt/m TOR通路抑制剂NVP-BEZ235共同处理),采用免疫印迹法(WB)检测MC3T3-E1细胞中PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt、m TOR和p-mTOR蛋白表达水平,通过噻唑蓝(MTT)法检测MC3T3-E1细胞存活率、流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡率、实时荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞中Bcl-2和Bax mRNA表达水平、Caspase-3活性测定试剂盒检测MC3T3-E1细胞Caspase-3活性、JC-1探针检测MC3T3-E1细胞线粒体膜电位变化。结果与对照组比较,Dex组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平和细胞存活率、Bcl-2 mRNA表达水平以及线粒体膜电位均明显降低,而细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平和Caspase-3活性均明显升高(P0.05);与Dex组比较,Met组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平和细胞存活率、Bcl-2 mRNA表达水平以及线粒体膜电位均明显升高,而细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平、Caspase-3活性明显降低(P0.05);给予IGF-1作用后Met对MC3T3-E1细胞的作用效果明显增强,而给予NVP-BEZ235作用后Met对MC3T3-E1细胞的作用效果明显减弱(P0.05)。结论 Met可通过激活PI3K/Akt/m TOR通路抑制线粒体凋亡途径,减轻糖皮质激素Dex诱导的成骨细胞凋亡。     

吡格列酮对正常MC3T3-E1成骨细胞增殖、凋亡以及功能蛋白表达的影响

目的探讨不同浓度吡格列酮(PIO)对正常糖浓度培养下MC3T3-E1小鼠早期成骨细胞增殖、凋亡及功能蛋白分泌表达的影响。方法体外培养MC3T3-E1细胞,分为正常对照组、不同浓度PIO干预组(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L),分别干预24、48 h。CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RIA法和ELISA法分别检测相关功能蛋白骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP),RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、成骨因子runt相关基因2(Runx2)及骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA表达水平。结果 (1)与对照组比较,MC3T3-E1细胞增殖能力在5μmol/L PIO干预组增加显著(P<0.05)、在PIO大于5μmol/L～10μmol/L干预组则降低(P<0.05)。干预时间由24 h延长至48 h,各组细胞增殖能力呈不同程度增加,但在20、40μmol/L PIO干预的两组增加无统计学差别。(2)对照组及各PIO浓度干预干预24 h,细胞凋亡率分别为:1.97%、0.43%、13.0%、48.30%、81.00%;(3)随着PIO浓度从0～40μmol/L范围内的增加,MC3T3-E1细胞的PPARγmRNA表达水平呈增加趋势(P<0.05);Runx2 mRNA表达量在5μmol/L PIO浓度组时较对照组增加,在剂量较高时(PIO≥10μmol/L)随浓度升高表达下降。(4)细胞功能蛋白ALP、OCN的分泌及BMP-2的表达在5μmol/L PIO浓度组时最高,PIO≥10μmol/L时,上述蛋白量逐渐下降(P<0.05);随干预时间从24～48 h延长,各PIO浓度干预组ALP以及BMP-2量增加(P<0.05),而OCN无显著改变(P>0.05)。结论 PIO对正常糖浓度培养的MC3T3-E1细胞具有双向作用:低浓度促进细胞增殖,高浓度则促进凋亡。PPARγ适当激活可促使成骨细胞通过Runx2增加功能蛋白的合成;过度激活,则表现出细胞毒性。     

白桦脂醇拮抗地塞米松诱导成骨细胞内脂质积聚影响细胞凋亡的实验研究

目的观察白桦脂醇和地塞米松共同作用于小鼠MC3T3-E1细胞后,内源性脂质蓄积与细胞凋亡中的关系。方法以MC3T3-E1细胞为研究对象,采用白桦脂醇和地塞米松共同作用于MC3T3-E1细胞,测定细胞内甘油三酯含量;NileRed荧光染色观察脂质蓄积情况;流式细胞技术测定成骨细胞凋亡率;ELISA法检测Caspase-3酶活性;采用Spearman等级相关进行脂质含量与成骨细胞凋亡相关性分析。结果白桦脂醇和地塞米松共同作用于小鼠MC3T3-E1细胞后,0.5μmol/L地塞米松(B组)与1.0μmol/L地塞米松组(C组)较空白组(A组),细胞凋亡率、Caspase-3酶活性均明显增高(P0.05),细胞内甘油三酯含量明显增加。2.0μg/ml白桦脂醇作用细胞后,地塞米松所致的细胞凋亡率上升与Caspase-3酶活性升高受到明显抑制,同时细胞内的甘油三酯蓄积降低。Spearman等级相关分析表明地塞米松诱导后的成骨细胞内脂质含量与细胞凋亡率呈正相关,r=0.412,P0.05。结论白桦脂醇可显著减轻地塞米松诱导的成骨细胞内脂质蓄积,降低细胞凋亡率;提示地塞米松所致细胞凋亡至少部分与细胞内脂质蓄积有关。     

连翘苷调节相关信号通路对地塞米松诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨连翘苷(phillyrin, PHN)调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对地塞米松(dexamethasone, DEX)诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组(NOR组)、DEX组(10μmol/L DEX处理MC3T3-E1细胞)、L-PHN组(5μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、M-PHN组(10μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、H-PHN组(20μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、ZSTK474组(用20μmol/L PHN和2μmol/L的PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂ZSTK474处理MC3T3-E1细胞);MTT法检测细胞毒性和细胞活力;流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡;透射电子显微镜(TEM)观察自噬小体;Western blot法检测MC3T3-E1细胞中自噬、凋亡和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达;ALP活性及ALP染色检测MC3T3-E1细胞分化能力。结果 0～80μmol/L PHN对...     

莪术醇对胃癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的 观察莪术醇对胃癌细胞株BGC823细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养BGC823细胞,分别加入12.5、25、50、100 mg/L莪术醇培养液,对照组加入10 ml/L无水乙醇培养液,分别孵育24 h和48 h,采用MTT法分析增殖率;应用流式细胞仪检测各浓度莪术醇处理BGC823细胞48 h的凋亡率及细胞周期的分布;分光光度法检测Caspase-3活性;100 mg/L莪术醇孵育BGC823细胞48 h后,用RT-PCR和Western blot法检测Caspase-3、Bcl-2、Bax和Survivin mRNA和蛋白的表达水平.结果 莪术醇抑制BGC823细胞增殖,并且随浓度的增加和时间的延长而加强;不同浓度莪术醇处理BGC823细胞,均使处于G0/G1期的细胞显著增加,S期细胞明显减少(P＜0.05);细胞凋亡率随莪术醇浓度增加而升高(P＜0.05);Caspase-3活性呈浓度依赖性增加(P＜0.05);100 mg/L莪术醇孵育BGC823细胞48 h后,Caspase-3、Bax表达均显著升高(P＜0.05),Survivin、Bcl-2表达均显著下降(P＜0.05),Bcl-2/Bax比值显著降低(P＜0.05).结论 莪术醇对胃癌BGC823细胞生长具有抑制作用,阻滞细胞周期于G0/G1期,并促进其凋亡.其作用与增强Caspase-3的活性,上调Caspase-3、Bax表达,下调Survivin、Bcl-2表达及降低Bcl-2/Bax比值有关.     

二苯乙烯苷对H2O2诱导的MC3T3-E1凋亡的保护作用及机制研究

目的研究二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)对氧化应激导致的成骨前体细胞MC3T3-E1凋亡的保护作用,并初步探讨相关机制。方法不同浓度TSG预处理MC3T3-E1 24 h后,300μmol/L H_2O_2作用24 h。实验分组:①空白对照组;②单纯H_2O_2处理组;③H_2O_2+TSG 0.1μmol/L处理组;④H_2O_2+TSG 1μmol/L处理组;⑤H_2O_2+TSG 10μmol/L处理组;⑥阳性对照抗氧化剂NAC 1 mmol/L处理组,通过MTT法、Hoechst33258染色来评价细胞凋亡情况及TSG对氧化损伤的保护作用;利用荧光酶标仪和MDA检测试剂盒来检测细胞中ROS及MDA的水平来评价细胞的氧化应激状态;Western-blot和RT-PCR分别从蛋白水平和基因水平评价Bcl-2和Bax的表达水平。结果单纯H_2O_2处理可以导致细胞死亡,显微镜下可见许多细胞死亡,脱壁;Hoechst33258染色可见有较多的细胞出现核固缩、核浓集现象;不同浓度的TSG预处理后,细胞凋亡现象得到改善。单独H_2O_2作用可以导致成骨前体细胞出现较大程度的凋亡,不同浓度TSG预处理后,细胞凋亡率有所降低;单纯H_2O_2作用可以导致细胞水平的ROS和脂质氧化产物MDA产生增加,TSG(1～10μmol/L)可以显著降低细胞水平ROS和MDA水平(P0.05),改善细胞的氧化应激状态;Western-blotting和实时定量RT-PCR结果 TSG预处理可以减少H_2O_2处理后,促凋亡蛋白Bax的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论氧化应激可以导致成骨前体细胞MC3T3-E1凋亡增加,TSG可以通过降低氧化应激水平。其机理可能是TSG通过促凋亡蛋白Bax的表达及增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达起到保护作用。     

Bcl-2过度表达对大鼠成骨细胞Bax、Caspase-3表达的影响

目的：探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对大鼠成骨细胞Bax蛋白以及活性Caspase-3表达的影响。方法：将含有Bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染大鼠成骨细胞使之过表达，用免疫组化ABC法检测Bax、Caspase-3活性蛋白表达变化。结果：转染筛选后的阳性克隆细胞表现为Bcl-2表达显著增强。同时Bax蛋白表达下降接近显著性差异，活性Caspase-3表达无明显变化。结论：Bcl-2过度表达对活性Caspase-3表达无影响，但对Bax蛋白表达起下调作用，提示Bcl-2家族成员之间可以相互影响。     

核转录因子-kB圈套寡核苷酸对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的 观察核转录因子-kB(nuclear factor-kappa B,NF-kB)圈套寡核苷酸抑制NF-kB活性后,肝癌HepG2细胞凋亡情况及其对环格列酮敏感性的变化.方法 将NF-kB圈套寡核苷酸转染肝癌HepG2细胞,检测NF-kB活性以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Fas的变化.以100 umol/L的环格列酮处理转染和末转染的细胞1-4 d,观察肝癌HepG2细胞的生长曲线和细胞周期分布情况.结果 转染后的肝癌HepG2细胞NF-kB活性明显下降,Bcl-2表达减少和Fas表达增加,并且环格列酮抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用增强,更多的细胞被阻滞于C1/G0期.结论 NF-kB圈套寡核苷酸可促进肝癌HepG2细胞的凋亡,增加肝癌HepG2细胞对环格列酮的敏感性,可能与NF-kB圈套寡核苷酸通过下调NF-kB的活性使凋亡蛋白Fas表达增加和凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减少有关.     

内质网应激介导吡格列酮在趋化素诱导成骨细胞代谢过程中的作用机制

目的 观察吡格列酮（Pioglitazone）对趋化素诱导成骨细胞代谢过程中的影响,探讨吡格列酮改善成骨细胞凋亡的信号转导机制。方法 将成骨细胞随机分组,选取适宜浓度的趋化素（Chemerin）进行诱导后,加入吡格列酮,观察成骨细胞活力变化。ELISA 法检测细胞趋化蛋白1（MCP-1）、E选择素（E-selection）的的影响,采用Western blot法检测成骨细胞黏附分子1（ICAM-1）、需肌醇跨膜激酶/核酸内切酶1(inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease 1,IRE1)、葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein 78,GRP78）的表达变化,探究内质网应激反应在此过程中作用。结果 MTT法检测提示加入Pioglitazone后对成骨细胞活力未见明显影响;与对照组相比,成骨细胞ICAM-1、MCP-1、E-selection、IRE1、GRP78、在Chemerin组的指标较高(P<0.05）,而 Pioglitazone呈浓度依赖性地抑制Chemerin所诱导的上述效应,差异具有统计学意义(P<0.05),当吡格列酮浓度为20μmol/L时效果最显著。结论 内质网应激可能参与趋化素诱导成骨细胞代谢中的细胞凋亡过程,吡格列酮可抑制趋化素的作用,对成骨细胞具有保护功能,其机制可能与抑制内质网应激反应相关。