α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的 探讨α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞增殖、分化的影响。方法 采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为空白对照组、雌二醇阳性对照组、低浓度α-ZAL组、中浓度α-ZAL组,高浓度α-ZAL组。镜下每天观察细胞形态变化,碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞纯度,MTT实验测定细胞增殖活性绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法(ELISΑ)测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2( Bone morphogenetic protein-2,BMP-2),运用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测护钙素（Osteoprotegerin,OPG）和NF-KB受体活化配体（Receptor actiator of nuclear factor-KB ligand, RANKL）的蛋白水平表达变化。结果 不同浓度的α-玉米赤霉醇可显著的促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,增加细胞活性（P<0.05）,明显提高小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化后ALP和BMP-2的表达（P<0.05）,并且显著的上调了成骨细胞内OPG/ RANKL的表达率（P<0.05）。结论 不同浓度的α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,并且通过上调OPG/ RANKL的表达率抑制成骨细胞细胞向破骨细胞分化,有望成为临床骨折疏松症治疗的激素替代药物。     

异鼠李素激活p38信号促进鼠间充质干细胞成骨分化

目的 探究异鼠李素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响.方法 3周龄C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞在成骨诱导液下诱导成骨分化.细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度的异鼠李素对成骨细胞毒性影响并行t检验以分析最低有效浓度.碱性磷酸酶(ALP)及茜素红染色观察有效浓度的异鼠李素对骨髓间充质干细胞成骨分化及矿化的影响....     

包裹骨形态发生蛋白-2基因转染干细胞的微囊化方法和蛋白释放效应

目的观察转基因骨髓间充质干细胞的微囊化包裹方法和骨形态发生蛋白-2(BMP- 2)释放效应。方法利用高压微电场制备由海藻酸纳和多聚赖胺酸组成的微囊(细胞浓度为3×10~6个/ml,海藻酸钠浓度为1.5%)包被转β-gal(报告基因)或BMP-2基因的骨髓间充质干细胞,根据X-gal染色观察细胞在微囊内的存活情况,ELISA方法检测其所释放的BMP-2蛋白量,共培养方法检测其生物学活性。结果7、14、21、28 d时微囊内转基因细胞X-gal染色均为阳性。包裹后30 d,培养液上清中仍可检测到BMP-2蛋白。转BMP-2基因微囊化细胞与未包裹骨髓间充质干细胞共培养10 d后,ALP活性定量检测结果表明,Adv-hBMP-2转染细胞组ALP活性为(52.537±1.774)U/ml,明显高于未转染细胞组的(42.336±0.857)U/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论微囊化转基因干细胞生长良好,能持续分泌BMP-2蛋白并促进干细胞向成骨细胞方向分化。     

骨碎补促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

[目的]研究骨碎补对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。[方法]40只SD大鼠随机分为4组,包括空白对照组和3个处理组,空白对照组给予生理盐水,而3个处理组分别给予高、中、低浓度骨碎补水煎液连续灌胃3个月。给药期满后,取各组动物骨髓体外培养,全骨髓贴壁法纯化培养BMSCs,第三代BMSCs作为检测细胞。CCK-8法分析不同浓度的骨碎补水煎液对BMSCs增殖的作用。采用ALP试剂盒测定BMSCs成骨诱导后ALP活性,茜素红染色观察钙化结节情况,并测定成骨细胞相关RUNX2和Osterix及OCN mRNA的表达情况,以评估骨碎补对BMSCs成骨分化的影响。[结果]CD90和CD45细胞免疫荧光显色证实所培养细胞为BMSCs。CCK-8法检测显示骨碎补能够促进BMSCs增殖,并呈剂量依赖性,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。在成骨诱导培养基中培养后,3个处理组间培养液上清ALP活性呈剂量依赖性增高,并伴有培养皿茜素红染色观察钙化结节的相应增多,与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。此外,相应的RUNX2和Osterix及OCN的表达也呈骨碎补剂量依赖性增加,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]骨碎补能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

补肾健骨方含药血清对ROBs和rBMSCs增殖、分化和矿化的影响

目的观察补肾健骨方含药血清对大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)和大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,r BMSCs)细胞活性及分化、矿化的影响。方法制备补肾健骨方含药血清,将ROBs和r BMSCs分为5%、10%、15%、20%、25%浓度含药血清组、无药血清组及传统诱导组,分别对各组ROBs和r BMSCs进行成骨诱导。MTT法检测ROBs和r BMSCs细胞的增殖情况;用试剂盒检测ROBs和r BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化结节形成。结果不同浓度含药血清组与空白无药血清组、传统诱导组相比,均不同程度地促进ROBs和r BMSCs的增殖,使ALP活性提高,增加钙化结节数量和面积。其中含药血清浓度为20%时促进ROBs增殖分化作用最佳,浓度为10%时促进r BMSCs增殖分化效果最为显著。结论不同浓度补肾健骨方含药血清均能够促进ROBs和r BMSCs的成骨增殖、分化和矿化,分别在浓度为20%和10%时最佳。     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

TG2对大鼠鼻粘膜间充质干细胞体外的影响

[目的]探讨组织型谷胺酰氨转胺酶2 (TG2)对大鼠鼻粘膜来源的间充质干细胞体外增殖以及定向成骨分化的影响。[方法]体外分离培养大鼠鼻粘膜间充质干细胞,采用MTT和免疫荧光法检测不同浓度的TG2对大鼠鼻粘膜间充质干细胞增殖能力的影响。通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色、蛋白质印迹法和免疫荧光观察TG2对大鼠鼻粘膜间充质干细胞体外成骨分化能力的影响。[结果]谷胺酰氨转胺酶2能促进鼻粘膜间充质干细胞增殖(P0.05),并能提高ALP活性(P0.05),同时增强矿化钙结节形成能力,并对成骨相关标记蛋白COL I和OCN的表达具有上调作用。[结论]谷胺酰氨转胺酶2可提高大鼠鼻粘膜来源的间充质干细胞的增殖能力以及其向成骨细胞分化的潜能。     

Wnt3 a信号分子对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化 过程中端粒酶活性的影响

目的探索Wnt3a信号分子对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响。方法采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD45,筛选并鉴定细胞。采用成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a(5 ng/mL、25 ng/mL、100 ng/mL)诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化,以碱性磷酸酶活性检测评价其成骨分化能力。通过TRAP-ELISA端粒酶活性检测法检测在不同浓度的wnt3a干预下诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中端粒酶活性的表达。结果骨髓间充质干细胞传至第3代后可获得均一性较高的细胞,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达,CD45低表达。成骨诱导培养基联合不同浓度的wnt3a诱导大鼠BMSCs 7 d后,碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测结果:与普通成骨诱导培养基相比,含有5 ng/mL及25 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基可显著增加其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05),而含有100 ng/mL wnt3a的成骨诱导培养基则明显抑制其碱性磷酸酶(ALP)活性(P0.05)。与普通成骨诱导培养基相比,联合诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,端粒酶活性的改变无明显的统计学差异。结论小剂量(5 ng/mL、25 ng/mL)的wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞成骨分化,而大剂量(100 ng/mL)的wnt3a分子则抑制其成骨分化。骨髓间充质干细胞具有较弱的端粒酶活性,成骨分化过程中其活性逐渐减弱,直至消失;wnt3a信号分子刺激并不能有效激活其端粒酶活性。     

氯化锂联合淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响

目的研究氯化锂(LiCl)与淫羊藿(ICA)苷联合应用对成骨细胞增殖、分化的影响,为LiCl与ICA联合应用提高成骨细胞矿化能力提供研究基础。方法采用酶消化法和茜素红染色法鉴定并获得大量细胞为成骨细胞,随机分为4组即空白组、ICA组(80 nmol/L), LiCl(5 nmol/L),ICA(80 nmol/L)+LiCl(5 nmol/L)组,诱导21 d后采用茜素红法及碱性磷酸酶活性测定各组成骨细胞矿化能力及活性。采用CCK-8和Western blot法测定各组对体外成骨细胞增殖活性及成骨细胞中p-GSK3β,β-catenin水平。结果倒置显微镜下观察细胞多为单核、多边形及梭形,局部有细胞密集的细胞团,茜素红染色将钙化结节染成橘红色; LiCl及ICA单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进p-GSK3β、β-catenin蛋白的表达;但是LiCl与ICA联合应用能够明显促进成骨细胞的增殖,并且在分子水平能够明显抑制p-GSK3β、β-catenin的表达,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论 LiCl与ICA联合应用可以通过wnt信号通路促进成骨细胞的增殖、分化。     

基于Hippo信号通路探讨鹿茸提取液对BMSCs成骨分化的影响

目的 观察鹿茸提取液对SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向成骨分化及Hippo信号通路的影响。方法 将3、4代BMSCs随机分为正常组、诱导组以及鹿茸组。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法分别检测6、12 d以及18 d碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性及水平;茜素红染色法检测3组BMSCs钙结节生长增殖情况;qRT-PCR法和蛋白质印迹法（Western blot）检测RUNX2及Hippo信号通路 MST1和YAP的转录表达与蛋白表达水平。结果 ELISA实验结果表明,鹿茸提取液可以提高ALP的活性,12 d鹿茸组ALP的活性达到最高,18 d鹿茸组ALP的活性显著上调（P＜0.01）;茜素红实验结果显示,鹿茸组观察到大量且密集的钙结节形成,提示鹿茸提取液可有效促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化;qRT-PCR的实验结果表明,与正常组相比,鹿茸组YAP和RUNX2 mRNA显著上调（P＜0.01）;Western blot法检测结果显示,鹿茸提取液可显著上调YAP蛋白表达水平（P＜0.01）,并且明显上调RUNX2蛋白表达水平（P＜0.05）。结论 鹿茸提取液能够影响RUNX2以及Hippo信号通路中 MST1和YAP相关蛋白进而推进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转化。